利用血紅素與環氧乙烷之共價鍵結物評估因抽煙暴露到環氧乙烷對人體之危害; Risk assessment of ethylene oxide exposure in smokers by hemoglobin protein adducts as a dosimeter
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(2) 誌 謝 哇!!終於畢業了!!兩年的辛苦，一切都值得了。這兩年的研究生 活，遭遇到的問題層出不窮，所幸有大家的鼓勵與幫忙，才讓我能順 利完成碩士論文，也讓我深深體會到一本碩士論文是無法靠一個人的 力量獨自完成的。當然，最感謝的就是吳焜裕老師、郭憲文主任的指 導，及黃太鴻老師的大力協助，當我遇到問題時，他們總是適時伸出 援手，為我指引方向，而這兩年來也經常讓他們擔心，在此要向老師 說聲謝謝。其次，也要感謝江素瑛老師、賴俊雄主任、吳芳鴦老師、 陳昭鈴老師、吳宏達老師、趙克平老師、王文忻老師、蔡詩維老師、 廖宏章老師、梁文敏老師、林茂榮老師等人平日的關心與照顧，另外 還要感謝口試委員李輝教授、林柏雄教授撥空前來指導，提供了許多 寶貴的意見及建議，使我受益匪淺。 在這艱苦的兩年生活，除了老師外，最要感謝的就是最可愛、最 善解人意的同學們，美娟、日昇、寶文、淑宜、保萱、志亮、珊湖、 麗秋、郁瑩、俊哲、俊璋、春櫻姐、文鎮哥、素蘭姐、秀卿姐、吳醫 師，不論在課業及生活方面，都給予我非常大的幫助與鼓勵，也使平 日生活增添不少歡樂。另外，阿修、如淳、銘宗、大毛、怡秋、宗文、 玉琪及職安系學弟妹們，謝謝你們不斷給予我支持與鼓勵，更要謝謝 阿修、如淳、銘宗經常犧牲自己的工作，總是讓我們優先使用電腦， 助我們完成碩士論文。另外還有一些曾經鼓勵、幫助過我的朋友們， 也藉此機會與你們說聲謝謝。 最後要感謝父母及家人，不論物質上或精神上都給予我很多支 持，讓我能無後顧之憂完成論文，願將此榮耀與你們分享。. 毓珊 2000.7 於環醫所.
(3) 摘要 環境致癌因子中抽煙佔很重要的部分。香煙中含有多種致癌物 質，其中環氧乙烷的含量約為 5μg/cig.，目前環氧乙烷已被歸類為人 體致癌物，因此由於抽煙而暴露於環氧乙烷所造成人體之致癌風險是 值得探討。 本研究的目的係建立 modified Edman degradation 方法來測量環 氧乙烷與血紅素形成之共價鍵結物(N-hydroxyethylvaline；HEV)，以 探討抽煙習慣與體內蛋白質鍵結物濃度的相關性，並由 HEV 濃度推 估暴露到環氧乙烷之劑量及致癌風險。本研究對象係來自台中捐血站 之 162 位自願者，並針對研究對象進行問卷調查收集基本資料，及血 液 收 集 ， 事 前 分 離 紅 血 球 並 萃 取 血 紅 素， 再 經 處 理 後 ， 利用 GC/MS-NCI 分析，以質荷比 348 與 352 之訊號比值來計算 HEV 之濃 度。結果顯示非抽煙組體內之 HEV 濃度為 58.3±45.6 pmol/g Hb ，抽 煙組 HEV 濃度為 205.9±151.4 pmol/g Hb，國人 HEV 含量與文獻值一 致，且抽煙與否與 HEV 濃度值達統計上顯著相關(p<0.0001)，而每天 抽 煙 支 數 及 抽 煙 年 數 皆 與 體 內 HEV 濃 度 達 統 計 上 顯 著 相 關 (p<0.0001)，針對非抽煙族群而言，二手煙暴露與體內 HEV 值沒有明 顯相關(p=0.9374)，但抽煙族群中，其二手煙暴露與否則與體內 HEV 值達統計上顯著相關(p=0.0131)。另外將 HEV 濃度值進行複迴歸分 析，發覺抽煙與否、每天抽煙支數與體內 HEV 值有顯著相關。而非 抽煙族群與抽煙族群之暴露劑量平均分別為 259.2 及 915.1 ppm. h，. 而致癌風險值平均分別為 4.15×10-5 及 1.463×10-4，兩者皆與抽煙達 統計上顯著差異(p<0.0001)。 本研究結果證實體內 HEV 可作為評估長期因抽煙暴露到環氧乙 烷之生物指標，且驗證長期抽煙會使癌症發生之危險性增加。 關鍵字：N-(2-hydroxyethyl)valine、蛋白質鍵結物、環氧乙烷、GC/MS I.
(4) ABSTRACT Tobacco smoke is considered as the most important factor in environmental carcinogenesis and contains numerous carcinogens. Among them, ethylene oxide is classified as a known human carcinogen, and there is about 5μg per cigarette. It has been of interest to study the potential cancer risk caused by ethylene oxide exposures during smoking. The objective of the study was to establish the modified Edman degradation methods to analyze ethylene oxide-induced hemoglobin adducts (N-hydroxyethylvaline, HEV), and then to investigate the factors that affect the formation of HEV in smokers and non-smokers. Results from this study would be used to estimate the accumulated internal doses and external exposures of ethylene oxide and finally to assess cancer risk. Ten ml of blood samples was collected from 162 volunteers which background informations were collected by questionnaires. Red blood cells were immediately harvested from each fresh blood sample and stored at –80oC until used for purification of hemoglobin. Approximate 100 mg of globin was dissolved in formamide and derivatized with pentafluorophenyl isothiocyanate. After cleanup, samples were analyzed using. gas. chromatograph. /. negative. chemical. ionization-mass. spectrometer (GC/NCI-MS). The amounts of HEV are 58.3±45.6 pmol/g Hb in non-smokers and 205.9±151.4 pmol/g Hb in smokers which are significantly different (p<0.0001). Our results show that the amounts of HEV are linearly correlated with number of cigarettes smoked per day (r = 0.53), years of smoking (r = 0.28), and bags of cigarettes smoked per day (r = 0.44). Cumulative external exposures are estimated to be 259.2 and 915.1 ppm⋅h of ethylene oxide in non-smokers and smokers, II.
(5) respectively. The corresponding cancer risk are 4.15×10-5 and 1.46×10-4. This study validates that HEV is a sensitive and specific biomarker to assess ethylene oxide exposures from tobacco smoke. These results also confirm that smokers will have higher cancer risk than nonsmokers due to the exposures to ethylene oxide.. Key words：N-(2-hydroxyethyl)valine, ethylene oxide, GC/MS. III.
(6) 目 錄 中文摘要 .............................................................................................. I 英文摘要 ............................................................................................. II 壹 前言 ................................................................................................1 一、 研究動機 .................................................................................1 二、 研究目的 .................................................................................2 貳 文獻探討 ........................................................................................3 一、環氧乙烷 .................................................................................3 (一) 環氧乙烷之物化性質 ..........................................................3 (二) 環氧乙烷之用途..................................................................3 (三) 環氧乙烷暴露來源..............................................................4 (四) 環氧乙烷之健康危害 ..........................................................4 二、蛋白質鍵結物 .........................................................................7 (一) 定義 .....................................................................................7 (二) 形成與意義 .........................................................................7 (三) 分析方法 ........................................................................... 11 (四) N-(2-hydroxyethyl)valine.................................................. 14 (五) 劑量計算 ........................................................................... 16 參 材料與方法 .................................................................................. 20 一、研究對象 ............................................................................... 20 二、材料 ....................................................................................... 20 (一) 藥品 ................................................................................... 20 (二) 實驗器材 ........................................................................... 21 (三) 儀器 ................................................................................... 21 三、實驗方法 ............................................................................... 22 (一) 準備血液樣本.................................................................... 22 IV.
(7) (二) 內標( 2d 4HEV)準備 ..................................................22 (三) 測 量 HEV 方 法 .....................................................22 四、氣相層析儀/質譜儀條件 ....................................................... 23 五、計算 HEV 濃度之方法.......................................................... 24 六、利用 protein adducts 濃度估算暴露劑量 ................................ 25 七 、 由 暴 露 劑 量 進 行 危 害 性 評 估 .............................. 26 八、統計分析 ............................................................................... 27 肆 結果 .............................................................................................. 28 一、問卷分析結果 ....................................................................... 28 二、分析 HEV 方法之建立.......................................................... 30 三、資料分析結果 ....................................................................... 31 四、品質管制 ............................................................................... 33 伍 討論 .............................................................................................. 34 一、 分析方法 ............................................................................... 34 二、 分析結果 ............................................................................... 35 (一) HEV 濃度與抽煙之相關 .................................................. 35 (二) 暴露劑量與抽煙之相關 .................................................... 36 (三) 致癌風險與抽煙之相關 .................................................... 37 陸 結論與建議 .................................................................................. 38 一、結論 ....................................................................................... 38 二、建議 ....................................................................................... 38 柒 參考文獻 ...................................................................................... 39 問卷.................................................................................................... 65. V.
