第三章 第三章 研究結果 研究結果 研究結果 研究結果
1. 找到與 Pir51 有交互作用的蛋白質
篩選 菌落數
生長在沒有 3-AT 培養皿上 57371
最初生長在低濃度 3-AT 培養皿上 345
最終生長在高濃度 3-AT 培養皿上 124
圖 6 用細菌雙雜交系統篩選的結果。將 pBT-Pir51 與 pTRG-cDNA library co-transformation，生長在含(LB-Tetracycline-5mM 3AT)的培養 皿上，經過三次重複生長在(LB-Tetracycline-5mM 3AT)的培養皿上，
從最初的 345 個菌落到最後確定共有 124 個菌落(圖 6，表 1)，並將 這些菌落交由明欣生物科技公司進行定序，之後在 NCBI 上以 BLAST 搜尋此 124 個與 Pir51 有交互作用的基因，發現這 124 個基因可分類 成 5 種不同的機制，分別是: 細胞骨架(cytoskeleton)、轉錄因子 (transcription factors)、酵素(enzyme)、細胞凋亡路徑(apoptosis pathway)，以及細胞週期(cell cycle)(表 2)。
2.確定 Pir51 與 CDC20 有蛋白質間的交互作用
經過搜尋 124 種與 Pir51 有交互作用的基因之後，由於 CDC20 主要存在於細胞週期 M 期，且調控細胞表現的關聯性與 Pir51 最 相近，因此選擇 CDC20 做為主題。為了確定 CDC20 與 Pir51 有蛋 白質與蛋白質間的交互作用，首先使用免疫共沉澱-西方點墨法確 定 CDC20 與 Pir51 是否真的有交互作用 (圖 7)。
圖 7 以免疫沉澱-西方點墨法來確定 Pir51 與 CDC20 有交互作用。Lane1 : HeLa 細胞的總蛋白(total protein)，
Lane2 : 做免疫沉澱時不添加 Pir51 抗體。Lane3 : 做免疫沉澱時加 入 Pir51 抗體。西方點墨法時以 CDC20 抗體來認，確定 Pir51 與 CDC20 有交互作用。
3. 以免疫染色法確定 CDC20 與 Pir51 之間有交互作用。
圖 8 CDC20 以及 Pir51 在免疫螢光顯微鏡下的分布情形。綠 色螢光是 CDC20，紅色螢光是 Pir51，藍色是 DAPI，可染細胞核，
而右下角是聚集(merged)的結果。
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4. CDC20 與 Pir51 有交互作用的區域( CDC20 interacting domain) 在使用 BacterioMatch-two hybrid 這個系統發現 CDC20 與 Pir51 有交 互作用之後，經過 NCBI 的 BLAST 搜尋，發現 CDC20 會與 Pir51 有 交互作用。為了進一步知道 CDC20 與 Pir51 彼此交互作用的關係，
我們從 CDC20 之 5’端開始，設計了長度 400 個鹼基對以及 500 個鹼 基對的 DNA，以及 CDC20 的 WD-40 repeats 的部分，另外也設計一 段 CDC20 的全長(1.5Kb)，總共四段，來探討 Pir51 與不同 region 之 CDC20 之間的功能性。由圖 9a 來看，是四條不同長度的 Flag-CDC20 的 total cell lysate，用來確定每段 Flag-CDC20 皆會表現，由左而右分 別是 CDC20 的全長 1500bp、500bp、400bp、WD-40 repeats 共四段。
由圖 9b 來看，可以得到一個結論，Pir51 只會與 CDC20 的全長有交 互作用。
圖 9 探討 CDC20 會與 Pir51 有交互作用的區域。(a)由左至右分別是 四段不同長度 CDC20 的 total protein，分別是 CDC20 全長 1500bp、
從 CDC20 的 N 端 500bp、CDC20 的 N 端 400bp、CDC20 的 WD-40 repeats 995bp，以證明 Flag-CDC20 有表現。(b) 由左至右分別是 (圖 9a)中的四個不同長度的 Flag-CDC20，IP 加入 Pir51，Western 以 Flag-antibody 來偵測，發現 Pir51 會與 Flag-CDC20 的全長有交互作 用。
