隔板理論
層析領域中，許多解釋區帶擴張的理論被提出來表現和管柱變數 相關的ㄧ些變數對板高的關係，其中包含 Martin 和 Synge 所提的板 論(plate theory)[3]，他們將層析管柱視為類似蒸餾塔，由無數不連續 但相鄰的薄層所組成，在每一平板上，假設平衡會發生於物種分佈於 動相和靜相間，在管柱內分析物的下移即視為平衡的動相由一平板至 另一平板作階梯式的轉移。並不斷形成新的平衡。而此薄層高度即為 板高(plate height，H)，將管柱長度除上板高即為理論板數 N，此兩數 值為評估管柱效能常用的參數。一個層析管柱的塔板數越多，則其分 離效果就越好。
H 與 N 常被使用來評估管柱效能，H 值越小 N 值越大，代表管 柱效能越好。提升層析分離效能的方法可藉由改變溶劑組成來操控 k 值大小，對樣品k 值做最適化調整。在逆相層析中，靜相是疏水的碳 氫化合物，溶質與靜相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏 水相互作用，因此溶劑的強度隨著極性增加而降低。水是極性較強的 溶劑，也是逆相層析中較弱的溶劑。在逆相層析中常常用和可以與水 互溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相。逆相層析中最常用的有
機溶劑有甲醇和乙腈，因此，甲醇或乙腈佔動相組成比例越高，樣品 能更快流出，動相的沖提能力也就越強。操控過程可搭配等位或梯度 沖提，來達到提升分離效率的目標。文獻提及[4]，通常利用梯度沖 提可大大提高分離效率，使用二種(或更多種)溶劑，其極性極為不同，
但可互溶，在開始沖提後，二溶劑之比值以漸進方法改變為沖提能力 較強的動相，有時是連續式的改變，有時是一系列步驟的改變溶劑比 值。常見有二種沖提模式:
1. 階梯式沖提(stepwise elution)
此種沖提方法為先使用沖提能力較低的動相沖提一段時間，而在某一 時間，瞬間將動相變化為沖提能力較強的動相，減少分析時間(如圖 2-1所示)，此種沖提方法常用在分離蛋白質上[5]，將要被純化的目標 物之抗體鍵結在固態物質表面上，藉由改變移動相的特性而將它們層 析分離之，在此沖提條件下，目標物及其類似物會被固定相吸附，其 他雜質被沖出管柱，隨後改變沖提條件，將目標物及其類似物逐一沖 出管柱，同時達到萃取、純化、分離及檢測目標物及其類似物的目的。
圖2-1 階梯式沖提示意圖
動相從沖提能力較弱的動相A 在 2 分鐘後瞬間變化為沖提能力較強 的動相B
2. 連續式沖提(Continuous elution)
此種沖提方法為先使用沖提能力較低的動相沖提一段時間，而在 某一時間，將動相線性的變化為沖提能力較強的動相，減少分析 時間(如圖 2.2 所示)，此種沖提方法常用在分離天然物分離上[6-7]
圖2-2 連續式沖提示意圖
動相從沖提能力較弱的動相A 在 2 分鐘後以線性方式變化為沖提能 力較強的動相B
使用梯度沖提目的在於縮短管內化合物的滯留時間(retention
time)，其優點如下:
1. 增強混合物的全面分離能力 2. 全部的分析時間可以顯著的減少 3. 改善層析圖譜上的波形
4. 增加靈敏度
然而文獻中提到[2]，在梯度沖提等非線性層析系統中，以時間 單位為定義的H 與 N 值並不適用，其主要原因來自於式 1-3~1-6 是一 建構在樣品移動速度固定之下發展而成的公式，但在非線性層析系統 中，由於動相組成隨時間改變，樣品會隨著不同時間下受到不同溶劑 強度影響，而使樣品移動速度有所改變，導致式 1-3~1-6 無法使用。
必須將此層析公式作修正才能獲得較正確的H 或 N 值。
Snyder 等人發表一系列有關於梯度液相層析法的理論模擬系統 [8]，提到當在進行非線性層析系統時，動相的組成變化，會使空間 中的波寬發生變化，當後端動相使用沖提能力較強的動相時，樣品會 在兩動相交界面處，因前後端動相對樣品作用力不同，而使樣品在前 後端動相中的移度速度不同，處於管柱出口端沖提能力較弱動相中的 樣品分子，移動速度比起處於管柱入口端的的樣品分子慢，而造成交 界面後端樣品擠壓的現象，產生空間樣品在動相交界面處波寬變窄，
等後端動相完全通過樣品後，空間樣品波寬再隨時間漸漸變寬的情形，
如圖2-3 所示。
圖2-3 層析波峰壓縮發生在動相交界面處示意圖
樣品在動相交界面，由於後面動相中的樣品產生擠壓的情形而使樣品 波寬變窄，此種樣品在動相交界面處波寬先變窄而後再漸漸變寬的現 象，稱之為層析波峰壓縮效應(peak compression effect)，在後來 Tamura 等人以 CCD 攝影鏡頭來記錄螢光樣品在玻璃層析管柱中分離過程，
也發現有這個情形[9-10]，文獻[8]提及此效應對理論板數的計算也會 有所影響，而後 Snyder 等人對層析波峰標準偏差以及理論板高進行 修正[8,11-12]，且在文獻[13]特別對層析波峰壓縮效應進行板數探討 與修正，並使用ㄧ些常見偵測器來佐證其模擬數據。Yamamoto 亦發 表一系列不同沖提模式下的板高修正理論[14-17]。然而以上文獻發表
時，文獻中的公式包含大量的公式運用以及條件參數，相當複雜且艱 澀難懂，在應用上須考量許多參數以及運用大量數值模擬軟體。而很 多分析領域的學者專心致力於開發新的分析技術及應用，對於理論公 式的發展及推導並不熟悉，所以導致傳統公式定義在這方面的疏失，
仍有ㄧ些學者沒注意到[18-25]，依舊使用傳統板高及板數的定義的公 式1-3~1-6 計算非線性層析系統條件下的實驗結果，以表現管柱效率，
在非線性條件使用式 1-3~1-6，理論板數與板高會被錯估，造成管柱 效率大幅提高的假象。
如前所述，使用式1-2 所計算的理論板數 N*才是正確的，在以上 所提文獻[8,11-13]，在非線性層析板數探討中，並沒有直接觀測樣品 在管柱空間分布情形，故無法計算正確的理論板數 N*，以至於無法 驗證其公式的正確性，且所提出的公式須要考量許多參數，以及運用 大量的數值模擬軟體。綜合以上所提，本研究藉著設計一系列非線性 沖提模式，然後以全管柱偵測系統(WCD)觀察樣品空間與時間的層析 行為，計算正確的理論板數 N*