National University of Kaohsiung Repository System:Item 310360000Q/10478

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(1)國立高雄大學生物科技研究所碩士論文. 製備具標靶葉酸受體診斷及治療的多功能 pluronic® 修飾四氧化三鐵 Folate-Mediated Pluronic® Modified Fe3O4 for Combined Diagnosis and Therapy. 研究生: 林嘉鈞撰指導教授: 陳振興博士. 中華民國九十八年一月.

(2) 謝誌兩年半的研究所很快就結束了，雖然在這期間發生了我人生中重要的事情，但很感謝妳在我心中一直陪伴著我，讓我有力氣走下去。感謝士哲、于倫、鈞瀚、郁翔、宗勳，這一路來的幫忙，從 RT 變 AT，雖然偶爾會很混亂，但是讓我學習到團隊的默契，一起熬夜做 ppt，一起吃鹹酥雞，一起先蜀先魏。感謝怡如、博彥，我實驗上的好助手，總不會拒絕我的要求。感謝筱真、虹育、凱雯、育勝、筱蟬、SEVEN、嫈梓、小艾、秋伶、忠佑、子驊、碩澧、薛覲、美瑜的陪伴、歡樂與搞笑。感謝我的酒友，SOSOMAN、大支總是在週末陪我喝酒，跨年時陪我一起倒數。謝謝愛犬圓圓，我的枕邊人，總是在我很晚回家時還能喜孜孜的跑向我。感謝我的家人，老爸、老媽、老姊、老弟的支持以及鼓勵，很高興能當你們的家人，只要有你們就足夠了，謝謝你們。林嘉鈞謹誌 2009 年 1 月. II.

(3) 目錄中文摘要........................................................................................................................1 英文摘要........................................................................................................................2 第一章前言..................................................................................................................3 1.1 奈米科技.........................................................................................................3 1.1.1 奈米簡介...............................................................................................3 1.1.2 奈米材料的特性...................................................................................4 1.1.3 奈米粒子的應用...................................................................................6 1.2 超順磁奈米氧化鐵.........................................................................................7 1.2.1 超順磁奈米氧化鐵之簡介..................................................................7 1.2.2 超順磁奈米氧化鐵之磁學理論與磁滯曲線....................................10 1.2.3 超順磁奈米氧化鐵表面修飾............................................................13 1.2.4 超順磁奈米氧化鐵在生醫上之應用................................................15 1.3 Pluronic®（PEO-PPO-PEO）.......................................................................20 1.3.1 結構性質............................................................................................20 1.3.2 Pluronic®對於癌細胞之多重抗藥性 .................................................21 1.4 葉酸(Folic acid) ............................................................................................23 1.5 研究動機及目的...........................................................................................25 第二章材料與方法....................................................................................................26 2.1 實驗試劑.......................................................................................................26 2.2 實驗儀器.......................................................................................................27 2.3 材料製備及分析...........................................................................................31 2.3.1 葉酸接枝 pluronic F127 (FA-PF127)................................................31 2.3.2 水溶性四氧化三鐵的製備 (PAAIO) ...............................................32 2.3.3 XRD ....................................................................................................32 2.4 磁性微胞.......................................................................................................33 2.4.1 具標靶葉酸受體的磁性微胞製備 (FA-PF127-PAAIO) .................33 2.4.2 磁性微胞製備 (PF127-PAAIO) .......................................................34 2.4.3 乘載 Nile Red .....................................................................................35 2.4.4 FT-IR...................................................................................................35 2.4.5 UV.......................................................................................................35 2.4.6 DLS .....................................................................................................36 2.4.7 TEM ....................................................................................................36 2.4.8 AAS.....................................................................................................36 2.4.9 SQUID ................................................................................................36 2.5 磁性微胞之體外(In vitro)實驗 ....................................................................37 2.5.1 細胞培養.............................................................................................37 I.

(4) 2.5.2 細胞毒性測試....................................................................................38 2.5.3 葉酸調控之細胞胞噬測試................................................................39 2.5.4 共軛聚焦顯微鏡觀察磁性微胞在細胞內的傳遞............................40 2.5.5 體外磁振造影實驗............................................................................41 第三章結果與討論....................................................................................................42 3.1 材料特性分析...............................................................................................42 3.1.1 FA-PF127 之 1H NMR 鑑定...............................................................42 3.1.2 PAAIO 之 X 光繞射定性測量...........................................................43 3.2 磁性微胞特性分析.......................................................................................44 3.2.1 FT-IR...................................................................................................44 3.2.2 UV.......................................................................................................46 3.2.3 粒徑大小與介面電位........................................................................47 3.2.4 TEM ....................................................................................................49 3.2.5 磁性微胞組成分析............................................................................51 3.2.6 SQUID ................................................................................................53 3.3 體外(In vitro)實驗 ........................................................................................54 3.3.1 細胞毒性測試.....................................................................................54 3.3.2 葉酸調控之細胞胞噬測試.................................................................55 3.3.3 共軛聚焦顯微鏡觀察細胞內傳遞.....................................................58 3.3.4 體外磁振造影偵測............................................................................62 第四章結論................................................................................................................64 第五章參考文獻........................................................................................................66. II.

(5) 圖目錄圖 1.1: 微米至奈米尺度圖 ..........................................................................................3 圖 1.2 磁滯曲線..........................................................................................................11 圖 1.3 以高分子修飾奈米氧化鐵之結構..................................................................14 圖 1.4 多功能生物試劑示意圖..................................................................................14 圖 1.5 乳癌之核磁共振造影......................................................................................15 圖 1.6 藥物引導釋放示意圖......................................................................................16 圖 1.7 磁性標籤標的示意圖......................................................................................17 圖 1.8 溫熱療法示意圖..............................................................................................18 圖 1.9 Pluronic®結構 ....................................................................................................20 圖 1.10 Pluronic®抑制 MDR 癌細胞...........................................................................22 圖 1.11 葉酸結構圖....................................................................................................23 圖 1.12 葉酸受器調控細胞胞噬作用示意圖............................................................24 圖 2.1 實驗流程圖......................................................................................................30 圖 2.2 葉酸接枝 PF127 示意圖 .................................................................................31 圖 2.3 FA-PF127-PAAIO 製備示意圖........................................................................33 圖 2.4 PF127-PAAIO 製備示意圖..............................................................................34 圖 2.5 KB 細胞 ............................................................................................................37 圖 2.6 A549 細胞.........................................................................................................37 圖 3.1 FA-PF127 1H NMR 光譜圖..............................................................................42 圖 3.2 氧化鐵奈米粒子之 XRD 圖譜 .......................................................................43 圖 3.3 修飾過後的磁性微胞 FTIR 光譜圖...............................................................45 圖 3.4 磁性微胞 UV 吸收光譜圖..............................................................................46 圖 3.5 磁性微胞粒徑大小與介面電位......................................................................48 圖 3.6 PAAIO(A)、PF127-PAAIO(B)、FA-PF127-PAAIO(C)、PF127-PAAIO load Nile Red(D)、FA-PF127-PAAIO load Nile Red (E)之 Cryo 穿透式電子顯微鏡影像 ....50 圖 3.7 在 298K 下利用超導量子干涉儀測量 PAAIO 與磁性微胞的磁化率。磁場測量範圍從 15000Oe 到-15000Oe。.........................................................................53 圖 3.8 磁性微胞之細胞毒性分析..............................................................................54 圖 3.9 兩種磁性微胞與 KB 細胞培養 1 小時(A)及 3 小時(B)之胞噬分析 ...........55 圖 3.10 兩種磁性微胞與 A549(A)、KB(B) 細胞培養 3 小時之胞噬分析 ............56 圖 3.11 (A)兩種磁性微胞與 KB 細胞培養 1 與 3 小時胞噬的鐵含量....................57 (B)兩種磁性微胞比較 A549 與 KB 細胞培養 3 小時胞噬的鐵含量......................57 圖 3.12 KB 細胞與 PF127-PAAIO(A、B、E、F)及 FA-PF127-PAAIO(C、D、G、 H)培養 1 小時(A-D)與 3 小時(E-H)之共軛聚焦顯微鏡圖，B、D、F、H 為再放大 3 倍後之共軛聚焦顯微鏡圖。...................................................................................59 圖 3.13 KB 細胞與 PF127-PAAIO(A、C、E、G)及 FA-PF127-PAAIO(B、D、F、 III.

(6) H)培養 1 小時(A、B)、3 小時(C、D)、6 小時(E、F)、24 小時(G、H)之共軛聚焦顯微鏡圖。..................................................................................................................61 圖 3.14 不同濃度下 FA- PF127-PAAIO(A)、PF127-PAAIO(B)與 KB 細胞共同培養 3 小時，利用 3.0 T MRI 進行造影所得之影像........................................................63. IV.