(8) 表目錄 表一 問卷基本資料.........................................................................46 表二 抽煙與其他變項之相關 .........................................................47 表三 各變項與 HEV 值之比較 .......................................................48 表四 抽煙與 HEV 值之比較...........................................................49 表五 抽煙者之香煙不同與 HEV 值之比較 ...................................49 表六 性別與 HEV 值之比較...........................................................50 表七 家人抽煙情形與 HEV 值之比較 ...........................................50 表八 同事抽煙情形與 HEV 值之比較 ...........................................51 表九 每天抽煙支數與 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比較 ....52 表十 抽煙年數與 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比較 ............53 表十一 抽煙包年與 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比較 ........54 表十二 HEV 值分組後與抽煙支數、年數和包年間之比較 .........55 表十三 HEV 濃度之複迴歸............................................................56 表十四 樣本再現性.........................................................................57 表十五 與過去文獻比較.................................................................58. VI.
(9) 圖目錄 圖一 常見之蛋白質鍵結物 .............................................................10 圖二 空白實驗之圖譜.....................................................................59 圖三 標準品(HEV)衍生反應後之 full scan 圖譜 ...........................59 圖四 內標(2d4HEV)衍生反應後之 full scan 圖譜...........................60 圖五 標準品與內標衍生物之滯留時間比較..................................60 圖六 非抽煙者 HEV-PFPTH 及 2d4HEV-PFPTH 滯留時間之圖譜61 圖七 抽煙者 HEV-PFPTH 及 2d4HEV-PFPTH 滯留時間之圖譜 ...61 圖八 每天抽煙支數與 HEV 值之相關 ...........................................62 圖九 每天抽煙支數與暴露劑量之相關 .........................................62 圖十 每天抽煙支數與致癌風險之相關 .........................................62 圖十一 抽煙年數與 HEV 值之相關 ...............................................63 圖十二 抽煙年數與暴露劑量之相關 .............................................63 圖十三 抽煙年數與致癌風險之相關 .............................................63 圖十四 抽煙包年與 HEV 值之相關 ...............................................64 圖十五 抽煙包年與暴露劑量之相關 .............................................64 圖十六 抽煙包年與致癌風險之相關 .............................................64. VII.
(10) 壹 前言 一、研究動機 根據衛生署公佈的資料顯示(1) ，4-5 人中即有 1 人會得到癌症， 其中抽煙是最主要的危險因子。而香煙中有許多致癌物質，其中每支 香煙中約含 5 μg 的環氧乙烷(2)。環氧乙烷(ethylene oxide, EO)主要是 工業上乙二醇、乙二醇醚類和乙醇胺製成的中間產物，亦有部分使用 於醫療器材的消毒 (3) 。International Agency for Research on Cancer (IARC) 已於 1994 年將環氧乙烷歸類為已知人的致癌物(4)。而工作場 所空氣中 EO 濃度的 TLV 值已從 50ppm 到現在的 1ppm (ACGIH 1995; DFG 1996)。過去研究結果(5) 指出，暴露到環氧乙烷會對人體造成細 胞損害、突變，甚至導致癌症或死亡；職業暴露到環氧乙烷的人，體 內染色體異常(CA)、微核(MN)及姊妹染色體交換(SCEs)的機率皆會 增加(6-8)。 環氧乙烷進入人體後，會直接與血紅素中的胺基酸反應形成蛋白 質鍵結物，其中 N-(2-hydroxyethyl)valine (HEV)為廣泛研究作為環氧 乙烷暴露評估的指標。Törnqvist(2,9)於 1986 年發展 modified Edman degradation method，用以分析人體血紅素中 HEV，並評估環氧乙烷 之累積暴露及其引發的癌症危害，研究發現每天抽煙支數超過 20 支 的抽煙者與非抽煙者，其體內的 HEV 值分別為 389±138 及 58±25 pmol/g Hb ；Bader (10)研究也指出平均每支香煙會使 HEV 濃度增加 11 pmol/g Hb。 雖國外已有許多 HEV 之相關研究，但國內尚未有類似之研究。 故本研究欲建立 modified Edman degradation 方法分析體內蛋白質鍵 結物（HEV） ，並經由 HEV 的測量，估算個人因抽煙而暴露到環氧乙 烷的濃度，進而估計其造成的危害。 1.
(11) 二、研究目的 1. 建立 modified Edman degradation 方法以分析體內蛋白質鍵結物 (HEV)。 2. 探討抽煙與體內 HEV 值之相關性。 3. 估算個人因抽煙暴露到環氧乙烷之內在劑量及外在濃度。 4. 評估因抽煙暴露到環氧乙烷對人體之致癌風險。. 2.
(12) 貳 文獻探討 一、環氧乙烷 (一) 環氧乙烷之物化性質 環氧乙烷在常溫下是無色氣體，分子量為 44.05，比重為 0.882 (10 ℃)，沸點 10.7℃，熔點-111℃，蒸氣密度為 1.52， 20℃時其蒸氣壓 為 1,095 mmHg，為一種易燃性氣體，在空氣中爆炸範圍為 3-100％。 氣味似醚類，可溶於水。應避免與鹼金屬氫氧化物或高活性觸媒(如 無水氯化鐵、氯化錫等)一起反應，與銅和酸類皆不相容，而其八小 時日時量平均容許濃度（ TLV-TWA）為 1 ppm，短時間時量平均容許 濃度（TLV-STEL）為 2 ppm(11)。. (二) 環氧乙烷之用途 60%之 EO 用於製造乙二醇，12%是製造非離子的活性劑，而較 少部分是製造乙二醇醚、乙醇胺和其他化學物質(7)，如紡織、洗潔劑、 防凍劑、膠黏劑等製品之化學中間產物，其他用途尚包括： 1. 醫院中之儀器、塑膠器材之消毒。 2. 水果之促進成熟劑、防黴劑。 3. Kreb’s 腹水腫瘤細胞之惰化劑。 4. 煙草葉之成熟促進劑。 5. 火箭推進劑。 6. 製造 Acrylonitrile 所用的原始物質。 7. 對包裝好的穀物和食米、煙草，是一個很好用的殺蟲燻劑。 8. 食品及化妝品之殺菌劑。 3.
(13) (三) 環氧乙烷暴露來源 1. 當工廠未有完全控制設施或工廠現場操作異常時，則 EO 會釋放到 空氣中。 2. 呼吸到污染的空氣或汽機車排放之廢氣：含有大量乙烯，其在體內 會氧化成 EO。 3. 經由抽煙所吸入：香煙中含有 250μg 之乙烯及 5μg 之 EO(2)。. (四) 環氧乙烷之健康危害 1. 動物研究 Saillenfait 等人(12)以 Sprague-Dawley 懷孕的大鼠進行研究，以吸 入方式暴露 EO，發現於暴露到 800 和 1200 ppm 時，會使胎兒重量減 輕，且隨劑量增加，大鼠減輕的重量亦會增加。Weller(1999) (13) 以懷 孕的母鼠進行研究，經吸入方式暴露 EO，結果發現胎兒死亡、畸胎 機率會增加。而 Setzer (14) 以猴子為研究樣本，使其暴露到 100ppm EO，發現體重比起一般猴子明顯減少，至於神經傳導速度與一般族 群比較，並沒有明顯差異。有文獻(15) 指出，懷孕的老鼠暴露到 100 ppm EO，其懷孕時間會比一般懷孕的老鼠還長，而胎兒出生時體重亦會 減輕。 另有研究(16) 發現，EO 暴露會使鼠及猴子之姊妹染色體交換、染 色體異常的機率增加，亦會造成肺腫瘤、腺瘤及子宮腫瘤，而睪丸重 量及精蟲濃度也會減輕。Generoso(17) 以吸入方式使公鼠連續 4 天暴露 到 EO，每天暴露到 1800, 2400 或 3000 ppm-hr 之劑量，結果發現 EO 濃度增加會使 dominant-lethal mutations 增加，但不是呈線性關係。若 以飲水方式使老鼠慢性暴露到 EO 連續 30 天，發現在暴露到 10 mM EO 後，其突變頻率比一般老鼠增加 2.4 倍(18)。Lynch(19) 等人以 Fischer 4.
(14) 344 大鼠進行研究，使暴露到 0, 50, 100 ppm 之 EO，發現所有暴露族 群之體重皆明顯減輕、死亡率增加，且 mononuclear cell leukemia、 peritoneal mesothlioma 及 mixed cell brain giloma 之發生率亦明顯增 加。Snellings (20) 以吸入方式使 Fischer 344 大鼠暴露到 0, 10, 30, 100 ppm 之 EO，經四個月後，發覺 mononulear cell leukemia 之發生率增 加，且暴露 EO 濃度為 33, 100 ppm 之族群，其母鼠之癌症發生率亦 增加。而使 Lewis rats 以飲水方式暴露 EO 的研究，發覺會使其體內 HPRT mutant frequency 增加，且比非暴露組高出 2.5 倍. (21). 。. 2. 人體危害. (1) 急性毒性 刺激喉嚨、肺部產生咳嗽、噁心、嘔吐、頭痛、呼吸困難、衰 弱、神經失調、腹內壓迫感、頻尿等症狀。高濃度暴露則會造成抽 慉、昏迷甚至死亡；且會引起皮膚水泡、浮腫、灼傷、凍傷或嚴重 皮膚炎，並可能會刺激眼睛造成灼傷(11)。. (2) 慢性毒性 EO 會傷害神經系統，導致失去嗅覺、焦慮不安、手腳無力； 損傷肝和腎，或產生皮膚過敏等症狀(11)。Tates(18) 針對 6 位醫院消毒 員工及 8 位非暴露者進行研究，結果發現暴露者與非暴露者之 HPRT 突變頻率有明顯差異(p=0.003)，而同時針對 15 位 EO 暴露員 工及 15 位非暴露者之研究發現，暴露者之 CA 頻率比非暴露者高 2 倍(p<0.0001)，HPRT 突變頻率亦有明顯差異。Dellarco (16)的研究發 現 EO 暴露與 SCEs 值間有 dose-response 相關，而 Schulte(22)亦有類 似結果。Robinson(23)的研究則發現暴露 EO 者之突變頻率比非暴露 者高出 1.5 倍。另外有關 EO 之流行病學研究指出，暴露 EO 者罹 5.
