第四章 第四章 討論 討論 討論 討論
本論文以細菌雙雜交系統來篩選與 Pir51 有交互作用的蛋白質，
從結果顯示，經過高濃度的 3-AT 篩選菌落之後，最終發現有 124 個 菌落與 Pir51 有正相關 (圖 6，表 1)，將這 124 個菌落分別進行定序 (sequencing)以及在 NCBI 上做 BLAST 搜尋之後，發現這 124 個基因 可分類成 5 種不同的機制，分別是: 細胞骨架(cytoskeleton)、轉錄因 子(transcription factors)、酵素(enzyme)、細胞凋亡路徑(apoptosis pathway)，以及細胞週期(cell cycle)(表 2)。
由於 Pir51 可受細胞週期的調控，並且在近年來，在許多癌症細胞 中會有高度表現，舉凡肝癌細胞，急性骨髓白血病，以及具侵襲性的 淋巴瘤， Pir51 都會大量表現。Pir51 會受細胞週期的調控，且在 M 期中也會出現。因此，選擇 CDC20 來探討 Pir51 與 CDC20 在生物體 內扮演的角色，我們認為是值得探討的。
為了確定當初從細菌雙雜交系統選出的 CDC20 菌落與 Pir51 會有 正相關的關係，我們利用免疫沉澱-西方點墨法以及免疫螢光顯微鏡 來證實 Pir51 與 CDC20 之間的關係。從結果顯示，由免疫沉澱-西方 點墨法可確定 Pir51 與 CDC20 有交互作用(圖 7)；在免疫螢光顯微鏡 底下，可看到 Pir51 與 CDC20 分布在相同的位置，即有共位
(colocalization)的現象(圖 8)。
從圖 7 及圖 8 確定 Pir51 與 CDC20 有交互作用之後，接著想知道 CDC20 會與 Pir51 交互作用的區域(interacting domain)，因此，我們 設計了四段不同長度的 CDC20，分別是 CDC20 全長 1500bp、從 N 端算起 500bp、從 N 端算起 400bp、以及 CDC20 的 WD-40 repeats 區 域。
為了讓這四段不同長度的 CDC20 能夠大量表現，將這四段不同長 度的 CDC20 分別連接到含有 flag 的 pcDNA3 載體，以便在進行轉染 實驗的時候大量表現。為了確定不同長度的 flag-CDC20 能夠表現，
首先轉染四段不同的 flag-CDC20 片段到 HeLa 細胞中，並且以西方 點墨法來確定這四段 flag-CDC20 的蛋白質(total protein)可以表現(圖 9a)。確定 flag-CDC20 可以表現之後，再以免疫沉澱-西方點墨法來看 不同片段的 flag-CDC20 是否會與 Pir51 有交互作用，由結果來看，
Pir51 僅會與 flag-CDC20 的全長有交互作用(圖 9b)。由此推判 Pir51 與 CDC20 的二級結構必須在很完整的情況下，兩者才會有緊密的關 聯性，任何片段的 CDC20，其結構皆不能與 Pir51 之間有交互作用。
由於CDC20可活化後期組成複合體(anaphase promoting complex；
APC)，而APCCDC20會去標靶(target) securin使得結構損壞，並且使得 separase活化，進而使得cohesin被分離，這是細胞週期M期中，從中 期變成晚期的過程。
在中期變成晚期的過程之中，許多細胞週期素(cyclins)以及細胞週 期調節者(regulators)會被泛蛋白所標靶而導致降解，這個過程稱為泛 蛋白化。Pir51以及CDC20都是細胞週期的調節者，探討兩者在細胞 週期的M期扮演的腳色，變得很重要。被泛蛋白化的蛋白質，最終會 被送至巨大的蛋白酶體所辨識並且摧毀。
本研究將細胞轉染可大量表現的flag-CDC20來觀察Pir51被泛蛋白 化的現象。由結果顯示，Pir51細胞可被大量表現的flag-CDC20泛蛋白 化 (圖10a)。MG132的使用，可以抑制蛋白酶體將被泛蛋白化的蛋白 質分解掉，由結果顯示，細胞轉染過Flag-CDC20，在加入MG132後，
可有效的抑制細胞被泛蛋白化(圖10b)。
大部分APC/C的受質，會含有一個或者兩者皆有的元素，一個是 destruction box (D box) (Zachariae, 2004)，另一個是KEN box(Pfleger and Kirschner, 2000)，含有這兩個元素的蛋白質，很容易經由APC/C 的路徑被泛蛋白化(Qi and Yu, 2007)。經由搜尋了Pir51蛋白質的序 列，發現Pir51含有三個Destruction box (圖10c)，因此推論Pir51會經由
APCCDC20 的途徑被泛蛋白化。
CDC20在細胞週期的M期中扮演著不可或缺的腳色，為了讓細胞 同時停止在M期，將細胞以Nocodazole來處理；Nocodazole可隨著處 理時間的長短最終將細胞週期停滯在M期中的中期 (圖10d)。