(7) 表目錄表 1.1 利用奈米粒子的特性在不同方面之應用.........................................................6 表 1.2 各種 SPIO、USPIO 的特性與臨床上的應用 .................................................8 表 3.1 磁性微胞組成比例..........................................................................................51 表 3.2 1/T2 values as a function of iron concentration..............................................63. V.

(8) 製備具標靶葉酸受體診斷及治療的多功能 pluronic® 修飾四氧化三鐵指導教授：陳振興博士國立高雄大學應用化學系學生：林嘉鈞國立高雄大學生物科技研究所摘要核磁共振造影最大的貢獻在於能在不同的組織和不同的環境下，呈現出有差異的顯影效果，因此被用來診斷組織的病變與否。本研究中，利用 Pluronic®高分子 F127(PF127) 的 PPO 疏水端攜帶疏水性藥物，與水溶性的四氧化三鐵(PAAIO)反應，並在 PF127 親水端接枝上葉酸(folic acid, FA)做為標靶癌細胞的配體分子，形成一個具備診斷、治療、標靶的多功能磁性微胞(FA-PF127-PAAIO)。並以無葉酸標的的磁性微胞(PF127-PAAIO)作為對照組。使用紅外線光譜儀觀測磁性微胞酯鍵的吸收。紫外線吸收光譜儀觀察到葉酸的特殊吸收訊號。修飾後的磁性微胞從 TEM、DLS 觀察粒徑大小，在介面電位也有明顯的變化。AAS 組成比例分析磁性微胞的含鐵量。超導量子干涉儀分析上，由磁滯曲線測得超順磁性以及飽和磁化率。細胞實驗裡，我們利用流式細胞儀與體外磁振造影實驗分析含葉酸的 FA-PF127-PAAIO 標的癌細胞的表現，初步的結果說明 FA-PF127-PAAIO 有標靶葉酸受體的能力。關鍵字：四氧化三鐵、Pluronic F127、葉酸、超順磁性、診斷、治療. 1.

(9) Folate-Mediated Pluronic® Modified Fe3O4 for Combined Diagnosis and Therapy Advisor: Professor Jenn-Shing Chen Applied Chemistry National University of Kaohsiung Student: Jia-Jyun Lin Institute of Biotechnology National University of Kaohsiung ABSTRACT. Magnetic resonance (MR) tracking of superparamagnetic iron oxide labeled cells is a relatively new technique to non-invasively determine the cancer cells. In this study, Pluronic® F127 (PF127), which is capable of encapsulating hydrophobic drug due to its PPO hydrophobic segments, was proceeded a condensation reaction with water-soluble polyacrylic acid bound iron oxide (PAAIO). A tumor-specific targeting ligand, folic acid (FA), was also grafted onto PF127-PAAIO to give FA-PF127-PAAIO magnetic micelles. A multifunctional FA-PF127-PAAIO can be used as combined diagnosis and therapy purposes specifically targeting to cancer cells. PF127-PAAIO magnetic micelles without folic acid were used as a control group. According to IR and UV absorption spectra, we ensured the successful preparation of the magnetic micelles with polymeric compartments for carrying a drug. The hysteresis curves of SQUID magnetometer analysis also showed that these magnetic micelles were superparamagnetic and a saturation magnetization was obtained in FA-PF127-PAAIO and PF127-PAAIO. Internalization of FA-PF127-PAAIO in targeted cells (KB, A549 cells) was observed by flow-cytometric analysis and in vitro MR imaging. These preliminary results demonstrated that FA-PF127-PAAIO have the ability to target folate receptor. Keywords: Fe3O4, Pluronic F127, Folic acid, Superparamagnetic, Diagnosis, Therapy. 2.

(10) 第一章前言 1.1 奈米科技 1.1.1 奈米簡介奈米是一種尺度的單位，一般是指其尺寸在 1~100nm 之間的粒子，又稱為超微粒子。當顆粒尺寸低於某一個限度時，材料的性能產生突變或是反轉，顯示出許多奇異的特性，即它的熱學、磁學、光學、電學、力學以及化學方面的性質和大尺寸固體相比將會有顯著的不同，因此，出現傳統模式與理論無法解釋、截然不同的現象。然而不同學科的科學家們研究和分析奈米粒子，試圖解開在臨界尺度下所出現的奇特現象。從微米至奈米的尺度裡，出現了許多巨觀世界裡所沒有的新奇現象，於這些現象中發現潛在的新物質特性及應用。正由於這些理由，奈米材料的研究至今仍不曾間斷。. 圖1.1: 微米至奈米尺度圖1. 3.

(11) 1.1.2 奈米材料的特性當粒子粒徑縮小至奈米級後，會引起粒子性質的改變。以下分別說明 (1) 特殊熱學性質大尺寸的固態物質其熔點是固定的，當粒徑小於 10nm 時，其熔點會有顯著的下降。因此奈米顆粒熔點下降之特性對粉末煉金工業具有一定的影響力。 (2) 特殊磁學性質磁性粒子為多磁區結構，其磁化方向皆不同，但隨著粒徑的降低，其磁區由多磁區轉變為單磁區，當粒徑再降低到一臨界值時，粒子會呈現超順磁性。 (3) 特殊光學性質當金屬奈米材料粒徑小於可見光波長時，此時可見光幾乎會被完全吸收，金屬奈米材料皆呈黑色。尺寸越小，顏色越黑，銀白色的鉑變成鉑黑，金屬鉻變成鉻黑。由此可見，金屬奈米顆粒對光的反射率降低，而光吸收度或微波吸收度都有顯著增加，運用這個特性可作為高效率的光熱、光電等轉換材料。 (4) 特殊電學性質金屬奈米粒子隨粒徑逐漸變小，其原子間距也會變小，使金屬中自由電子的平均自由半徑減小，導致導電率下降。 (5) 特殊力學性質奈米材料具有大的介面，介面原子排列的相當混亂，在施加外力的條件下很容易遷移，使得奈米複合材料的韌性、延展性、耐磨性、 4.

(12) 耐壓性、緻密性等特性大為增加和改善。 (6) 特殊化學性質當顆粒大小趨近奈米大小時，由於表面原子數所佔比例較高，因此具有吸附作用，固加強了化學反應能力與催化特性，即在化學性質上有所變化。. 5.

(13) 1.1.3 奈米粒子的應用奈米粒子的應用可以依利用型態區分為在分散狀態的利用與當成結合體利用，應用上是利用粒子小、表面積大、奈米化後改善物性。粒徑極小的奈米粒子在力學、光學、磁學、電學、催化、敏感、熱性質及化學性質，以及觸媒、顏料、生物及醫學方面均有重要的功用，即具發展的潛力與應用價值。表 1.1 所示為利用奈米粒子的特性在不同方面之應用。. 表1.1利用奈米粒子的特性在不同方面之應用1,2. 6.

(14) 1.2 超順磁奈米氧化鐵 1.2.1 超順磁奈米氧化鐵之簡介生醫領域的發展越來越受到全球的矚目，疾病的診斷治療也從以往的巨觀現象觀察進入到微觀世界。超順磁奈米氧化鐵是一種新型的核磁共振對比劑，其體內組織特異性高，安全性好的特點受到臨床的歡迎。在生醫的應用上，侵入性醫療治劑必須考慮生物相容性、穩定性及水溶性，而可經由表面修飾來達到不同的應用目的，因此對於超順磁奈米氧化鐵的表面修飾是一值得研究的領域。目前這方面的研究多以生物相容性高分子化合物包覆在超順磁奈米氧化鐵外層為主，但缺點是增加了整體的顆粒大小，不同的顆粒大小將影響到其體內分佈特異性和磁性特性，進而影響其應用性。超順磁奈米氧化鐵的直徑一般在奈米左右，根據其顆粒大小分為兩類；一類是普通的超順磁氧化鐵 (Superparamagnetic Iron Oxide, SPIO)：一般直徑為 40~400nm。臨床上最常見的是 Advanced Magnetics 公司開發的 AMI-25 (Ferumoxides，商品名為 Feridex)3，直徑為 120~180nm。AMI-25 在美國、日本及歐洲等國完成臨床試驗，已有商品出售。另一類是超微型超順磁氧化鐵 (Ultrasmall SPIO, USPIO )，最大直徑不超過 30nm。商品如 Advanced Magnetics 公司所開發的 AMI-227 (Ferumoxtran-10)4 就屬於這類製劑，平均直徑只有 15~30nm。表 1.2 為市售的各種 SPIO 與 USPIO。. 7.