(15) 患胃癌、腦癌、胰臟癌(24-27)、白血病(3) 及乳癌(28)的危險性比起非暴 露者皆會明顯增加，而 Hodgkin’s disease 發生率亦會增加(11) ；並有 證據表示長期暴露到高濃度 EO（700ppm）的人，其白內障發生率 也會增加(11)。. (3) 生殖影響 EO 也使用於牙科診所儀器的消毒，Rowland(15)針對在牙科工作 懷孕之助理進行研究，發覺其自然流產及早產的危險性比非暴露之 懷孕者增加 2.7 倍。Hemminki(8)的研究則表示從事醫院消毒工作的 女性，其自然流產的危險性比其他部門的女性高三倍。. 6.
(16) 二、蛋白質鍵結物 (一) 定義 蛋白質是由 20 種不同胺基酸所組成，每一胺基酸中的 O、N 或 S 常含有多餘的電子對，可與親電子物質 (electrophiles) 反應(29) 形成共 價鍵結物。環境中的有害化學物質在進入體內後會被代謝成活化的親 電子之中間產物，容易與蛋白質的胺基酸中具親核性的原子反應，而 形成共價鍵結物，此產物稱為蛋白質鍵結物 (protein adducts)(9)。. (二) 形成與意義 基因毒物 (genotoxicants)或其代謝物與 DNA 鹼基形成的共價鍵結 物 (DNA adducts)，因與化學致癌機制有直接關係，而被公認為是與致 癌風險相關的生物指標。但在實際應用上 DNA adducts 樣本量少且取 得不易，加上 DNA adducts 半衰期往往比較短，而且會被基因修補酵 素修復，因此在人體內比較不易累積。反觀 protein adducts 不僅不會影 響蛋白質原有的功能，而且樣本量多不會被酵素修復(30) ，它的半衰期 與原來的蛋白質一樣長，故其濃度會隨暴露時間與劑量而累積。如欲 執行長期暴露評估時，protein adducts 比 DNA adducts 更能代表累積暴 露劑量，再加上形成 DNA adducts 的物質，也會形成 protein adducts(30)， 而且兩者之間有良好的線性關係，因此 Lars Ehrenberg 等人(31)於 1974 年提出以 protein adducts 代替 DNA adducts 作為暴露評估的生物指標。 就誘發 protein adducts 的物質而言，可分為兩類(32)。較常見的為分 子量小之物質，這些致癌物或其親電子物質包括：ethylene oxide、 propylene oxide、styrene oxides；另外由 urethane、vinyl chloride 形成 的 環 氧 化 物 ； acrylamide； alkylating agents( 如 methyl bromide 和 7.
(17) chloroacetaldehyde)。這些化學物質形成的蛋白質共價鍵結物不會影響 其原有的功能，且對於胺基酸反應的位置並沒有選擇性，adduct 的量 主要由不同胺基酸反應之反應速率而決定。第二種為分子量大及脂溶 性的物質，例如 Aflatoxin B1 (AFB1)和多環芳香羥化合物(PAH)。蛋白 質的空間結構會影響 protein adducts 的形成，這些化合物與蛋白質的反 應 產 物 無 法 預 測 。 此 類 反 應 的 最 好 例 子 是 N-sulfonyloxy-N-acetyl-4-aminobiphenyl 和 serum albumin 形 成 的 adducts。 實際上 protein adducts 種類很多，如何選擇適當的 protein adducts 進行研究，則可依下列條件(32)：(1)在生物體內的化學性穩定；(2)對蛋 白質穩定性及功能的影響；(3)易進行人群樣本分析研究；(4)protein adducts 和 DNA adducts 間相關性佳；(5)由 protein adducts 的量可得知 其外在暴露劑量。到目前為止尚未發現有一 protein adduct 能完全滿足 以上的條件，只有血紅素(Hb)和 albumin adducts 能符合前四項標準 (32). 。然而血紅素的生命週期 120 天比 serum albumin(半衰期 20-25 天). 長，過去研究(33)發現 Hb adducts 濃度與暴露劑量成線性相關，加上紅 血球易於取得，故 Hb adducts 常被用於職業暴露及環境暴露的生物指 標，並也可用於推估長時間的累積暴露劑量(34)。 在血紅素中常被研究的胺基酸，包括： 1. Valine CH 3. CH. CH CH 3. COOH. NH2. 2. Cysteine H2C HS. COO-. CH + NH. 3. 8.
(18) 3. Lysine H2C +. CH2. CH2. CH. CH2 +. NH 3. COO -. NH3. 4. Histidine CH2 HN. +. NH. COO -. CH +. NH 3. 其中 cysteine, histidine 和 N-terminal valine 很容易與親電子物質產 生共價鍵結物。. 9.
(19) N. CH 3 S CH2 H2N CH COOH. CH 3. CH2 H 2N. CH. COOH. Nτ-methylhistidine. S-methylcysteine. N. CH 3. H3C. N. N. CH 2CH 2OH. CH CH 3 NH. CH. CH 2 COOH. H2N. CH. Nτ-(2-hydroxyethyl)histidine. N-methylvaline. CH 2 CH 2COOH. CH 3. H 3C. S. CH HOCH 2CH 2 NH. CH. COOH. CH 2. COOH H 2N. CH. COOH. S-(2-carboxyethyl)cysteine. N-(2-hydroxyethyl)valine. 圖一 常見之蛋白質鍵結物. 10.
(20) (三) 分析方法： 1. Total protein hydrolysis：一般使用 6N 鹽酸在 120℃下反應，使蛋白 質完全斷裂成胺基酸，再用氣相層析儀-質譜儀 (GC/MS) 分析胺基 酸與外來物或其活性代謝物形成之共價鍵結物。 2. Mild hydrolysis(35)：一般使用 1N 氫氧化鈉與蛋白質反應，將胺基酸 與活性物質形成的 carboxyl group 共價鍵打斷，使其釋放出 ester adducts ， 再 以 CH2Cl2 及 hexane 萃 取 ， 並 作 衍 生 反 應 後 ， 以 GC/MS-NCI 分析。 3. Raney nickel(36)：主要是使用 Raney nickel 來切斷 Hb 或 albumin 中 之 cysteine residue 中的碳- 硫鍵(carbon-sulfur bonds) ，釋放出含 sulfhydryl 官能機的活化物質。再經衍生反應後以 GC/ MS-NCI 分 析之。 4. Modified Edman degradation(9) ： 以 NaOH 、 pentafluorophenyl isothiocyanate (PFPITC) 參與反應，再以二乙醚、蒸餾水及 Na2CO 3 溶液萃取，以 GC/ MS-NCI(EI)分析 alkylated N-terminal valine 的衍 生物。 5. Immunochemistry — 酵素聯結免疫吸著分析法(ELISA)：一酵素先和 抗體結合且與一受質(substrate)反應，產生一有色產物，並加以測量 其 adduct 值。. 其中 total protein hydrolysis 方法較耗時，敏感度較低，有非常高濃 度的正常胺基酸，首先需要前處理將正常胺基酸與修飾的胺基酸分 離，因在濃度低時不易分析或分析結果不確定性較高，故近來較不常 用(37)。. 11.
(21) 以 styrene 為例 O CH CH2. CH2 P450. CH. styrene. styrene-7,8-oxide. Mild hydrolysis： O C O CH. O. CH2. C. CH. R. CH2. CH. OH. O. C. O. SG-PFB. styrene glycol (SG). SO-COOH adduct. CH. PFB-Cl. NaOH. +R-COOH. C6F5. O. OH. OH. C6F5. Raney Nikle： O C O. OH. OH CH2. CH. S. CH. R. CH3. SO-cyateine adduct (α binding). CH. CH3. PFB-Cl. Raney Ni. +R-SH. C 6F5. 1-phenylethanol (1-PE). 1-PE-PFB C6F5. S. R. CH. CH 2. C CH2. OH. CH2. Raney Ni. + R-SH. SO-cysteine adduct(βbinding). CH2. OH PFB-Cl. 2-phenylethanol (2-PE). Edman degradation：. 12. 2-PE-PFB. CH2. O. O.