細胞以Nocodazole處理停留在M期後，做西方點墨法實驗，以 Ubiquitin-1抗體觀察APCCDC20與Pir51在M期中表現的情形，由結果可 知，當細胞轉染Flag-CDC20之後，會比正常細胞(HeLa)容易使Pir51 被泛蛋白化，而細胞轉染Flag-CDC20之後再加入蛋白酶體抑制劑 MG132處理六小時之後，與沒有添加MG132處理過的相比，可發現 Pir51並不會被泛蛋白化；另一方面，若將CDC20降解掉，亦不會使 Pir51被泛蛋白化(圖10e)。
本研究已經證明 CDC20 是 Pir51 蛋白質複合體的其中一個蛋白 質，且經過實驗證明 Pir51 會被 APCCDC20所標定而被泛蛋白化。
Pir51 已知與同源性重組的修補有關連性，且在許多癌細胞中會高 度表現；而 ATR 蛋白質不但在 DNA 受損時會立即活化，還會活化 下游的修補蛋白質，這些修補蛋白複合體會促使細胞做一些立即性的 反應，像是使細胞週期停止，或是使細胞走向死亡。探討 Pir51 與 ATR 在 DNA 受損的情況下的表現，也是個有趣的課題。
要研究 Pir51 與 ATR 是否在 DNA 受損時候有任何表現之前，本研 究也是先以免疫沉澱-西方點墨法以及免疫螢光染色法來證明 Pir51 與 ATR 之間是有關聯性的。從免疫沉澱-西方點墨法來看，Pir51 與 ATR 確實有交互作用(圖 11e)。在免疫螢光染色法實驗中，可看到 ATR 均勻分布在細胞核內，屬於核蛋白；而 Pir51 則均勻分布於細胞核以
及細胞質中，由結果來看，Pir51 以及 ATR 有共位(colocalization)的 現象，因此亦可證明 Pir51 與 ATR 之間有關聯性(圖 11a)。
ATR 在 DNA 受損時，可迅速活化至受損的部位，並引發一連串的 修復反應。經由添加 bleomycin 這個抗生素，bleomycin 可誘發 DNA 雙股螺旋斷裂，因此可模擬 DNA 受損的狀況。將細胞以 bleomycin 處理兩小時後，再重新加入培養液兩小時、十八小時、以及二十四小 時的修復時間。會選擇這些時間的原因，在於 ATR 在 DNA 受損之 後，可迅速活化，而 Pir51 大約要十二小時之後，才會開始進入細胞 做修復的動作，因此才會挑選修復時間兩小時、十八小時、以及二十 四小時來觀察 ATR 與 Pir51 在 DNA 受損時候的互動情形。細胞以 bleomycin 處理兩小時之後，再以新的培養液處理兩小時，可看到 ATR 在細胞的核內有一點一點的亮點(foci)，這些正是因為 DNA 雙股螺旋 斷裂，而 ATR 立即活化並聚集至 DNA 受損處的原因。此時的 Pir51 與控制組相比還尚未有明顯變化 (圖 11b)。細胞以 bleomycin 處理兩 小時，再以培養液處理十八小時之後，可看到 ATR 在細胞核內很聚 集，並且產生明亮的亮點，此時的 Pir51 開始大量表現，並且出現在 ATR 所聚集的位置，有共位的現象(圖 11c)。細胞以 bleomycin 處理 兩小時，再以培養液處理二十四小時之後，可看到 ATR 的表現已趨 於平緩，並沒有像圖 11b 以及圖 11c 這麼明顯的亮點聚集在 DNA 受
損的位置。此時的 Pir51 與圖 11c 相比，有更明顯的聚集在 DNA 受 損的位置(圖 11d)。
由免疫螢光顯微鏡(immunostaining)來觀察 Pir51 與 ATR 在加入 bleomycin 處理之後的表現，由結果得知，DNA 在受損的時候，ATR 可立即活化並且聚集至受損處表現，十八小時之後，活性便會慢慢降 低。Pir51 在 DNA 受損的初期，並沒有明顯的反應，在修復十八小時 的時候，活性已經開始增加並且表現，在修復二十四小時之後，Pir51 的表現量越來越強，聚集在 DNA 受損的位置。因此推論 Pir51 有參 與 ATR-dependent pathway，並且在 DNA 修補方面佔有重要的腳色。
Pir51 不僅參與 ATR-dependent pathway，在 DNA 修補機制中扮演 著重要的腳色。另一方面，本研究也發現 Pir51 會經由 APCCDC20的路 徑被泛蛋白化。 APCCDC20具有泛蛋白化的功能，可將一些用不到或 摺疊錯誤或是有害的蛋白質清除掉，且泛蛋白－蛋白酶體系統所控制 之蛋白分解，調控許多重要之細胞功能。因此，有關於 Pir51、ATR、
以及 CDC20 在生物體內的角色及關聯性，是一個好的研究方向。
另一方面，本研究將子宮頸癌細胞(HeLa cell)與將細胞經過轉染 後抑制 Pir51 表現的 siRNA 細胞，做 Western blot 確定抑制效果比較 好的 siPir51 細胞(圖 12)，之後抽取子宮頸癌細胞以及 siPir51 的 RNA，一同交由 Genetech 生物科技公司做 array data 的分析(表 3)。
分析的結果，發現 Pir51 與免疫反應有密切的關係，並且由 Metacore 軟體可得知 Pir51 的增減會影響細胞週期路徑的調控(圖 13)。
Pir51 已知高度表現在一些癌細胞中，像是肝癌細胞，急性骨髓白 血病，以及具侵襲性的淋巴瘤，都是 Pir51 會大量表現的地方。關於 Pir51、CDC20 以及 ATR 在這些癌細胞中所扮演的腳色，以及在細胞 週期中的影響，將是本研究未來研究的重點。