(15) 表1.2 各種SPIO、USPIO的特性與臨床上的應用5. 超順磁奈米氧化鐵在體內的分布具有明顯的特異性。由於人體的網狀內皮系統(reticuloendothelial system，RES)具有豐富的吞噬細胞，這些吞噬細胞是體內免疫系統的組成部分，但是超順磁奈米氧化鐵透過靜脈注射進入人體後，與血漿蛋白結合，並在調理素作用下被網狀內皮系統辨識，吞噬細胞就會把超順磁奈米氧化鐵當做外來物而吞噬，此稱之為巨噬作用(Phagocytosis)。所以超順磁奈米氧化鐵是一種網狀內皮系統對比劑，可用於肝、脾、淋巴結、骨髓等含豐富網狀內皮細胞的組織和器官。吞噬細胞吞噬超順磁奈米氧化鐵後使相應區域信號減低，而腫瘤組織因不含正常的吞噬細胞而保持信號不變。超順磁奈米氧化鐵的顆粒大小對其進入網狀內皮系統的部位有較大影響，一般直徑較大的超順磁氧化鐵主要為肝、脾的網狀內皮系統所攝入；超微型超順磁氧化鐵由於顆粒小，主要進入淋巴結組織及骨髓組織中。另外超微型超順磁氧化鐵更適合作為核磁共振血管攝影對比劑。 8.

(16) 超順磁奈米氧化鐵的毒性主要來自於鐵的含量，但是目前臨床應用培養的劑量都遠小於其毒性的最小值。超順磁奈米氧化鐵在常規的臨床劑量之下，如果緩慢注射，副作用是非常小的。總體而言，超順磁氧化鐵和超微型超順磁氧化鐵是兩類安全性較高的核磁共振造影對比劑。. 9.

(17) 1.2.2 超順磁奈米氧化鐵之磁學理論與磁滯曲線物質產生磁性是因為量子效應的物理現象，在一般應用中以鐵磁性(Ferromagnetic)材料最具重要性。在週期表上的元素中僅有Fe、Co、 Ni三個元素及稀土元素的Gd在室溫時具有鐵磁性的表現。物質磁性的來源，是由電子繞行原子核的軌道運動(orbital motion)，和電子本身的自旋運動(spinning motion)所貢獻而來6,7。由於在同一軌道的成對電子軌道運動相反，導致它們的軌道角動量、自轉角動量彼此互相抵消，故無法產生磁矩，換言之，若得到一個不為零的分子磁矩，此類分子組成的物質即具有磁性。一般磁滯曲線是由超導量子干涉儀所量測而得的。茲就對鐵磁物質的磁滯曲線(hysteresis curve)（如圖1.2所示）加以詳細說明。定溫下，從去磁場狀態(demagnetized state)，即無任何外加磁場與感應磁化量的狀態下開始，其磁化量會隨著磁場的增加而遞增，沿著曲線 OABC(初期磁化曲線)增加，最後達到飽和磁化量(saturation magnetization, Ms)。當磁場減小時，磁化並不沿著初期磁化曲線返回，而沿 CD 曲線返回，顯示磁化量會隨磁場減小而減小。當磁場減至零磁場(H=0)時，磁化量並不會回到零，反而顯示一殘餘磁化量 (residual magnetization, Mr)，此現象稱為磁滯現象(hysteresis)。若想將殘餘的磁化量歸零，必須使磁場繼續增加反向磁場，促使磁化繼續減少，直至磁化量完全歸零，此點的磁場稱為矯頑力或保磁力(coercive force, Hc）。再持續增加負向磁場，使得磁化也在反方向增加，最後達到負向飽和狀態。假設磁場再轉換至正向磁場進行，則磁化沿FGC 變化。此封閉迴圈CDEFGC 稱為磁滯迴路(hysteresis loop)。 10.

(18) 圖1.2 磁滯曲線. 11.

(19) 一般而言，我們必須熟知磁性量測的基本磁性參數，如圖所描述。當施加一足夠大的磁場使物質磁化達到一飽和值，稱為飽和磁化量；另外，當磁場減小至零磁場時，仍有殘餘磁化量存在，稱做殘餘磁化量；然而所謂的保磁力是施加一負向的磁場使樣品的磁化量回歸至零。磁性粒子的磁性（如飽和磁化量、保磁力）會隨粒子的大小、形狀及結構而有所改變；當粒子粒徑減小至一定程度時，則呈現超順磁性狀態，超順磁性最大的優點為無磁滯現象；超順磁性奈米粒子可藉外加磁場之引導而輕易的集中或回收，在外加磁場移除後，有適當保護劑穩定的超順磁性奈米粒子仍保持極佳之分散性。. 12.

(20) 1.2.3 超順磁奈米氧化鐵表面修飾由於所製備出來的奈米氧化鐵會有聚集和氧化的現象出現，所以藉由氧化鐵進行表面修飾，使其可以達到：（a）改善其分散性；（b）使具有新的物理、化學、光學、磁性、電學等性質；（c）改善與物質之間的生物相容性等目的。一般而言，對於奈米氧化鐵修飾的方法有很多，以下就已發展的方法簡述之：（1）以有機物質修飾奈米氧化鐵表面此法可以直接吸附或是以共價鍵結的方式對氧化鐵表面進行改質，便能將氧化鐵由親水改質成親油，使易於分散在有機溶劑中8,9。（2）以無機物質修飾奈米氧化鐵表面此法是將氧化鐵表面先接上官能基，再將欲修飾的無機前驅物與氧化鐵表面官能基進行表面鍵結反應而得之10,11，可以使粒子具有新的性質如光學、磁性、電性等。（3）以生物分子修飾奈米氧化鐵表面因為生物的辨識性很高，可應用於免疫分析、生物標識以及生化分離上。此法需先將氧化鐵表面改質成能與生物體相容的條件，再與 DNA或蛋白質鍵結，形成具有生物相容性的氧化鐵12,13，可應用在 DNA或蛋白質的的純化。. 13.

(21) （4）以生物相容性高分子修飾奈米氧化鐵表面此法可分為兩種：（a）一種是以共價鍵結的方式使生物相容性高分子包圍在氧化鐵表面，即可得到具有極佳生物相容性的氧化鐵 14 （結構如圖 1.3 A）。（b）另一種是將氧化鐵包覆在生物相容性高分子所形成的微胞內部 14（結構如圖 1.3 BCD）。. 圖1.3 以高分子修飾奈米氧化鐵之結構14 利用上述四種方法增加分散性以及生物相容性之外，若能在表面結合上配體(ligand)，如標靶性分子、促進滲透因子，或是將配體合併在結構內部，例如螢光染劑、治療試劑，將能從單純奈米粒子提升為多功能生物試劑(圖 1.4 所示)。. 圖 1.4 多功能生物試劑示意圖 14 14.

(22) 1.2.4 超順磁奈米氧化鐵在生醫上之應用（1）核磁共振造影核磁共振造影對醫學領域而言是一個重大的突破，其最大的貢獻在於能在不同的組織和不同的環境下，呈現出有差異的顯影效果，因此被用來診斷組織的病變與否。可以將奈米氧化鐵外層修飾針對癌細胞具有特殊親和力的分子，因此奈米氧化鐵能夠集中在只有癌細胞分佈的組織，如圖1.5乳癌所示，利用此技術對於早期監控和預防是很有幫助的。. 圖1.5 乳癌之核磁共振造影. 15.

(23) （2）固定化技術生物分子固定化技術提供另一種在生醫方面有用的工具，將特定的生物分子固定在奈米氧化鐵表面，可以保持活性進行催化作用。酵素固定在奈米氧化鐵上，不僅可以增加承受溫度和酸鹼值的變化，其活性較不受固定化之影響而喪失。. （3）藥物引導治療（Drug Delivery Targeting and Diagnosis）將奈米氧化鐵連接上抗癌藥物，並以磁場控制奈米粒子只集中在腫瘤區域進行治療。利用此概念，也可將藥物分子換成生物分子（DNA或蛋白質），將其連結到奈米氧化鐵，並以磁場引導至目標處，再將生物分子釋放，進行治療或是提供偵測標定的功能，如圖1.6 所示。. 圖1.6 藥物引導釋放示意圖. 16.

(24) （4）免疫分析主要是利用磁性奈米粒子將特定的分子先從混合物中分離出來，再利用第二種抗體來偵測或是定量；或是先將對特定細胞有特別親和力的分子連接到奈米氧化鐵上，利用此親合力將奈米氧化鐵固定在特定細胞上，如圖1.7之示意圖，藉由核磁共振造影來作偵測的動作。. 圖1.7 磁性標籤標的示意圖. 17.

(25) （5）溫熱療法一般癌症的癌細胞都很密集的緊靠在一起，血管分佈並不像正常人體組織中的微血管分佈。因此當奈米氧化鐵標的到癌細胞後，在一外加磁場作用下,使奈米氧化鐵溫度提高，造成癌細胞內部血液循環不明顯，微血管散熱效率不佳，癌細胞就因氧氣供給量不足、廢物堆積細胞內、能量製造不及，再加上蛋白質變性、DNA和RNA破壞，導致癌細胞相繼死亡。相對的，正常人體組織因為有效率的散熱作用，溫度並不會提高很多，如圖1.8所示。. 圖1.8 溫熱療法示意圖. 18.

(26) （6）純化分離應用主要利用奈米氧化鐵表面的電荷，與帶有相反電荷的物質產生靜電吸引力，來達到先吸附後分離的目的。例如用表面帶正電荷的奈米氧化鐵來純化分離帶負電的DNA或蛋白質。奈米氧化鐵在生醫上的應用需考慮生物相容性和穩定性才能具有其價值及廣泛性的應用。. 19.