(22) H 3C. CH 3 CH. OH. OH CH. CH 2. NH. +R-NH 2. CH. R Edman. CH 2. O. N N. Degradation. C 6F 5. pentafluorophenyl thiohydantoin. SO-valine adduct. 以 GC/MS 分析 protein adducts，其優點(38)包括：(1)可提供分析物 的化學結構；(2)對分析物之專一性高；(3)儀器敏感度高；(4)有可能偵 測多種生物標誌。 文獻上的例子很多，在 1978 年 Calleman 等人(39)即以 total protein τ. hydrolysis 方法分析 EO 暴露所產生的 N -(2-hydroxyethyl)histidine (HOEtHis)；接下來 Farmer 等人分別於 1980(40)、1981(41)及 1992(42)年以 相同方法分析因 ethylating agents、methylating agents 及 propylene oxide 暴露而與 Hb 的 histidine 所產生的 S-ethylcysteine、S-methylcysteine 和 τ. N -(2-hydroxypropyl)histidine；Bailey(37) 於 1986 年亦以 total protein hydrolysis. 方 法 分 析. acrylamide. 暴 露 所 產 生 的. S-(2-carboxyethyl)cysteine，而於 1987 年(43)亦以此方法分析 acrylamide 之暴露，其結果指出 acrylamide 暴露者的 HOEtHis 值為 0.55-8.0 nmol/g globin，非暴露者(背景值)為 1.41 nmol/g。 Törnqvist(2)以 modified Edman degradation 方法，測定因抽煙暴露 到環氧乙烷而產生的 N-(2-hydroxyethyl)valine (HEV)；Bailey(1987) (43) 以相同方法分析 HEV，偵測極限可達 0.1 nmole/g globin。1993 年， Hecht(35)以 mild hydrolysis 方法分析香煙中 N-nitrosonornicotine (NNN) 及 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) 在體內形成 的 4-hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanone (HPB)。. 13.
(23) (四) N-(2-hydroxyethyl)valine 環氧乙烷是親電子化物，不需代謝即可與蛋白質反應，其中與人 體血紅素中的 histidine 及 N-terminal valine 反應所產生的蛋白質鍵結 τ. 物為 N -(2-hydroxyethyl)histidine (HOEtHis)、N-2-hydroxyethyl-valine (HEV)(44) 。而 Calleman(1978) (39)首先針對 5 位德國暴露 EO 之消毒工 人及兩位非暴露人員，以測量 HOEtHis，結果發現消毒人員之 adduct 值 (0.5-13.5 nmol/g) 比對照人員 (0.05 nmol/g) 高出許多。 許多研究(40) 皆證實 HOEtHis 和 HEV 可用來作為偵測 EO 暴露之 指標。雖然 cysteine 和 histidine adducts 可當作偵測高暴露劑量之致癌 物之生物劑量，但其背景值高，會限制低劑量時暴露之敏感度(41)。而 HEV 的測量，因血紅素中背景值低，則可使偵測 EO 暴露更敏感。 有研究(2) 指出每支香煙約含有 5μg 環氧乙烷，故抽煙亦會使血 紅素中 HEV 值增加。1986 年 Törnqvist(2) 之研究指出，非抽煙者的 HEV 平均值為 58 pmol/g Hb，而抽煙者體內 HEV 濃度為 389 pmol/g Hb。而 Mowrer (45)以 modified Edman degradation 方法分析血紅素中 HEV，偵測極限為 1 nmol HEV/g Hb，較 Törnqvist(9)與 Bono(44) 分析 HEV 的結果為高，其偵測極限可低至 0.01 nmol/g Hb。Bailey(46)於 1988 年之研究結果為非抽煙者平均 HEV 值為 50 pmol/g globin，抽煙者則 為 200 pmol HEV/g globin，Bader (10)於 1995 年的研究也指出抽煙者的 HEV 值平均為 171±93 pmol HEV/g Hb，而非抽煙者的背景值平均為 46±12 pmol HEV/g Hb。Muller(1998) (47)則表示，抽煙者體內 HEV 值 （中位數為 280 pmol/g Hb）比非抽煙者（中位數為 50 pmol/g Hb）高 5 倍以上。Törnqvist(1992) (42) 針對雙胞胎的研究中指出抽煙量與 HEV 生成量有明顯相關。Ehrenberg(1995) (48)則表示一般人體內 HEV 的背 景值約 20 pmol/g Hb，在動物實驗也得到相似結果。Filser (49)則以藥物 動力學計算出人體內 HEV 背景值為 12±2.9 pmol/g Hb。 14.
(24) Sittert(1993) (50)以 modified Edman degradation 方法分析 HEV，結 果發現每天抽煙數量與 HEV 值間亦有明顯相關。Bader(1995) (10) 的研 究 指 出 HEV 和 每 天 抽 煙 數 量 的 相 關 性 為 11 pmol HEV/g Hb/cig./day，而 Törnqvist(2) 的研究顯示每天每支煙會增加 9.4 pmol HEV/g Hb，Boogaard(1999) (33)的研究亦得到相同的結果，而 Ehrenberg (1995) (48) 得到的結果為 85 pmol/10 cig./day，因此，過去許多研究皆證 明 HEV 可做為個人抽煙的暴露指標(40)。 暴露在低濃度的環氧乙烷環境下，Boogaard(33) 研究結果顯示空氣 中環氧乙烷濃度與體內 HEV 值間有明顯相關。Angerer(1998) (24) 亦指 出暴露到 1 ppm 環氧乙烷會使體內產生約 4 nmol HEV/g Hb，並建立 了周圍空氣環氧乙烷濃度與體內 HEV 濃度之關係。而 Ribeiro (1994) (6) 針對製造 polyethylene glycol 的工廠員工之研究發現，工廠內暴露員 工之 HEV 值平均為 294 nmol HEV/g Hb，非暴露者則為 92 nmol/g Hb。Törnqvist(1989) (51) 針對水果店的員工（暴露到乙烯）與一般非暴 露者進行研究，發現工作期間暴露 0.3 ppm 乙烯，會使 HEV 值增加 23 pmol/g Hb。HEV 已被證實是偵測工廠員工職業及環境暴露到環氧 乙烷很好的指標(33)。 環氧乙烷的來源，除了職業暴露及抽煙外，尚包括乙烯的代謝， 乙烯的外在來源來自空氣污染，且人體內生性來源包括脂質過氧化、 hemin、methionine 的氧化，及腸胃道細菌的代謝，故在非暴露的大 白鼠、小白鼠及人體中，可測量到低量的內生性 HEV(51,52)。 另外，亦有針對 HEV 與 DNA adducts 間的相關研究，HEV 值與 DNA adducts 的相關性為 10 pmol HEV/g Hb 約等於 0.33 pmol N-7 guanine adduct/g DNA(53)。. 15.
(25) （五）劑量計算 本研究為利用 protein adducts 之測量值，估計內在暴露劑量，及 外在暴露劑量，而進行危害性評估。 估計內在暴露累積劑量之各種模式如下：. ※ 假設為單一劑量 1. 估算活性親電子物質的劑量 RX 減少的速率為 d [ RX ] / dt = − K e [ RX ]. [1]. （[RX]為活性親電子物質的濃度，Ke 為 RX 減少的反應速率常數）. t. t. 0. 0. ∫ d [ RX ] / dt = − ∫ K e [RX ] / dt. [2]. t. t d [ RX ] ∫0 [RX ] = − ∫0 K e dt. [3]. [RX ] = − K et [ RX ]0. [4]. ln. [ RX ] = [ RX ] 0 e − K t. [5]. e. 而劑量 D =. t. ∫ [ RX ]dt. [6]. 0. 將[5]代入[6]，可得. D =. t. ∫ [ RX ] 0. D =. e − K t dt e. [7]. 0. [ RX ]0 (1 − e − K t ) Ke. [8]. e. 即可計算親電子物質之劑量 D。. 16.
(26) 2. 利用 protein adducts 濃度估算暴露劑量 假設親電子物質在體內之反應方程式為. RX + Y → RY + X. [9]. 其中，[RX]為體內活性親電子物質之濃度，而[Y]則代表體內血 紅素的濃度，RY 為血紅素與活性親電子物質所形成的鍵結物，相 對於 protein adduct 生成濃度([RY])，[Y]值可假設為一常數（因 [RY]<<[Y]） 。(其中 K Y 為反應式[9]的速率常數) (1) 假設 RY 消失的速率為零次反應(54) RY 之生成速率為 d [ RY ] / dt = K Y [ RX ][Y ] − K. [10]. K d [RY ] dt = K Y [ RX ]dt − [Y ] [Y ]. [11]. [ RY ] K = KY ⋅ D − ⋅t [Y ] [Y ]. [12]. D=. 1 [ RY ] + K ⋅ t ⋅( ) KY [Y ]. [13]. [RY]/[Y]代表在某一時間所量到血液中 protein adducts 的濃度。 只要分析[RY]/[Y]、暴露期間與各個 K 值，便可估算暴露的劑量。 (2) 假設 RY 的消失速率為一次反應. RY 的反應速率為 RY 的生成速率減去 RY 的消失速率 (K −Y 為 RY 的消失反應速率常數)，即 d [ RY ] / dt = ( K Y [RX ][Y ]) − ( K −Y [ RY ]) 17. [14].