5. Pir51 會經由 APCCDC20 而被泛蛋白化。
圖 10 Pir51 會經由 APCCDC20 而被泛蛋白化。 (a)左邊是 HeLa 細胞，右邊是有轉染 Flag-CDC20 的細胞，以 ubi-1 抗體來觀察 Pir51 細胞被 ubiquitination 的情形。(b)左邊及右邊皆有轉染 Flag-CDC20 的 細胞，右邊另外添加了 MG132，MG132 是 proteosome 的抑制劑。(c) 以 nocodazole 處理細胞 17 小時後，可以發現細胞週期停在 M 期。(d) Pir51 的序列。(e)以 Ubi-1 抗體來觀察 Pir51 在不同條件下表現的情 形，由左而右分別是:HeLa 細胞、轉染 Flag-CDC20 的細胞、轉染 Flag-CDC20 的細胞並且加入 MG132 處理、轉染 siCDC20 的細胞。
6. DNA 在受損的狀況下 Pir51 與 ATR 之間的關係
ATR 被發現是 Rad51 的其中一個蛋白複合體，而 Pir51 也被發現 是 Rad51 的其中一個蛋白複合體，且型態非常相近，因此也要探討 Pir51 與 ATR 之間的關係。
DNA 在斷裂的時候，ATM 與 ATR 會立即出現在 DNA 受損的位 置，而展開一連串的修補機制。由於 Pir51 與 Rad51 有非常相近的功 能，且 Rad51 在 DNA 受損後，細胞進行同源重組中扮演著重要的修 補蛋白質的機制；又因為 Pir51 在同源重組中也扮演著重要的角色，
因此預期 DNA 在受損之後，ATM 與 ATR 的表現會大量提升，而 Pir51 有參與修補的路徑，因此表現量預期會增加。我們做免疫染色的方 法，在加入 Bleomycin(可使 DNA strand 斷裂)使 DNA 受損的前後，
觀察 ATM,ATR 與 Pir51 的表現。
圖 11 Pir51 與 ATR 在加入 bleomycin 之後在免疫螢光顯微鏡下的情 形。綠色是 ATR，紅色是 Pir51，藍色是 DAPI。(a) 為 Pir51 與 ATR 在細胞內的分布情形。ATR 主要分布在細胞核，Pir51 則分布在細胞 核及細胞質。(b) Pir51 與 ATR 在加入 bleomycin 兩小時之後，重新換 培養液模擬細胞修復放置 2 小時後在免疫螢光顯微鏡下的情形。(c) Pir51 與 ATR 在加入 bleomycin 兩小時之後，重新換培養液模擬細胞 修復 18 小時後在免疫螢光顯微鏡下的情形。(d) Pir51 與 ATR 在加入 bleomycin 兩小時之後，重新換培養液模擬細胞修復 24 小時後在免 疫螢光顯微鏡下的情形。(e)以免疫沉澱-西方點墨法確定 Pir51 與 ATR 之間有交互作用。Lane1 : HeLa 細胞的總蛋白(total protein)，Lane2 : 做免疫沉澱時不添加 Pir51 抗體。Lane3 : 做免疫沉澱時加入 Pir51 抗體。西方點墨法時以 ATR 抗體來認，確定 Pir51 與 ATR 有交互作 用。
7. Pir51 微陣列(Pir51 microarray)
將子宮頸癌細胞(HeLa cell)與將細胞經過轉染後抑制 Pir51 表現的 siRNA 細胞，做 Western blot 確定抑制效果比較好的 siPir51 細胞 (圖 12)。抽取子宮頸癌細胞以及 siPir51 的 RNA，一同交由 Genetech 生 物科技公司進行 array data 的分析。由 data 分析的結果，發現 Pir51 與免疫反應有密切的關係。
圖 12 觀察 Pir51 被抑制的程度。 同時轉染 1 以及 2 的 siRNA 可較明顯降低 Pir51 的表現量。
8. 將 siRNA 以及 HeLa 細胞送至 Genetech 公司做 array 的結果(表 3)。
在確定 Pir51 有被抑制的效果之後，將 HeLa 以及 siPir51 的 RNA 交由 Genetech 公司做 array 分析。
9. Metacore 分析人類全基因表現晶片相關路徑結果
圖 13 MetaCore 分析人類全基因表現晶片相關路徑結果。由此軟體 分析晶片結果後，可以觀察到將 Pir51 knockdown 後會影響與細胞週 期調節相關的基因。