(27) 1.3 Pluronic®（PEO-PPO-PEO） 1.3.1 結構性質 Pluronic®高分子又稱為Poloxamer，是可以溶於水相及有機相的雙性高分子，Pluronic®含有環氧乙烷（ethylene oxide, EO）和環氧丙烷（propylene oxide, PO）構成A-B-A 之共聚物（結構如圖1.9），其中環氧乙烷代表親水鏈段（hydrophilic），環氧丙烷代表疏水鏈段（hydrophobic），因此環氧乙烷及環氧丙烷的佔有比例會影響共聚物的疏水親水值（hydrophilic-lipophilic balance, HLB）。. 圖1.9 Pluronic®結構. 20.

(28) 1.3.2 Pluronic®對於癌細胞之多重抗藥性化學藥物治療初期能有效消滅癌細胞，但投藥多次後癌細胞毒殺率降低，抗癌藥物失去療效，使得化學治療上受到阻礙，原因在於癌細胞對藥物產生多重抗藥性（multidrug resistance, MDR）。藥物必須進到細胞內並滯留一段時間，才能導致細胞死亡，癌細胞能對藥物產生抗藥性，原因在於癌細胞膜上的醣蛋白（P-glycoprotein, Pgp）、多重抗藥性蛋白質(multidrug resistance proteins, MRPs)以及乳癌細胞抵抗蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP)，這三種膜蛋白能將藥物從細胞內部排出，使藥物濃度降低，減緩藥物毒殺癌細胞之效能。 Pluronic®近年來文獻上15,16,17，對於含有多重抗藥性的癌細胞，有顯著的抑制能力，能增加藥物在細胞內滯留而不被排出。由於 Pluronic®進入癌細胞內能使粒線體（mitochondria）能量耗損，因而抑制醣蛋白、多重抗藥性蛋白質與乳癌細胞抵抗蛋白，提升藥物在細胞內濃度。然而細胞凋亡(apoptosis)的訊息傳遞路徑是經由粒腺體的粒腺體外膜滲透性(mitochondrial outer-membrane permeabilization, MOMP)，造成細胞色素c (cytochrome c)從粒腺體釋出至細胞質中，引發硫胱氨酸蛋白酶(caspases)的活化，最後導致細胞凋亡的發生。另外還能防止細胞質小泡(cytoplasmic vesicles)將藥物帶出細胞外，圖1.10 所示. 21.

(29) 圖1.10 Pluronic®抑制MDR癌細胞17. 22.

(30) 1.4 葉酸(Folic acid, FA) 葉酸是屬於維生素B群中的一種化學物質，亦稱為維生素M。結構上主要分為三個部份，左邊為碟酸(Pteridine)，中間為胺基苯酸(Para amino benzoic acid)，右邊為麩胺酸(Glutamic acid)如圖1.11所示。麩胺酸上有α-和γ-COOH，兩個基團都可以進行縮合反應做接枝。然而， γ-COOH的反應性優於α-COOH，且非受體(recepor)連接的必要位置18。. 圖1.11 葉酸結構圖葉酸水溶性不佳，做為水溶液注射劑時需加入NaOH或Na2CO3形成鈉鹽而成水溶性。葉酸在多酸性溶液中不安定，pH5~7時較為穩定，容易對光產生敏感19。葉酸在人體內製造所需的能量及紅血球，為不可或缺的維生素。在DNA合成過程中，葉酸扮演著輔酶(coenzyme)的角色，進而促使細胞分裂與複製，由於葉酸是細胞生長必備因子，而腫瘤為不正常增生的組織，在分裂時更需要養份，因此許多癌細胞表面具有過度表現的葉酸受體(Folate receptor, FR)，使得葉酸對癌細胞具有高度的專一性，因此在標靶性藥物載體系統上，葉酸是相當理想的標靶性物質。圖1.12為細胞胞噬作用過程。. 23.

(31) 圖1.12 葉酸受器調控細胞胞噬作用示意圖20. 24.

(32) 1.5 研究動機及目的奈米氧化鐵在生物醫學與生物工程學上的應用，越來越受到矚目，只要在一個外加磁場的作用下就能夠有不同的應用。眾多學者在磁性材料上修飾具生物相容性的物質，想要利用磁性這種非接觸式的力，做生化技術方面的研究，但是奈米氧化鐵的缺點是極易聚集，若要應用在生物醫療方面，必須具有水溶性、穩定性及生物相容性。然而Pluronic®高分子F127（PF127）結構上具有攜帶疏水性藥物之疏水端，可藉由擴散的方式將藥物釋放，以及能夠抑制MDR癌細胞之特性，期望能具有避免聚集及增強在癌細胞的EPR effect (enhanced permeability and retention)的效果。另外，許多癌細胞表面都會過度表現葉酸受體，因此藉由葉酸分子對癌細胞的專一性，來提升藥物載體在制放系統中的應用性。奈米氧化鐵的表面是決定奈米氧化鐵性質的關鍵性因素，。本研究中，利用生物相容性相當優越的PF127與具有功能性官能基的奈米氧化鐵反應，並接枝上葉酸做為標靶癌細胞的配體分子，形成一個具備診斷、治療、標靶的多功能磁性微胞藥物載體。利用動態光散射測得磁性微胞奈米粒子粒徑與表面電位，穿透式電子顯微鏡觀察奈米粒子大小與型態，紅外線光譜證明磁性微胞官能基的修飾，超導量干涉磁量儀求得磁滯曲線及飽和磁化率；然後再探討疏水性螢光染劑Nile Red作為藥物的乘載評估。經由流式細胞儀與共軛聚焦顯微鏡觀察胞噬作用。從物理性質探討到細胞實驗，評估此磁性微胞是否可作為藥物載體且對癌細胞有特定標靶功能。. 25.

(33) 第二章材料與方法 2.1 實驗試劑 1. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDAC)、4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)、 Phosphate buffered saline buffer(PBS，pH＝7.4)、Tetrazolium bromide(MTT)、Trypan blue、Pluronic F127(MW~12600)，Sigma (St. Louis, USA) 2. Dimethyl sulfoxide (DMSO)、Nile Red，MP Biomedicals(Verona, Italy) 3. 1,1’-Carbonyldiimidazole(CDI)，97%、Poly(acrylic acid)(PAA， MW~2000)，Acros (New Jersey, USA) 4. Fetal Bovine serum (FBS)，Biological industries (Beit Haemek, Israel) 5. Iron(Ⅲ) chloride, anhydrous (FeCl3，FW 162.21)、Sodium hydroxide， Showa (Tokyo, Japan) 6. Folic acid (FA)，TCI (Tokyo，Japan) 7. RPMI medium 1640、Trypsin-EDTA，Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 8. Fluorescence mounting medium，Dako Cytomation (California, USA) 9. Hydrochoric acid，FW 36.46，35%、Diethylene glycol，Scharlau (Barcelona, Spain) 10. Alcohol，95％，台灣菸酒公賣局 (Kaohsiung, Taiwan). 26.

(34) 2.2 實驗儀器 1. 冷凍乾燥機 (Frozen apparatus ) 廠商：Virts (New York, USA) 型號：Freezemobile 12 2. 核磁共振光譜儀 (Nuclear magnetic resonance spectrometer，NMR) 廠商：Varian (California, USA) 型號：Gemini-200 VT proton/carbon FT NMR 3. 真空抽氣烘箱 (Vacuum oven) 廠商：Napco (New York, USA) 型號：Model 5831 油轉式馬達：Ulvac G100D 4. 酸鹼度測定器 (pH meter) 廠商：Mettler-Toledo Taiwan branch (Kaohsiung, Taiwan) 型號：MP225 5. 免疫酵素分析儀 (Enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA) 廠商：E-Lab (Taipei, Taiwan) 型號：3101103-198-0021 6.. X 光繞射儀 (X-ray diffraction spectrophotometer, XRD) 廠商：Rigaku (Tokyo, Japan) 型號：2KW. 7. 倒立式螢光顯微鏡 (Fluorescent microscope) 廠商：Zeiss (Gottingen, Germany) 型號：Axiovert 200 27.

(35) 8. 雷射奈米粒徑暨界面電位測量儀 (Dynamic light scattering, DLS) 廠商：Malvern (Worcestershire, England) 型號：Zetasizer Nano S 9. CO2 細胞培養箱廠商：Thermo (Taipei, Taiwan) 型號：Hepa Class 100 10. 穿透式電子顯微鏡 (Transmission electron microscope, TEM) 廠商：Jeol (Tokyo, Japan) 型號：JEM-1400 11. 流式細胞儀 (Flow cytometry) 廠商：Beckman coulter (Fullerton, USA) 型號：EpicsXL-MCL 12. 雷射共軛聚焦顯微鏡 (Confocal laser scanning microscope, LCSM) 廠商：Olympus (Tokyo, Japan) 型號：FV500 13. 傅立葉轉換紅外線光譜儀 (Fourier transform infrared spectrophotometer, FT-IR) 廠商：Perkin Elmer (New Jersey, USA) 型號：FT-IR System 2000 14. 高速震盪器 (High speed vortex) 廠商：Scientific industries (New York, USA) 型號：Vortex-Genie 2. 28.