(27) 同除以[Y]，得 [ RY ] [ RY ] ) / dt = ( K Y [ RX ]) − ( K −Y ) [Y ] [Y ]. [15]. [ RY ] [ RY ] ) / dt + K −Y = K Y [ RX ] [Y ] [Y ]. [16]. d( d(. 將[5]代入[15]中 K [ RX ]0 [RY ] (e −K = Y [Y ] ( K e − K −Y ) [ RX ]0 =. t. − e −K t ) e. [17]. [ RY ] K e − K −Y x [Y ] K Y ( e− K − Y t − e − K et ). [18]. −Y. 將[17]代入[8]，可得 [ RY ] ( K e − K −Y )(1 − e − K t ) D= x K e [Y ] K Y (e − K t − e −K t ) e. −Y. e. [19]. 只要分析[RY]/[Y]、暴露期間與各個 K 值，便可估算暴露的劑量。 3. 估算工作場所中重複暴露劑量. C0 代表外在暴露濃度，K 代表外在有害物質的反應速率常數 d [RX ] = KC0 − K e [ RX ] dt [ RX ] = [RX ]0 e − K t + e. [20]. K C0 (1 − e− K t ) Ke e. [21]. (1) 假設 RY 的消失速率為零次反應 d(. [ RY ] K ) / dt = ( KY [ RX ]) − e [Y ] [Y ]. [11]. 將[21]代入[11] KY [ RX ] = d ( [ RX ]dt =. [ RY ] K ) / dt + e [Y ] [Y ]. [22]. 1 [RY ] 1 Ke d( )+ ⋅ dt KY [Y ] K Y [Y ]. 18. [23].
(28) 1. ∫ [RX ]dt = ∫{ K D = ∫ [ RX ]dt =. [d (. Y. [ RY ] K ) + e dt ]} [Y ] [Y ]. [24]. [ RY ] Ke ⋅ t + K Y ⋅ [Y ] K Y ⋅ [Y ]. [25]. 只要分析[RY]/[Y]、暴露時間及各個 K 值，即可估算暴露劑量。 (2) 假設 RY 的消失速率為一次反應 d(. [ RY ] [RY ] ) / dt = ( K Y [RX ]) − K −Y [Y ] [Y ]. [ RY ] [RY ] −K =( )0 e [Y ] [Y ] D=. −Y t. +. [14]. K e KY − KC 0 − K t KC0 (e (1 − e− K t ) [26] − e −K t ) + K e ( K −Y − K e ) KK −Y −Y. e. KC 0t [ RX ]0 KC (t − 1) + (1 − e − K t ) + 20 e − K t Ke Ke Ke e. e. −Y. [27]. 只要求得[RX] 0、C0、暴露時間及各個 K 值，即可估算暴露劑量。. 19.
(29) 參 材料與方法 一、研究對象 隨機抽取台中市中國醫藥學院對面捐血車之自願捐血者為 研究對象，並同時進行問卷調查(附錄一)，共 162 位。. 二、材料 (一) 藥品 1. 氯化鈉 (USB, ACS Reagent Grade) 2. 超純水 (TEDIA, HPLC/Spectro) 3. 甲醇 (Fisher Chemical, HPLC, Assay 99.9%) 4. 12N 鹽酸 (Merck, Suprapur, hydrochloric acid 30%) 5. 異丙醇 (TEDIA, HPLC/Spectro, Assay 99.6%) 6. 乙酸乙酯 (TEDIA, HPLC/Spectro, Assay 99.97%) 7. 正戊烷 (TEDIA, Pesticide, Assay 99.6%) 8. 氫氧化鈉 (Wako, Assay 96%) 9. 甲醯胺 (Sigma Ultra) 10. N-Hydroxyethyl-Val-Leu-anilide(Bachem,purity>98%) 11. Ethylene oxide-d4 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc., 99%) 12. pentafluorophenyl isothiocyanate (PFPITC) (Fluka, Buchs, Switzerland, Assay≧97%) 13. 碳酸鈉 (Fisher ChemAlert Guide, Assay 100%) 14. 二乙醚 (TEDIA, HPLC/Spectro, Assay 99.96%) 15. 甲苯 (Sigma, ACS Reagent, Assay 99.9%) 20.
(30) (二) 實驗器材 1. 離心管(Costar, 15ml 及 50ml) 2. 含 EDTA 之真空採血管 3. 微量吸管（Brand, 2-20μl、20-200μl、200-1000μl） 4. pipette tip (Costar, 200μl、1000μl). (三) 儀器 1. 離心機 (KUBOTA 5800) 2. 離心濃縮機 (LABCONCO) 3. orbital shaking incubator (OSI500R) 4. 天秤 (Mettler Toledo, AG 245) 5. 震盪器 (Thermolyne, Type 37600 Mixer) 6. 氣相層析儀/質譜儀（GC/MS, gas chromatography/mass spectrometry)：GC-FISONS 8000 series; MS- FISONS VG platform II. 21.
(31) 三、實驗方法 (一) 準備血液樣本 ↓取 5ml 之血液 ↓離心 10 分鐘，取下層之紅血球 ↓以 0.9% NaCl 溶液 5ml 清洗 ↓萃取血紅素 ↓以離心濃縮機乾燥 ↓將乾燥之血紅素秤重，並置於-80℃. (二) 內標(2d4HEV)準備 ↓將 2d4EO 氣體從鋼瓶中釋放出，並溶於水中 ↓加入 NaCl，配製成 0.9% NaCl 溶液 ↓加入紅血球 ↓萃取血紅素，並溶於甲醯胺. (三) 測量 HEV 方法 以 Törnqvist(1986)發展的 modified Edman degradation 方法測 定(2,9)。. ↓取約 100mg 血紅素樣本溶於 3ml 甲醯胺 ↓加入 NaOH (1M)、internal standard(2d4HEV)和 pentafluorophenyl isothiocyanate(PFPITC) ↓室溫下反應一晚上 ↓以二乙醚萃取 ↓以蒸餾水及 Na2CO3 清洗 ↓以離心濃縮機乾燥 ↓溶於甲苯中，以 GC/MS 分析 22.
(32) 四、氣 相 層 析 儀 / 質 譜 儀 （ GC/MS-NCI ， gas chromatography / mass spectrometry — negative chemical ionization）條件 1. column：DB-5，30m x 0.32mm，film：0.1μm 2. column pressure：15psi 3. 溫度：injector—150℃ oven 升溫條件： 起始溫度為 100℃，維持 1 分鐘後，以每分鐘 12.5℃ 升溫至 200℃，再以每分鐘 2℃的條件升溫至 206℃，最後 以每分鐘 30℃升至 300℃，維持 1 分鐘。. 4. 流速：1ml/min 5. 反應氣體：甲烷 6. 載流氣體：氦氣. 23.
(33) 五、計算 HEV 濃度之方法 本研究之定量方式是以內標(0.9 nmol 2d4 HEV)作為定量樣本中 HEV 之標準。 由分析圖譜中可得到 m/z 348 及 352 信號比值，將其比值乘以內 標之量，可得知相對 HEV 之含量，再將 HEV 量除以血紅素重量，即 為 HEV 之濃度值，單位為 pmol/g Hb。. 24.
(34) 六、利用 HEV 濃度估算暴露劑量 假設環氧乙烷在體內之反應方程式為. RX + Y → RY + X. [9]. 其中，[RX]為體內環氧乙烷濃度，[Y]為血紅素濃度，而[RY]則 為 HEV 生成濃度([RY]<<[Y])。 假設 HEV 消失的速率為零次反應(54) (KY 值代表 HEV 之生成速率 常數)，其生成速率為 d[RY ] / dt = KY [RX ][Y ]. [28]. [ RY ] = K Y ∫ [ RX ]dt = K Y Dblood [Y ]. 故. Dblood =. 1 [ RY ] ⋅ KY [Y ]. [29] [30]. Dblood 為人體內環氧乙烷之劑量，環氧乙烷與體內 N-terminal valine 之反應速率常數 KY 為 4.5x10-5 l/g· Hb· h(54)，[RY]/[Y]則代表所測 得血液中 HEV 之濃度。. Dexp = Dblood / f1. [33]. Dexp 為 EO 之外在暴露劑量，f1 為血液中劑量與外在暴露劑量之比值， 而. 0.06 × 10 −6 ( ppm −1 ) × 0.11(liter ⋅ kg −1 ⋅ min −1 ) × 60(min ⋅ h −1 ) f1 = 25(liter ⋅ mol −1 ) × 3h −1 = 5 × 10 −9 mol ⋅ kg −1 ⋅ h ⋅ ( ppm ⋅ h )−1 = 5 × 10 −6 (mM ⋅ h)( ppm ⋅ h) −1. 其中主流煙中 ET 約有 6％會代謝成 EO(61)，而 alveolar ventilation (Valv)為 0.11 L/kg⋅min，EO 之 detoxification 反應速率常數為 3· h-1 (62,63). ，將 Dblood 帶入[33]式中，即可求出 EO 之外在暴露劑量 Dexp。. 25.
