第二章 材料與方法
2.5 磁性微胞之體外(In vitro)實驗
KB (Human carcinoma cell line)培養於含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及 100μg/ml 鏈黴素(streptomycine) 和 100U/ml 青黴素(penicillin) 的RPMI medium 1640 (Gibco BRL, Paris, France)的 生長液，在含有 5% CO2，37℃的細胞培養箱中。
圖2.5 KB細胞
A549(Human lung carcinoma cell line)培養於含有10% 胎牛血清 及100μg/ml 鏈黴素和100U/ml 青黴素的RPMI medium 1640 的生長 液，在含有5% CO2，37℃的細胞培養箱中。
2.5.2 細胞毒性測試
個別取5 × 103cells/well KB、A549 細胞培養於100 μl/well的生長 液中，分別置入96 孔培養盤，培養於37℃，5% CO2，24小時後，加 入100μl 兩種磁性微胞以及乘載Nile Red之磁性微胞的培養液(濃度 為5~1000μg/ml)，再繼續培養24小時。待各培養時間到達時，每孔加 入50μl MTT 培養3 小時後，離心1500rpm 5 分鐘，小心抽離上清液，
加入DMSO 100μl/well 均勻震盪15 分鐘，以酵素免疫分析儀讀取波 長595 nm 之吸光值為測定值。細胞存活率計算公式，如下所示：
細胞存活率(%)＝（OD595（實驗組）/OD595（控制組））× 100
2.5.3 葉酸調控之細胞胞噬測試
1. 實驗前兩天將培養瓶內的 KB 細胞培養基換為不含葉酸的 RPMI medium 1640。實驗前一天將細胞用胰蛋白脢(trypsin)切下，加入 10ml 磷酸鹽緩衝液（Phosphate Buffered Saline, PBS）離心去除殘 餘的胰蛋白脢，再以3×105 cells/well 的密度培養於六孔培養盤。
2. 一天後待細胞貼附培養盤後，將培養基置換新鮮不含葉酸的 RPMI medium 1640。
3. 接著用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製濃度為 50μg/ml 乘載 Nile Red 的磁性微胞溶液，加入細胞一同置於恆溫培養箱，分別做 1、3 小時的培養實驗。
4. 胞噬實驗結束後，將培養基抽除，再以含有 2% 胎牛血清的 PBS 清洗細胞三次後以胰蛋白脢將細胞從培養盤切下，並離心去除胰 蛋白脢，最後再以滅菌水回溶細胞，使用流式細胞儀分析胞噬情 形。另外亦取固定細胞數(20 萬顆)，加入 37% 鹽酸溶液，水浴 70℃
下加熱 1 小時，經由原子吸收光譜儀偵測細胞胞噬的鐵含量。
2.5.4 共軛聚焦顯微鏡觀察磁性微胞在細胞內的傳遞
1. 將直徑為 18mm 大小之蓋玻片浸泡於 0.1N H 鹽酸溶液 24 小時，
再以二次水沖洗，並以拭淨紙拭乾浸泡於70%酒精中送無菌無塵操 作台(laminar flow)中備用。
2. 以滅菌過的鑷子將浸於酒精的蓋玻片經過本生燈過火後置入 12 孔培養盤中。再以 2×105 cells/well 的密度將 KB 細胞培養於 12 孔培養盤中的玻片上，培養液為添加10%胎牛血清不含葉酸的 RPMI medium 1640。
3. 經過 24 小時培養後，用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製濃度 分別為50、500μg/ml 乘載 Nile Red 的磁性微胞溶液，接著加入細 胞一同置於恆溫培養箱，做1、3、6、24 小時的培養實驗。
4. 培養結束後，將培養液連同磁性微胞一起抽除，用含有 2%FBS 的 PBS 洗三次後，加入 3.7% 三聚甲醛(paraformaldehyde) 1ml/well 並置入於37℃培養箱中 30 分鐘以固定細胞。隨後吸除三聚甲醛
2.5.5 體外磁振造影實驗
1. 實驗前兩天將培養瓶內的 KB 細胞培養基換為不含葉酸的 RPMI medium 1640。實驗前一天將細胞用胰蛋白脢切下，加入 10mlPBS 離心去除殘餘的胰蛋白脢，再以5×105 cells/well 的密度培養於六 孔培養盤。
2. 24 小時後待細胞貼附培養盤後，用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製鐵濃度為1、2、6、10、20、30、40μg/ml 的磁性微胞溶液，
接著加入細胞一同置於恆溫培養箱，培養3 小時。
3. 胞噬實驗結束後，將培養基抽除，再以含有2% FBS的PBS清洗細 胞三次後以胰蛋白脢將細胞從培養盤切下，並離心去除胰蛋白 脢，最後再以PBS回溶細胞，放進膝蓋線圈(knee coil)以3.0 T之磁 振造影掃描儀掃描所有細胞，掃描條件為：T
2-Fast spin echo，
TR/TE=3000/90。