(36) 15. 紫外線吸收光譜儀 (Ultraviolet absorption spectrophotometer, UV) 廠商：Agilent (CA, USA) 型號：Agilent 8453 16. 超導量子干涉儀 (Superconducting quantum interference device, SQUID) 廠商：Quantum Design (USA) 型號：MPMS-XL7 17. 原子吸收光譜儀 (Atomic absorption spectrophotometer, AAS) 廠商：Perkin-Elmer 型號：5100 PC 18. 磁振造影掃描儀 (Magnetic resonance imaging, MRI) 廠商：Sigma ; GE Medical systems，Milwaukee，WI 型號：3.0T MR scanner. 29.

(37) 整個實驗流程如下所示:. Magnetic micelles. Material Synthesis PAAIO FA-PF127. Preparation and characterization X-ray diffraction spectrophotometer (XRD) Nuclear magnetic resonance spectrometer (NMR) Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) Ultraviolet absorption spectrophotometer (UV) Dynamic light scattering (DLS) Transmission electron microscope (TEM) Atomic absorption spectrophotometer (AAS) Superconducting quantum interference device (SQUID) 圖 2.1 實驗流程圖 30. Cell test (KB、A549) Cytotoxicity Flow cytometer. Cellular uptake Confocal laser scanning microscope (CLSM) In vitro Magnetic resonance imaging (MRI).

(38) 2.3 材料製備及分析 2.3.1 葉酸接枝 pluronic F127 (FA-PF127) 1. 取87.58mg (0.20 mmole)的葉酸溶於3ml 二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，隨後加入35.32mg (0.22mmol)縮合試劑CDI，在冰浴下攪拌1天，在避光環境下進行反應。 2. 將 PF127 0.62g (0.05 mmole)抽乾除水，再將步驟 1 所配置溶液加入，在室溫下反應 1 天，在避光環境下進行反應。 3. 反應完後進行純化以移去未接枝之葉酸，將反應結束之混合物溶液置入透析膜(cut-off MW 1000)在避光下進行透析 3 天。最後經由冷凍乾燥機乾燥兩天，得到產物 FA-PF127 並以 DMSO 溶解測 1. H-NMR 光譜圖。. O OH N. N H2N. O. N. N H. H N. C. C. OH C OH. N. O. Folic acid. H. O. O. 65. 100. O. H. 100. PF127. O C N. N. H O. O. 100. 65. O. N. N. O OC. 100. N. H N HO C. C O. H N. N. O. FA-PF127. 圖 2.2 葉酸接枝 PF127 示意圖 31. N. NH2 N. OH.

(39) 2.3.2 水溶性四氧化三鐵的製備 (PAAIO) 1. 製備 NaOH/DEG 溶液：取 2.00g (50mmol)的氫氧化鈉溶於 20ml 二甘醇(Diethylene glycol, DEG)，加熱至 120℃，在氮氣下反應 1 小時後，即得到 NaOH/DEG 溶液。 2. 取 1.50g (9.25 mmole)的三氧化鐵(FeCl3)與 0.63g (0.32 mmole)的聚丙烯酸溶於 75ml 二甘醇，加熱至 220℃，在氮氣下反應 30 分鐘。接著注入 20ml NaOH/DEG 溶液，在 210℃下反應 10 分鐘。 3. 待溶液冷卻至室溫後，以 95%乙醇將產物沉澱，將沉澱物回溶於 50ml 二次水，經減壓濃縮機將殘留的乙醇抽掉，調整 pH 值至 7.0，以 0.2um filter 過濾篩選，最後經由冷凍乾燥機乾燥兩天得到產物。. 2.3.3 XRD 取少量 PAAIO 在真空烘箱裡除水 1 天，置入 XRD 專屬玻璃試片槽中央處。將 X-ray 機器先行打開輻射暖機，之後設定參數 Cu 靶入射光，波長為 1.54Å，voltage 為 40kV，current 為 30mV，2θ=25~65° 掃描角度範圍，固定掃描速率 2θ=5°/min。. 32.

(40) 2.4 磁性微胞 2.4.1 具標靶葉酸受體的磁性微胞製備 (FA-PF127-PAAIO) 1. 取 PAAIO 20mg 溶於 20ml 去離子水中，加入 40mg EDAC 到 PAAIO 水溶液中，調整 pH 值至 7.0，室溫下反應一天。 2. 加入 20mg FA-PF127，於 PAAIO 水溶液中，室溫避光環境下反應一天。 3. 反應結束後以透析純化，將反應產物置入透析膜(cut-off Mw=25kDa)，在去離子水中透析 2 天，最後經由冷凍乾燥機乾燥兩天得到產物。 O. PAAIO. OH. N. O. H. O. O. O C. 65. 100. O. 100. H N HO. C. H N. C. N N. N. O. NH2. OH. O. FA-PF127. EDAC, H2O, pH=7.0 O O. N. O. O. 100. O C. 65. O. 100. H N HO. C. C. H N. O. O. FA-PF127-PAAIO. 圖 2.3 FA-PF127-PAAIO 製備示意圖. 33. N. N. NH2 N. OH.

(41) 2.4.2 磁性微胞製備 (PF127-PAAIO) 1. 取 PAAIO 20mg 溶於 20ml 去離子水中，加入 40mg EDAC 到 PAAIO 水溶液中，調整 pH 值至 7.0，室溫下反應一天。 2. 加入 20mg PF127，於 PAAIO 水溶液中，室溫下反應一天。 3. 反應結束後以透析純化，將反應產物置入透析膜(cut-off Mw=25kDa)，在去離子水中透析 2 天，最後經由冷凍乾燥機乾燥兩天得到產物。. O. PAAIO. OH. H. O O. 65. 100. OH. O. 100. PF127. EDAC, H2O, pH=7.0 O O O. 100. OH. 65. O. 100. PF127-PAAIO. 圖 2.4 PF127-PAAIO 製備示意圖. 34.

(42) 2.4.3 乘載 Nile Red 將製備好的PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO分別取出5 mg溶於水中(1mg/ml)，再將溶於DMSO之0.05mg疏水性螢光染劑Nile Red (0.34 mg/ml)緩慢加入，在避光環境下混合1天後，利用冷凍乾燥機得到乾燥粉末，將此粉末回溶於5ml二次水，以0.45um filter過濾未乘載之Nile Red，最後經由冷凍乾燥機乾燥兩天得到乘載Nile Red之磁性微胞。. 2.4.4 FT-IR 使用IR來鑑定FA-PF127與PF127對PAAIO的表面修飾。將 PAAIO、PF127、FA-PF127、PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO與KBr 等取少量在真空烘箱裡除水1天，將PAAIO、PF127、FA-PF127、 PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO與KBr混合後以FT-IR觀察官能基的修飾。. 2.4.5 UV 將合成之 PAAIO、PF127-PAAIO 及 FA-PF127-PAAIO 分別配製成 0.1mg/ml 水溶液，測量 200~500nm 的 UV 吸收值。. 35.

(43) 2.4.6 DLS 測量磁性微胞的粒徑大小及界面電位是使用雷射奈米粒徑暨界面電位測量儀。偵測粒徑範圍於 1-5000nm 區間，溫度為 25℃，散射光角度為 90°，測得粒徑大小。界面電位是使用 aqueous dip cell 在自動模式下測量；乘載 Nile Red 的磁性微胞之粒徑大小及界面電位皆依上述步驟測定。. 2.4.7 TEM 將配置好的PAAIO、PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO以及乘載 Nile Red的磁性微胞溶液，滴落於鍍碳銅網上，待銅網乾燥後上機觀察。. 2.4.8 AAS 將配置好的 PAAIO、PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO 經由霧化器霧化後，送入火焰中進行原子化，藉由中空陰極鐵燈管之特性光強度的變化量換算可測得樣本中鐵元素之濃度。鐵標準溶液為 Fe(NO3)3．9H2O。. 2.4.9 SQUID 將 PAAIO、PF127-PAAIO、FA-PF127-PAAIO 取少量在真空烘箱裡除水 1 天，接著取已知重量置於超導量子干涉儀專用之膠囊內即可進行分析。. 36.

(44) 2.5 磁性微胞之體外(In vitro)實驗 2.5.1 細胞培養 KB (Human carcinoma cell line)培養於含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及 100μg/ml 鏈黴素(streptomycine) 和 100U/ml 青黴素(penicillin) 的RPMI medium 1640 (Gibco BRL, Paris, France)的生長液，在含有 5% CO2，37℃的細胞培養箱中。. 圖2.5 KB細胞 A549(Human lung carcinoma cell line)培養於含有10% 胎牛血清及100μg/ml 鏈黴素和100U/ml 青黴素的RPMI medium 1640 的生長液，在含有5% CO2，37℃的細胞培養箱中。. 圖2.6 A549細胞. 37.