(35) 七、由暴露劑量進行危害性評估(56) Exposure dose (Dexp ). f1. Blood dose (Dblood). f2. Target dose (Dtarg ). 則其造成之風險為(56). 而. Risk = kr ⋅ Q ⋅ Dt arg. [31]. Dt arg = f1 f 2 Dexp. [32]. Dblood = f1Dexp. [33]. 其中 Dexp 為外在暴露劑量，Dtarg 為標的器官之劑量，kr 為 cancer risk radiation risk coefficient，f1 為血液中劑量與外在暴露劑量之比 值，f2 則代表標的劑量與血中劑量之比值，而 Q 為 quality factor，是 基因毒性物質對人體所產生的基因傷害程度，表示為 mM· h。 而各個參數值，f1 為 5 x 10-6 (mM· h)(ppm·h) -1，f2 為假設 EO 於暴 露後會分佈至全身，即為 1(57) ，癌症發生風險之 risk coefficient kr 為 4×10-4 rad -1(58) ， Q 則 採 用 在 不 同 生 物 體 測 量 之 平 均 值 為 80(mM· h)-1(59,60)。. 故. Risk / Dexp = f 1 f 2 Qk r. [34]. = 5 × 10 −6 ( mM ⋅ h)( ppm ⋅ h ) −1 × 1 × 80( rad )(mM ⋅ h ) −1 × 4 × 10 −4 rad −1 = 0.16 × 10 −6 ( ppm ⋅ h ) −1. 只要將所計算出的外在暴露劑量(Dexp)帶入[34]式中，即可求出個 人之致癌風險值。. 26.
(36) 八、統計分析 所有的數據均以Excel建檔，再以SAS 6.12進行統計分析，統計 方法包括卡方檢定、變異數分析(ANOVA)、t test、多變項迴歸分析等， 分析結果再以Word、Excel製作成表格。. 27.
(37) 肆 結果 一、問卷分析結果 表一為 162 位研究對象之基本資料。其中男性共 105 位，佔 64.8%，女性共 57 位，佔 35.2%；年齡分布情形，大多集中於 23-35 歲，佔 45.0%；其中 43.2%的人平常有抽煙習慣，54.3%沒有抽煙習 慣，另外 4 人則已戒煙；而平常有喝酒習慣者，佔 22.8%；有喝茶習 慣者，佔 43.8%；有喝咖啡習慣者，佔 26.5%；在飲食習慣方面，只 有 2 人吃素食。 本研究皆針對無職業暴露到乙烯或環氧乙烷者進行探討。另外， 欲了解研究對象外在暴露到乙烯的情形，針對其交通工具及交通時間 進行調查。大多數人皆以機車及轎車代步，其中出門騎機車者最多， 佔 53.1%，開車者其次，佔 43.8%；在外交通時間大多在 10-30 分鐘 間，佔 46.8%，而需 10 分鐘以內者佔 31.6%。 表二是依據抽煙與否區分，了解抽煙與其他變項間之相關。其中 抽煙者中約有 85.7%為男性，女性僅佔 14.5%，而非抽煙者中 47.7% 為 男 性 ， 51.7% 為 女 性 ， 性 別 與 否 與 抽 煙 達 統 計 上 顯 著 差 異 (p<0.0001)；而年齡分布情形，23-35 歲以上之抽煙者最多，佔 57.1%， 35 歲以上之抽煙人數其次，佔 28.6%，而 35 歲以上之非抽煙者最多， 佔 37.5%，23-35 歲之非抽煙者則次多，佔 35.2%，結果顯示抽煙者 與非抽煙者之年齡分布未達統計上顯著差異(p=0.9163)。有關其家中 及工作場所抽煙人數之調查，則了解研究對象暴露到二手煙之可能情 形，發覺 22.1%之抽煙者，其家人沒有抽煙習慣，而非抽煙者則為 65.2%，77.9%抽煙者家人有抽煙習慣，非抽煙者則為 34.8%；在同事 抽煙人數方面，25%抽煙者之同事沒有抽煙習慣，非抽煙者則為 68.5%，而抽煙者之同事抽煙人數大多集中於 5 人以下，佔 66.2%， 28.
(38) 非抽煙者則為 22.5%，而家人、同事抽煙與否與個人是否抽煙皆達統 計上顯著差異(p<0.0001)。在喝酒習慣方面，30.4%之抽煙者有喝酒習 慣，非抽煙者則是 15.7%，抽煙者與非抽煙者之喝酒習慣有顯著差異 (p=0.0008) ； 而 抽 煙 者 中 僅 有 18.8% 有 喝 咖 啡 習 慣 ， 非 抽 煙 者 為 32.6%；44.9%之抽煙者有喝茶習慣，42.7%之非抽煙者有喝茶習慣， 喝咖啡及喝茶習慣方面，抽煙者與非抽煙者間皆未達統計上明顯差 異。. 29.
(39) 二、分析 HEV 方法之建立 圖二為空白實驗之圖譜，圖譜中質荷比 352 之信號值為衍生藥劑 (PFPITC)。 圖 三 為 將 標 準 品 之 衍 生 物(HEV-PFPTH) 進 行 全 質 譜 掃 描(full scan)所得之圖譜。其中此衍生物之分子量為 368，掉了 HF，則質荷 比變為 348，為主要偵測值，而由 348 降至 318 則是少了 CH2O。 圖四為內標之衍生物(2H4HEV-PFPTH) full scan 之圖譜。內標為 以 4 個重氫標示之 HEV，故比標準品之分子量多 4，即其質荷比(m/z) 為 372，而掉了 HF 則變成 352，又因掉 C2H2O 使 m/z 降為 320。圖 三、圖四中質荷比訊號最強之值為 318、320，但因其只相差兩個 m/z， 易受其同位素干擾，故選擇次強之值，即 348、352 作為偵測對象。 圖五為標準品與內標衍生物之滯留時間(retention time)比較。標 準品衍生物之滯留時間為 9.71，而內標之衍生物為 9.68，時間只相差 0.03 分鐘，其滯留時間非常接近。 圖六及圖七分別為非抽煙者及抽煙者 HEV 衍生物及 2d4HEV 衍 生物滯留時間之圖譜。. 30.
(40) 三、資料分析結果 表三為各變項與體內 HEV 值之比較。由表中看出年齡、交通時 間、交通工具、喝酒、喝茶、喝咖啡及飲食習慣之變項與體內 HEV 值皆沒有顯著相關。 表四為抽煙與體內 HEV 值、暴露劑量與癌症風險之比較，非抽 煙者體內之 HEV 值平均為 58.3 pmol/g Hb ，抽煙者則為 205.9 pmol/g Hb，可見抽煙者體內之 HEV 值高於非抽煙者，且兩組之 HEV 的含 量達統計上顯著差異(p<0.0001)；而非抽煙者之暴露劑量為 259.2 ppm h，抽煙者之暴露劑量為 915.2 ppm. h，隨著抽煙支數增加，暴露. 劑量亦有增加之趨勢，且達統計上顯著相關(p<0.0001)，抽煙與癌症 風險之比較，可看出非抽煙者因暴露到 EO 之癌症風險為 4.15×10-5， 而抽煙者之風險為 1.46×10-4，兩者達統計上顯著相關(p<0.0001)。 表五為將香煙種類分為國內及國外煙兩種，其中國內煙即為長壽 煙，其他香煙種類皆定義為國外煙。由表中顯示，抽國內香煙之抽煙 者其體內之 HEV 值為 227.0 pmol/g Hb，抽國外香煙之抽煙者其 HEV 值為 190.6 pmol/g Hb，並沒有達到統計上顯著差異。 表六是以抽煙與否分組，探討性別與體內 HEV 值之比較。結果 發現不論抽煙與否，性別與其體內 HEV 值未達統計上顯著差異。 表七、八是了解研究對象二手煙暴露與體內 HEV 值之比較。其 中表六將研究對象以是否抽煙分組，分別探討其家人有無抽煙與其體 內 HEV 值之比較，就非抽煙者而言，家中沒有人抽煙者，其體內 HEV 值平均為 58.6 pmol/g Hb，而家中有人抽煙者則為 62.1 pmol/g Hb，而 針對抽煙者，家人沒有抽煙習慣者，其體內 HEV 值平均為 138.2 pmol/g Hb，其家人也有抽煙習慣者則為 225.0 pmol/g Hb ，不論抽煙 者和非抽煙者而言，家人有成員抽煙者其體內 HEV 值均略高於家中 無人抽煙者，而只有抽煙者中家人抽煙與否與 HEV 值達統計上顯著 31.