(45) 2.5.2 細胞毒性測試個別取5 × 103 cells/well KB、A549 細胞培養於100 μl/well的生長液中，分別置入96 孔培養盤，培養於37℃，5% CO2，24小時後，加入100μl 兩種磁性微胞以及乘載Nile Red之磁性微胞的培養液(濃度為5~1000μg/ml)，再繼續培養24小時。待各培養時間到達時，每孔加入50μl MTT 培養3 小時後，離心1500rpm 5 分鐘，小心抽離上清液，加入DMSO 100μl/well 均勻震盪15 分鐘，以酵素免疫分析儀讀取波長595 nm 之吸光值為測定值。細胞存活率計算公式，如下所示：細胞存活率(%)＝（OD595. （實驗組）. 38. /OD595. （控制組）. ）× 100.

(46) 2.5.3 葉酸調控之細胞胞噬測試 1. 實驗前兩天將培養瓶內的 KB 細胞培養基換為不含葉酸的 RPMI medium 1640。實驗前一天將細胞用胰蛋白脢(trypsin)切下，加入 10ml 磷酸鹽緩衝液（Phosphate Buffered Saline, PBS）離心去除殘餘的胰蛋白脢，再以 3×105 cells/well 的密度培養於六孔培養盤。 2. 一天後待細胞貼附培養盤後，將培養基置換新鮮不含葉酸的 RPMI medium 1640。 3. 接著用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製濃度為 50μg/ml 乘載 Nile Red 的磁性微胞溶液，加入細胞一同置於恆溫培養箱，分別做 1、3 小時的培養實驗。 4. 胞噬實驗結束後，將培養基抽除，再以含有 2% 胎牛血清的 PBS 清洗細胞三次後以胰蛋白脢將細胞從培養盤切下，並離心去除胰蛋白脢，最後再以滅菌水回溶細胞，使用流式細胞儀分析胞噬情形。另外亦取固定細胞數(20 萬顆)，加入 37% 鹽酸溶液，水浴 70℃ 下加熱 1 小時，經由原子吸收光譜儀偵測細胞胞噬的鐵含量。. 39.

(47) 2.5.4 共軛聚焦顯微鏡觀察磁性微胞在細胞內的傳遞 1. 將直徑為 18mm 大小之蓋玻片浸泡於 0.1N H 鹽酸溶液 24 小時，再以二次水沖洗，並以拭淨紙拭乾浸泡於 70%酒精中送無菌無塵操作台(laminar flow)中備用。 2. 以滅菌過的鑷子將浸於酒精的蓋玻片經過本生燈過火後置入 12 孔培養盤中。再以 2×105 cells/well 的密度將 KB 細胞培養於 12 孔培養盤中的玻片上，培養液為添加 10%胎牛血清不含葉酸的 RPMI medium 1640。 3. 經過 24 小時培養後，用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製濃度分別為 50、500μg/ml 乘載 Nile Red 的磁性微胞溶液，接著加入細胞一同置於恆溫培養箱，做 1、3、6、24 小時的培養實驗。 4. 培養結束後，將培養液連同磁性微胞一起抽除，用含有 2%FBS 的 PBS 洗三次後，加入 3.7% 三聚甲醛(paraformaldehyde) 1ml/well 並置入於 37℃培養箱中 30 分鐘以固定細胞。隨後吸除三聚甲醛再以 PBS 清洗三次。 5. 細胞固定後，加入 1ml/well 的 Triton X-100，培養 10 分鐘，再以 PBS 清洗三次。最後使用 DAPI 做細胞核的染色，將細胞以 Triton X-100 處理後，加入 0.5ml/well 的 DAPI 培養於 37℃培養箱 10 分鐘後，以 PBS 清洗，將蓋玻片貼附有細胞的面滴上 mounting medium 並以透明指甲油封片於載玻片上，使用共軛聚焦顯微鏡觀測細胞內傳遞的情形。. 40.

(48) 2.5.5 體外磁振造影實驗 1. 實驗前兩天將培養瓶內的 KB 細胞培養基換為不含葉酸的 RPMI medium 1640。實驗前一天將細胞用胰蛋白脢切下，加入 10mlPBS 離心去除殘餘的胰蛋白脢，再以 5×105 cells/well 的密度培養於六孔培養盤。 2. 24 小時後待細胞貼附培養盤後，用不含葉酸的 RPMI medium 1640 配製鐵濃度為 1、2、6、10、20、30、40μg/ml 的磁性微胞溶液，接著加入細胞一同置於恆溫培養箱，培養 3 小時。 3. 胞噬實驗結束後，將培養基抽除，再以含有2% FBS的PBS清洗細胞三次後以胰蛋白脢將細胞從培養盤切下，並離心去除胰蛋白脢，最後再以PBS回溶細胞，放進膝蓋線圈(knee coil)以3.0 T之磁振造影掃描儀掃描所有細胞，掃描條件為：T -Fast spin echo， 2. TR/TE=3000/90。. 41.

(49) 第三章結果與討論 3.1 材料特性分析 3.1.1 FA-PF127 之 1H NMR 鑑定由 FA-PF127 的 1H NMR 光譜圖，如圖 3.1 所示，在化學位移 6~9 ppm 的位置 b、c、d 上代表的是葉酸雜環結構上的 5 個氫，而 1.1 ppm 左右的位置則為環氧丙烷上甲基的氫，就以此二處的積分值作為算接枝率的基準。得到接枝率約為 130%，接枝率超過 100%表示具有一端或ㄧ端以上的 PF127 末端的 OH 官能基接枝上 FA，利用未反應端的 OH 來修飾 PAAIO 表面。. 圖 3.1 FA-PF127 1H NMR 光譜圖. 42.

(50) 3.1.2 PAAIO 之 X 光繞射定性測量當氧化鐵奈米粒子合成之後，利用 XRD 進行定性測量，由圖 3.2 可得到六個特徵峰，分別為 30.2、35.5、43.2、53.3、57.1、62.8，經由比對 JCPDS 圖譜之後，得知本方法合成的 PAAIO 的確為 Fe3O4。因 PAAIO 表面披覆聚丙烯酸，造成特性峰強度相對減弱，但不足以破壞其結晶區域。Chen 於 2007 年也證實包覆 PF127 後，Fe3O4 的特性峰強度的確有減弱的現象 21。. 圖 3.2 氧化鐵奈米粒子之 XRD 圖譜. 43.

(51) 3.2 磁性微胞特性分析 3.2.1 FT-IR 在紅外線光譜實驗(如圖 3.3 所示)中，利用 PF127 與 FA-PF127 尾端的 OH 去攻擊 PAAIO 上的羧基(carboxyl group)，結構的變化可從 IR 上觀察到有明顯的酯鍵(ester bond)的出現。從 IR 上可清楚發現，純的 PF127 與 FA-PF127 在 1700cm-1 左右並無明顯的酯鍵的吸收峰，而成功修飾上 PF127 與 FA-PF127 的磁性微胞則明顯在 1703.49cm-1 的酯鍵吸收皆可觀測得到，由此可得證 PF127-PAAIO 與 FA-PF127-PAAIO 的成功合成。PF127-PAAIO 與 FA-PF127-PAAIO 中. -. 及 COO 在 1567.66、1454.54、1406.21 cm-1 的特徵吸收峰(Yin, 2007)22，說明修飾 PF127 及 FA-PF127 後的 PAAIO 磁性微胞，仍然可以清楚的觀察到 PAAIO 的存在。. 44.

(52) 圖 3.3 修飾過後的磁性微胞 FTIR 光譜圖. 45.

(53) 3.2.2 UV 將 PF127-PAAIO 與 FA-PF127-PAAIO 製備為 0.1mg/ml 的溶液，以 UV 光譜掃描。由圖 3.4 可明顯看出在 280nm 的地方， FA-PF127-PAAIO 有較明顯的吸收訊號，而 PF127-PAAIO 則無，顯示有無接枝葉酸的磁性微胞 UV 吸收光譜圖有顯著的差別，由於 280nm 是葉酸的特殊吸收訊號，由此我們亦證實 FA-PF127-PAAIO 中葉酸的存在。雖然 UV 可以用來定量 FA-PF127 在 FA-PF127-PAAIO 的含量，但是 PAAIO 本身的背景 UV 吸收不是水平，在定量分析上誤差恐怕太大，因此我們將利用原子吸收光譜來做鐵的定量分析。. 圖 3.4 磁性微胞 UV 吸收光譜圖. 46.