(41) 差異(p=0.0131)。 表八則為受測者辦公室同事有無抽煙與其體內 HEV 濃度之比 較，結果發現在非抽煙組，同事中沒有抽煙習慣者，其 HEV 值平均 為 58.5 pmol/g Hb，同事中有抽煙習慣者，其體內 HEV 值為 58.0 pmol/g Hb ，而在抽煙組，同事沒有抽煙習慣者，其 HEV 值為 245.3 pmol/g Hb，同事有抽煙習慣者，其 HEV 值為 199.8 pmol/g Hb，無論 抽煙或非抽煙組，同事中有抽煙習慣與否與其體內 HEV 值間皆未達 統計上顯著差異。 表九為每天抽煙支數與體內 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比 較，將抽煙支數分成三組，可明顯看出隨著抽煙支數增加，體內 HEV 值亦有增加之趨勢，且每天抽煙支數分別與 HEV 值、暴露劑量及癌 症風險間達統計上顯著相關(p<0.0001)。 表十為抽煙年數與 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比較。將抽 煙年數分為三組(0, 0-10, 10 年以上)，由表中可看出隨著研究族群抽 煙年數增加，HEV 值、暴露劑量、癌症風險亦會增加，且皆達統計 上顯著相關(p<0.0001)。 表十一為抽煙包年與 HEV 值、暴露劑量及致癌風險之比較。將 抽煙包年分為三組(0, 0-7, 7 包年以上)，由表中可看出隨著研究族群 抽煙包年增加，HEV 值、暴露劑量及癌症風險亦會增加，且皆達統 計上顯著相關(p<0.0001)。 表十二是將體內 HEV 濃度分成低、中、高濃度三組後，與抽煙 支數、抽煙年數及抽煙包年之比較。結果顯示在低濃度組(小於 42.4 pmol/g Hb)，每天抽煙支數平均為 2.15 支，中濃度組(42.4 至 177.0 pmol/g Hb)之每天抽煙支數平均為 4.37 支，高濃度組(大於 177.0 pmol/g Hb)則為 12.39 支，每天抽煙支數與 HEV 值達統計上顯著相關 (p<0.0001)；在抽煙年數而言，於低濃度組中，其平均抽煙年數為 2.06 年，中濃度為 3.95 年，高濃度組則為 11.0 年，可看出隨著抽煙年數 32.
(42) 增加，其體內之 HEV 值亦有增加的趨勢，而針對抽煙之包年，低濃 度組中其抽煙包年為 1.24 包年，中濃度組為 1.52 包年，高濃度組為 2.3 包年，隨著抽煙包數增加，其體內之 HEV 值亦有增加的趨勢，結 果 顯 示 抽 煙 年 數 、 抽 煙 包 年 與 HEV 值 間 皆 達 統 計 上 顯 著 差 異 (p<0.0001)。 表十三為影響 HEV 濃度之複迴歸分析。結果得知抽煙與 HEV 值達統計上顯著相關(p<0.05)，即有抽煙者之 HEV 值會明顯高於非抽 煙者，而抽煙支數與 HEV 值間亦有統計上顯著相關(p<0.01)，即抽煙 者每天抽煙支數愈多 ，體內 HEV 值愈高，其迴歸模式之解釋力 (R2=0.3603)達統計上顯著意義(p<0.001)。 圖八、九及十分別為每天抽煙支數與 HEV 值、暴露劑量及致癌 風險之相關性，其相關係數 r 為 0.5269。 圖十一、十二及十三分別為抽煙年數與 HEV 值、暴露劑量及致 癌風險之相關性，相關係數 r 為 0.277。 圖十四、十五及十六分別為抽煙包年與 HEV 值、暴露劑量及致 癌風險之相關性，相關係數 r 為 0.4381。. 四、品質管制 本研究之分析方法是以 isotope dilution 之方法，因標準品與內標 為同位素，分析前後損失之量會相同，即兩者比值不變，故本研究不 需要計算回收率。 樣本再現性情形，則隨機取 5 個樣本測量 HEV 濃度兩次，其平 均值、標準差及 CV 值如表十四。. 33.
(43) 伍 討論 一、分析方法 分析體內 HEV 之方法最早是由 Edman (61) 提出，但於 1986 年 Törnqvist 則 提 出 modified Edman degradation method ， 以 pentafluorophenyl isothiocyanate(PFPITC)取代原本之衍生藥劑 phenyl isothiocyanate，提高檢測之敏感度。而大多皆以 GC/MS 偵測 HEV， GC/MS 之離子源包括 NCI（negative chemical ionization） 及 EI（electron impact） ，因 HEV 衍生物（HEV-PFPTH）為親電性物質，易接受電 子，故使用 NCI 偵測 HEV 之敏感度會較 EI 為高。Angerer(1998) (24) 之研究以 PCA (DL-pipecolic acid)為內標，並以 GC/MS 之 EI 模式針對 暴露到 EO 的人員進行偵測，因暴露濃度皆較一般人為高（0.2-8.5 ppm） ，結果發現暴露到 EO 者體內之 HEV 濃度（5,219-32,738 pmol/g） 比非暴露者（518-3,321 pmol/g）高出 10 倍之多，而 Mowrer (45) 以相 同方法偵測職業暴露 EO 者體內之 HEV 值，發現以 GC/MS 之 EI 模 式偵測，其偵測極限為 20 pmol HEV/g Hb 。而之前本研究亦嘗試以 GC/MS-EI 分析，但因其敏感度較低，圖譜中標準品的信號結果並不 理想，故改使用 GC/MS 之 NCI 模式進行偵測。 國外文獻之研究(9,44)大多以 GC/MS 之 NCI 模式進行分析，使用 的內標為 2d 4EO 與血紅素反應後之產物，即 2d4HEV，此方法之偵測 極限可至 1-5 pmol HEV/g Hb (45) ，而本研究樣本最低可偵測到 6 pmol HEV/g Hb。 本研究之樣本以冷凍乾燥的方式處理後，保存於-80℃下，樣本 保存條件與其他文獻(33) 相符。而文獻中(65) 指出，以冷凍乾燥處理之樣 本保存於-20℃下數年，HEV 值皆能維持穩定。另外，圖二為空白實 驗之圖譜，由圖中可知本研究並沒有被其他物質污染。 34.
(44) 二、分析結果 (一) HEV 濃度與抽煙之相關 本研究之結果發現，非抽煙者體內之 HEV 值為 58.3 pmol/g Hb ， 抽煙者為 205.9 pmol/g Hb，抽煙者與非抽煙者之 HEV 值達統計上顯 著差異(p<0.0001)，且抽煙者比非抽煙者高出 4 倍之多(如表三)。 Törnqvist(1986)(2) 之 研 究 指 出 ， 非 抽 煙 者 為 58±25 pmol HEV/g globin，抽煙者 HEV 濃度為 389±138 pmol/g globin，而 Bader(1995) (10) 之研究結果，非抽煙者 HEV 為 46 pmol HEV/g globin，抽煙者為 171 pmol/g globin，Muller (1998) (47) 表示抽煙者與非抽煙者 HEV 值相差 5 倍，本研究之結果皆與過去文獻值一致，證實抽煙者與非抽煙者體內 之 HEV 值有顯著差異，且 HEV 值可作為評估長期抽煙之生物指標。 然而，非抽煙者體內之 HEV 值最高達 325 pmol/g Hb，其原因為體內 HEV 來源除了抽煙外，尚有少部分來自二手煙之暴露、空氣污染及 內生性來源。而將抽煙者之香煙種類分為國內及國外煙後，發覺抽國 內香煙者體內之 HEV 值比抽國外香煙者高，但沒有達統計上顯著差 異，顯示國內香煙與國外香煙之 EO 含量並沒有明顯差異。 而本研究針對研究對象之家人及同事抽煙情形調查，為了解其暴 露於二手煙之情形，表七、表八中控制抽煙變項後，發現只有抽煙者 之家人抽煙與否與 HEV 值達統計上顯著差異(p=0.0131)，此結果顯示 二手煙之來源很多，除了家中及工作場所外，可能尚有其他來源，如 公共場所、室內外之空氣污染等，故僅由家人及同事之抽煙與否探討 研究對象之暴露二手煙情形可能仍無法完全代表其暴露二手煙情 形。但不論抽煙與否，家中有成員抽煙者其體內之 HEV 值，皆比家 中無人抽煙者之 HEV 值有偏高之趨勢，可能因為工作場所有空調， 且家中空間較工作場所小許多，故若有家人抽煙，二手煙暴露情形較 同事抽煙顯著，而僅有抽煙者中家人是否抽煙與 HEV 值有顯著相 35.
(45) 關，可能因為有抽煙習慣者，平常會與家人一起抽煙，而非抽煙者反 而會限制家人在家中抽煙。 Bailey(1988) (46) 之研究結果表示，每天抽煙支數與 HEV 值之相關 性為 7.1 pmol HEV/g globin/cig.，且抽煙支數與 HEV 值間之相關係數 r 為 0.537(p<0.01)，Bader(1995) (10) 亦指出抽煙與 HEV 相關為 11 pmol HEV/g globin/cig.，而 Törnqvist(1992) (42)表示 HEV 值與每天抽煙支數 間沒有顯著相關，但其相關性為 9.4 pmol/g globin/cig.。由表九、表十 二 之 結 果 發 現 每 天 抽 煙 支 數 與 HEV 值 間 達 統 計 上 明 顯 相 關 (p<0.0001)，與文獻之結果相符，但本研究中抽煙者平均每天僅抽 12.7 支煙，且半數以上每天皆抽 10 支煙以下，與文獻中平均每天抽 20 支 煙以上(2) 有些差距。另外，本研究中每天抽煙支數與 HEV 值之相關 為 8.8 pmol/g globin/cig./day，與過去文獻結果差異不大。抽煙者之抽 煙年數及抽煙包年與體內 HEV 值皆有顯著相關(p<0.0001)，證實 HEV 值在體內具有生物累積效應，為評估長期暴露良好之生物指標。但不 論針對非抽煙者及抽煙者而言，其 HEV 值變異皆不小，可能因為人 體內有內生性來源，且個人感受性不同之緣故。 根據表十三之複迴歸分析，其中只有抽煙與否、每天抽煙支數與 體內 HEV 值達統計上顯著相關，證實抽煙與 HEV 值間有顯著相關， 且解釋力(R2=0.3603)達統計上顯著意義。. 36.
(46) (二) 暴露劑量與抽煙之相關 本研究結果發現，抽煙者之 EO 暴露劑量比非抽煙者高出近 4 倍，兩者間達統計上顯著相關(p<0.0001)。因劑量計算公式是參考文 獻中之參數值求得的，與 HEV 值有顯著相關者，與暴露劑量皆有顯 著相關，及每天抽煙支數、抽煙年數及包年皆明顯與暴露劑量達統計 上顯著相關(p<0.0001)。結果顯示抽煙者所暴露到之 EO 劑量會比非 抽煙者高，即非職業暴露者，EO 之暴露來源主要來自於抽煙。. (三) 致癌風險與抽煙之相關 本研究結果發現，抽煙者因抽煙暴露到 EO 所造成之癌症風險值 比非抽煙者高出 3 倍多。而癌症風險是由暴露劑量計算求得，故與暴 露劑量相關者，亦會與癌症風險相關，即每天抽煙支數、抽煙年數及 包年與致癌風險皆達統計上顯著相關(p<0.0001)。Törnqvist(56) 指出長 期暴露於 1-10 pmol N-alkylvaline/g globin 會 造 成 癌 症 之 風 險 為 10-6-10-5，本研究是以文獻中之參數帶入[34]式中求得，而求出之風險 值與 HEV 值之關係，與文獻之結果相差不多。 本研究所求得抽煙者之平均致癌風險較一般人(10-6) 高出 100 倍，而非抽煙者也高出 10 倍，可能原因除了外在暴露及內生性所產 生之 HEV 外，環境中尚有許多致癌物質。. 37.
(47) 陸 結論與建議 一、結論 1. Modified Edman Degradation Method 能敏感測定體內 HEV 之含量。. 2. 本研究所測得非抽煙者之 HEV 值為 58.3 pmol/g Hb ，抽煙者為 205.9 pmol/g Hb，結果與過去文獻相符，而抽煙者體內之 HEV 值 明顯比非抽煙者高出 3 倍多，證實 HEV 為評估因抽煙暴露到環氧 乙烷良好之長期生物指標。. 3. 本研究以 HEV 值計算體內環氧乙烷劑量，進而估算外在環氧乙烷 暴露之劑量及個人致癌風險，發現抽煙者之暴露劑量及致癌風險 皆明顯較非抽煙者為高，表示非職業暴露 EO 者，其 EO 暴露主要 來源為抽煙，且長期抽煙會使癌症發生率增加。. 二、建議 本研究主要針對抽煙與非抽煙者進行探討，未來可針對環氧乙 烷職業暴露收集更多研究樣本，建立國人體內HEV濃度值之資料。. 38.
(48) 柒. 參考文獻. 1. 行政院衛生署86年之統計資料。 2. Törnqvist, M., Osterman-Golkar, S.,Kautiainen, A., Hensen, S., Farmer, P.B., and Ehrenberg, L., Tissue doses of ethylene oxide in cigarette smokers determined from adduct levels in hemoglobin, Carcinogenesis 7: 1519-1521, 1986. 3. Hagmar, L., Mikoczy, Z., and Welinder, H., Cancer incidence in Swedish sterilant. workers. exposed. to. ethylene. oxide,. Occupational. and. Environmental Medicine 52: 154-156,1995. 4. Toimothy R. Fennell, Biomarkers of exposure and susceptibility: Application to ethylene oxide, CIIT Activity, Chemical Industry Institute of Toxicology 16(11): 1-8, 1995. 5. Norman S.A., Berlin J.A., Soper K.A., Middendorf B.F., and Stolley P.D., Cancer incidence in a group of workers potentially exposed to ethylene oxide, International Journal of Epidemiology 24(2), 1995. 6. Ribeiro, L., Salvadori, D., Rios, A., Costa, S., Tates, A., Törnqvist, M., and Natarajan, A., Biological monitoring of workers occupationally exposed to ethylene oxide, Mutation Research 313: 81-87, 1994. 7. Shore, R.E., Gardner, M.J., and Pannett, B., Ethylene oxide: an assessment of the epidemiological evidence on carcinogenicity, British Journal of Industrical Medicine 50: 971-997, 1993. 8. Hemminki, K., Mutanen, P., Saloniemi, I., Niemi, M.L., and Vainio, H., Spontaneous abortions in hospital staff engaged in sterilising instruments with chemical agents, British Medicine Journal 285: 1461-1463, 1982. 9. Törnqvist, M., Mowrer, J., Jensen, S. and Ehrenberg, L., Monitoring of environmental cancer initiators through hemoglobin adducts by a modified Edman degradation method, Analytical Biochemistry 154: 255-266, 1986. 10. Bader, M., Lewalter, J., and Angerer, J., Analysis of N-alkylated amino acids in human hemoglobin: evidence for elevated N-methylvaline levels in smokers, Int. Arch. Occup. Environ. Health 67: 237-242, 1995. 39.
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(55) 表一 問卷基本資料 人數(N). %. 性別 男 女. 105 57. 64.8 35.2. 23 歲以下 23-35 歲 35 歲以上 抽煙習慣 有 無 戒煙 喝酒 有 無 戒 喝茶 有 無 戒 喝咖啡 有 無 戒 飲食習慣 素食 葷食 交通工具 機車 轎車 走路 其他 交通時間 10 min 以下 10-30min 30 min 以上. 34 73 55. 21.0 45.0 34.0. 70 88 4. 43.2 54.3 2.5. 37 123 2. 22.8 75.9 1.3. 71 89 2. 43.8 54.4 1.8. 43 117 2. 26.5 72.2 1.2. 2 160. 1.2 98.8. 86 71 4 1. 53.1 43.8 2.5 0.6. 50 74 34. 31.6 46.8 21.6. 年齡. 46.
(56) 表二 抽煙與其他變項之相關. 性別 男 女 年齡 23 歲以下 23-35 35 歲以上 每天抽煙支數 0 1-10 10 支以上 家人抽煙人數 0 1-5 同事抽煙人數 0 1-5 6-10 11-20 交通時間 10 min 以下 10-30 min 30 min 以上 喝酒 無 有 喝咖啡 無 有 喝茶 無 有. 抽煙者 N (%). 非抽煙者 N (%). 60 (85.7) 10 (14.5). 42 (47.7) 46 (51.7). 10(14.3) 40(57.1) 20(28.6). 24(27.3) 31(35.2) 33(37.5) 88. 39 (55.7) 31 (44.3). p值 <0.0001. 0.9163. NA. <0.0001. 15 (22.1) 54 (77.9). 58 (65.2) 31 (34.8). 17 (25.0) 46 (66.2) 5 (7.4) 1 (1.5). 61 (68.5) 19 (22.5) 6 (6.7) 2 (2.3). 19(27.1) 37(52.9) 14(20.0). 31(35.2) 37(42.1) 20(22.7). 46 (66.7) 21 (30.4). 75 (84.3) 14 (15.7). 0.0008. 54 (78.3) 13 (18.8). 60 (67.4) 29 (32.6). 0.6445. 38 (55.1) 31 (44.9). 51 (57.3) 38 (42.7). 0.1172. 47. <0.0001. 0.8312.
(57) 表三 各變項與 HEV 值之比較 HEV 值 (pmol/g Hb) 年齡 23 歲以下(N=32) 23-35 歲(N=67) 35 歲以上(N=50) 交通時間 10 min 以下(N=48) 10-30 min(N=68) 30 min 以上(N=33) 交通工具 轎車(N=77) 機車(N=68) 走路(N=3) 喝酒 無(N=114) 有(N=33) 喝茶 無(N=81) 有(N=68) 喝咖啡 無(N=110) 有(N=39) 飲食習慣 素食(N=2) 葷食(N=147) a. 106.2±111.9a 140.1±132.4 132.1±141.4 114.8±125.7 151.1±144.5 109.2±105.0 116.9±127.6 147.0±135.8 117.9±133.2. p value. 0.4623. 0.971. 0.4684. 127.8±134.3 140.4±125.3. 0.8049. 117.0±107.7 145.8±154.1. 0.1827. 136.3±137.4 112.6±111.7. 0.3339. 188.1±211.8 129.3±130.8. 0.5312. 平均值±標準差. 48.
(58) 表四 抽煙與 HEV 值之比較 變項 HEV 濃度 (pmol/g Hb) 暴露劑量 Dexp (ppm⋅h) 風險(x 10-6). 非抽煙(N=77). 抽煙(N=69). p. 58.3±45.6 a. 205.9±151.4. <0.0001. 259.2±202.8. 915.1±673.0. <0.0001. 41.5±32.5. 146.4±107.7. <0.0001. a. 49. 平均值±標準差 * HEV: N-(2-hydroxyethyl)valine. 表五 抽煙者之香煙不與 HEV 值之比較 變項 HEV 值 (pmol/g Hb) a. 國內香煙 (N=29). 國外香煙 (N=40). p. 227.0±164.4a. 190.6±141.5. 0.3289. 平均值±標準差 * HEV: N-(2-hydroxyethyl)valine.
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