(54) 3.2.3 粒徑大小與介面電位在DLS實驗(如圖3.5所示）測得PAAIO的粒徑為39.4±2.0nm (PDI=0.29±0.01)，當修飾上PF127與FA-PF127，粒徑增為113.3±1.1nm 及125.4±2.0nm，說明PF127與FA-PF127成功的與PAAIO反應。粒徑在100 nm左右的奈米粒子可藉由EPR效應通透腫瘤組織的血管壁，增加奈米粒子在腫瘤組織的含量。另外，PAAIO修飾含有環氧乙烷鏈段的PF127，亦可避免被網狀內皮系統所吞噬，經由腎、脾系統而將奈米粒子代謝出來。因此修飾後的PAAIO將可提高在腫瘤組織滯留的機率。在介面電位分析上，PF127與FA-PF127會遮蔽掉PAAIO表面的負電(-20.7±2.0mV)，而使負電位值變小，測得PF127-PAAIO與 FA-PF127-PAAIO表面電位分別為-16.6±1.1mV、-14.7±0.5mV。當磁性微胞乘載Nile Red後，粒徑與電位並無顯著改變，粒徑分別為 123.5±2.1nm及112.3±4.4nm，電位則分別為-16.7±1.8mV、 -13.6±1.1mV。. 47.

(55) 圖 3.5 磁性微胞粒徑大小與介面電位. 48.

(56) 3.2.4 TEM TEM 實驗(圖 3.6 所示）可得到實際磁性微胞的型態圖，從圖中發現，PAAIO(12.0±1.6nm)經過表面修飾後，亦能減少聚集，計算在相同顆粒數(7 顆)，PF127-PAAIO 與 FA-PF127-PAAIO 平均粒徑大小分別為 41.0±4.1nm、36. 7±9.1nm，型態上相似於 Gao 於 2006 年所發表的多功能性微胞 23，皆可清楚看到內部的氧化鐵。乘載 Nile Red 後，粒徑分別變為 79.6±18.8nm、65.5±16.0nm。. 49.

(57) 圖 3.6 PAAIO(A)、PF127-PAAIO(B)、FA-PF127-PAAIO(C)、 PF127-PAAIO load Nile Red(D)、FA-PF127-PAAIO load Nile Red (E) 之 Cryo 穿透式電子顯微鏡影像. 50.

(58) 3.2.5 磁性微胞組成分析磁性微胞的組成分析主要是利用原子吸收光譜儀，將樣品溶液經由霧化器霧化後，送入火焰中進行原子化。來自中空陰極鐵燈管之特性光，在穿過火焰後，經由單光器分光處理後，再偵測器測量特性光的強度變化量。特性光強度的變化量主要是取決於火焰中自由且未激發之基態原子數量的多寡，由於入射之特性光只會被待測金屬吸收，藉由入射之特性光強度的變化量換算可測得樣品中待測元素之濃度。如表 3.1 所示，測得個別鐵含量後，利用 PAAIO 中鐵含量(37.37%) 與其餘部份(62.63%)之比值，代入 PF127-PAAIO 及 FA-PF127-PAAIO 中，如 Eq(1)所示，換算求得 PF127 與 FA-PF127 在磁性微胞中組成比例分別為 64.41%、71.63%，顯示證明確實成功合成且得到最終產物。另外比較 Hong 與 Yuan 於 2008 年利用接枝葉酸的 PCL-PEG 修飾 Fe3O4，測得有無葉酸的 PCL-PEG-Fe3O4 鐵含量分別為 15.3 及 16.1wt%，與本研究結果相比皆說明修飾後的磁性微胞只含有少量的鐵 24。表 3.1 磁性微胞組成比例 Fe content. PF127 content. FA-PF127 content. (wt%). (wt%). (wt%). PAAIO. 37.37± 0.02. PF127-PAAIO. 13.30± 0.03. FA-PF127-PAAIO. 10.60± 0.08. 64.41 71.63. 51.

(59) Fe (PAAIO) /100- Fe (PAAIO) = Fe (PF127-PAAIO) / remain......(1) PF127 content = 100- remain - Fe (PF127-PAAIO) 37.37 / 100 - 37.37 = 13.30 / x. x=22.29. 64.41 = 100 - 13.30 - 22.29. 52.

(60) 3.2.6 SQUID 作為磁振造影上的對比劑，必須具有很好的超順磁性，圖 3.7 為 PAAIO、PF127-PAAIO 以及 FA-PF127-PAAIO 在 298K 下之磁滯曲線，圖中的磁滯曲線在外加磁場消失時，PAAIO 的感應磁場也跟著消失，並沒有產生磁滯現象，即使經過表面修飾後，PF127-PAAIO 及 FA-PF127-PAAIO 仍然無磁滯現象的產生。此曲線證明兩種磁性微胞具超順磁性(superparamagnetism)。然而 PF127-PAAIO 與 FA-PF127-PAAIO 卻受到表面修飾的影響，飽和磁化率由 PAAIO 的 78 emu/g Fe 分別降為 61、74 emu/g Fe。比較 Lee 於 2009 年發表的磁性奈米粒子，當修飾上 chitosan 與 starch 後，飽和磁化率反而從 60 emu/g 左右降至 10~30 emu/g 之間 25，其差異變化遠大於本研究中 Fe3O4 表面修飾的影響。. 圖 3.7 在 298K 下利用超導量子干涉儀測量 PAAIO 與磁性微胞的磁化率。磁場測量範圍從 15000Oe 到-15000Oe。 53.

(61) 3.3 體外(In vitro)實驗 3.3.1 細胞毒性測試細胞毒性的測試是以 MTT 試劑與細胞粒線體中 dehydragenase 作用，原本黃色的 MTT 還原為 formazan 紫色結晶，當投遞測試藥物或材料後，若存活細胞越多，結晶物就會越多，以 DMSO 將 formazan 溶解後可透過 ELISA 測量吸光值，藥物或材料毒性越小，殺死細胞越少，存活細胞越多則吸光值越高。我們用兩種磁性微胞以及乘載 Nile Red 之磁性微胞將其投予 KB 細胞培養檢視生物相容性。從圖 3.8 細胞毒性實驗分析中顯示，兩種磁性微胞幾乎不具毒性，即使乘載疏水性螢光染劑後，細胞存活率仍達 75%以上，顯示我們所製備的磁性微胞具有相當潛力以成為良好的藥物載體系統。. 圖 3.8 磁性微胞之細胞毒性分析 54.

(62) 3.3.2 葉酸調控之細胞胞噬測試含有葉酸的奈米粒子 24,26 對於過度表現葉酸受體(Folate receptor, FR)的癌細胞有高度結合葉酸的能力，具有高度標靶癌細胞的效果。因此我們設計具有葉酸的磁性微胞，與 FR 過度表現的 KB cells 進行培養，藉由流式細胞儀來觀測細胞的螢光表現，檢視含有葉酸磁性微胞對 KB 細胞是否具較高的標靶能力。在 1 與 3 小時的培養時間，相同濃度(50μg/ml)下，從流式細胞儀 (flow cytometer)所呈現的螢光胞噬情形可以得知，當接枝有葉酸的磁性微胞較容易被 KB 細胞所吞噬，進而呈現較強的螢光表現，於是在圖 3.9(A)中 FA-PF127-PAAIO 的螢光位移向右。當時間拉長至 3 小時，圖 3.9(B)中 FA-PF127-PAAIO 與 PF127-PAAIO 的螢光位移程度相差更大，顯見在過度表現葉酸受體的癌細胞株 KB 細胞中，接枝有葉酸的磁性微胞的確擁有標靶性的功效。. 圖 3.9 兩種磁性微胞與 KB 細胞培養 1 小時(A)及 3 小時(B)之胞噬分析 55.

(63) 為了證明 FA-PF127-PAAIO 對於過度表現葉酸受體的癌細胞才有特殊的標靶功能，我們選用另一株未具有過度表現葉酸受體的癌細胞 A549 重做胞噬實驗。在圖 3.10 中，為 FA-PF127-PAAIO 及 PF127-PAAIO 與兩種細胞 (A549、KB)共同培養 3 小時，在相同濃度(50ug/ml)下的胞噬情形。由於 A549 細胞膜上具有極少的葉酸受體，並不會對接枝葉酸的 FA-PF127-PAAIO 有明顯的標靶情形，所以在實驗結果中可以發現兩種磁性微胞的胞噬情形並無太大差異；由圖 3.10 可以得知：對於掛有葉酸分子的磁性微胞(FA-PF127-PAAIO)在具有過度表現葉酸受體的癌細胞株 KB 細胞株中，有較佳的胞噬結果，在無過度表現的 A549 細胞株中，與 PF127-PAAIO 沒有顯著的差異。. 圖 3.10 兩種磁性微胞與 A549(A)、KB(B)細胞培養 3 小時之胞噬分析. 除了利用流式細胞儀來觀測細胞的螢光表現之外，亦可經由原子 56.

(64) 吸收光譜儀偵測細胞胞噬的鐵含量，檢視含有葉酸磁性微胞對 KB 細胞是否具較高的標靶能力，顯示較高的鐵含量。圖 3.11(A)中，仍然能看出對於掛有葉酸分子的磁性微胞針對 KB 細胞，在經過 1 小時與 3 小時的培養時間後，FA-PF127-PAAIO 胞噬鐵含量由 49.00 pg Fe/cell 增為 157.50 pg Fe/cell，而 PF127-PAAIO 胞噬的鐵含量為 59.75pg Fe/cell，結果說明含有葉酸的磁性微胞確實對 KB 細胞具較高的標靶能力。另外針對 A549 以及 KB 兩種細胞株與掛有葉酸分子磁性微胞培養 3 小時後，由圖 3.11(B)得知胞噬鐵含量分別為 30.00、157.50 pg Fe/cell，明顯看出具有過度表現葉酸受體的 KB 細胞有較佳的胞噬結果。. 圖 3.11 (A)兩種磁性微胞與 KB 細胞培養 1 與 3 小時胞噬的鐵含量 (B)兩種磁性微胞比較 A549 與 KB 細胞培養 3 小時胞噬的鐵含量. 57.

(65) 3.3.3 共軛聚焦顯微鏡觀察細胞內傳遞我們利用共軛聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope, CLSM)來觀察 Nile red 在細胞內傳遞的情形，作為藥物在磁性微胞細胞內噬模擬。分別將 PF127-PAAIO 及 FA-PF127-PAAIO 兩種磁性微胞與 KB 細胞共同培養 1 與 3 小時，並以 DAPI (excitation=358 nm； emission=461 nm)做細胞核的染色，藉此檢視磁性微胞進入到細胞內的追蹤。圖 3.12 為磁性微胞(50 μg/ml)與 KB 細胞共同培養後，以共軛聚焦顯微鏡攝得的內噬影像。圖 3.12(A、B)為 PF127-PAAIO 胞內遞送的影像，可以發現螢光量與圖 3.12(C、D)由 FA-PF127-PAAIO 胞內所遞送的結果，顯示與 KB 細胞培養 1 小時，並無明顯葉酸標的能力。經過 3 小時共同培養後，圖 3.12(G、H)為 FA-PF127-PAAIO 胞內遞送的影像，發現螢光量大於圖 3.12(E、F)由 PF127-PAAIO 胞內所遞送的結果，顯示培養 3 小時後，含葉酸磁性微胞胞噬作用較為顯著，且核內出現紅色(螢光 Nile Red)與藍色(染核 DAPI)重疊的紫色點，推測本研究中含葉酸磁性微胞在培養 3 小時後已能傳遞到細胞核內。. 58.

(66) 圖 3.12 KB 細胞與 PF127-PAAIO(A、B、E、F)及 FA-PF127-PAAIO(C、D、G、H)培養 1 小時(A-D)與 3 小時(E-H)之共軛聚焦顯微鏡圖，B、D、F、H 為再放大 3 倍後之共軛聚焦顯微鏡圖。. 59.

(67) 為了獲得更明顯胞內傳遞情形，我們以高濃度的兩種磁性微胞 (500 μg/ml)，重做細胞內噬模擬實驗。圖 3.13(A、B)為共同培養 1 小時後，仍然無明顯葉酸標的能力。卻在 3 小時後(圖 3.13(C、D))，從共軛聚焦顯微鏡圖明顯看出含葉酸磁性微胞擁有標靶性的功效，而在圖 3.13D 中可發現進到細胞內的含葉酸磁性微胞(黑色箭頭處) 證明修飾後的磁性微胞可以進入細胞內。而在培養 6 小時後(圖 3.13(E、 F))及 24 小時(圖 3.13(G、H)) 的長時間培養，具與不具葉酸的磁性微胞都能傳遞到細胞內，兩者間的差異性變成不顯著。. 60.

(68) 圖 3.13 KB 細胞與 PF127-PAAIO(A、C、E、G)及 FA-PF127-PAAIO(B、D、F、H)培養 1 小時(A、B)、3 小時(C、D)、6 小時(E、F)、24 小時(G、H)之共軛聚焦顯微鏡圖。 61.

(69) 3.3.4 體外磁振造影偵測在體外影像實驗中，選用過度表現葉酸受體的癌細胞株KB細胞進行培養後，使用3.0 T MRI進行掃描，掃描條件為：T -Fast spin 2. echo，TR/TE=3000/90。T 對比劑是以減少橫向弛緩時間(spin-spin 2. relaxation time，T )的對比劑，其目的是以減少組織訊號來辨別組織 2. 正常與否，在強大磁場下加以特殊脈衝，即可造成訊號減弱，影像變黑，進而產生訊號對比，辨別出組織間的差異。圖3.14為體外影像結果。由結果顯示含葉酸磁性微胞，在高濃度鐵的條件下其影像明顯較黑、訊號值下降多，相對於外層無葉酸配體的磁性微胞，其影像變化較少、訊號值下降亦不多，顯示出含葉酸磁性微胞標靶的功效，也展現出磁振造影中診斷的能力。另外SI post為加入對比劑的訊號強度，SI pre為未加入對比劑的訊號強度，代入Eq(2)可得細胞影像的增強度(Enhancement(%))，. Enhancement(%)=. SI post - SI pre. *100% ……………(2). SI pre 由表3.2所示，含葉酸磁性微胞鐵濃度為10 μg Fe/ml時，已能明顯看出訊號值的減少(-31.92%)，而無葉酸磁性微胞需達40 μg Fe/ml才能有顯著的減弱(-50.44%)。在此濃度下(40 μg Fe/ml)，含葉酸磁性微胞的訊號值更是降到-73.52%。整體而言，在高濃度鐵的條件下，對過度表現葉酸受體的癌細胞株KB細胞，含葉酸的磁性微胞的確擁有較佳標靶性的功效。. 62.

(70) A. B. 40. 30. 2. 10. 6. 2. 1. control. Fe Concentration (μg/ml). 圖3.14 不同濃度下FA- PF127-PAAIO(A)、PF127-PAAIO(B)與KB細胞共同培養3小時，利用3.0 T MRI進行造影所得之影像表3.2 Signal intensity as a function of iron concentration Signal intensity PF127-PAAIO. FA-PF127-PAAIO. Control. 1021. 1012. 1 μg Fe/ml. 1056 (3.43%). 1157 (14.33%). 2 μg Fe/ml. 996 (-2.45%). 1043 (3.06%). 6 μg Fe/ml. 1006 (-1.47%). 877 (-13.34%). 10 μg Fe/ml. 1138 (11.46%). 689 (-31.92%). 20 μg Fe/ml. 1041 (1.96%). 564 (-44.27%). 30 μg Fe/ml. 930 (-8.91%). 620 (-38.74%). 40 μg Fe/ml. 506 (-50.44%). 268 (-73.52%). 63.

(71) 第四章結論多功能磁性微胞製備與特性分析在材料的合成上，我們使用 NMR 來作為 FA-PF127 反應的成功鑑定及葉酸接枝率的計算，利用 XRD 進行 PAAIO 中 Fe3O4 結晶型態的定性測量。由 NMR 中我們計算得到 FA-PF127 的葉酸接枝率為 130%，推測 FA-PF127 具有一端或ㄧ端以上的接枝，另外經 XRD 圖譜比對，得知本研究合成的氧化鐵奈米粒子的確為 Fe3O4。磁性微胞特性分析上，從 FTIR 中酯鍵的出現說明 PF127 及 FA-PF127 成功的修飾 PAAIO；並以 UV 中葉酸的特殊吸收訊號 (280nm)，證實 FA-PF127-PAAIO 裡葉酸的存在；AAS 組成比例分析，顯示磁性微胞含鐵含量為 10-15 wt%，而 60-70 wt%為修飾上去的高分子。由 DLS 分析與 TEM 觀察，當修飾上 PF127 與 FA-PF127，粒徑變大。修飾後的磁性微胞與 PAAIO 做比較時，在 DLS 或 TEM 的大小變化約為 3 倍，但是 TEM 觀察的磁性微胞大小約為 40 nm 而 DLS 為 100 nm 左右。修飾後的磁性微胞介面電位有明顯改變。超導量子干涉儀分析上，藉由磁滯曲線證明磁性微胞具超順磁性及無磁滯現象並得飽和磁化率為 74 emu/g Fe。. 細胞實驗(In vitro test) 我們使用 KB 細胞來做細胞毒性測試，顯示兩種磁性微胞幾乎不具毒性，即使乘載疏水性螢光染劑後，細胞存活率仍達 75%以上，表示我們所合成的磁性微胞極具生物相容性。之後在細胞胞噬實驗中，我們以 KB、A549 兩株癌細胞做 Flow 64.

(72) 細胞螢光強度分析及 AAS 胞噬鐵含量分析，其中，含葉酸的 FA-PF127-PAAIO 對於過度表現葉酸受體的 KB 細胞，具有高度標靶的效果。而利用 CLSM 細胞內噬模擬實驗，檢視磁性微胞進入到細胞內的追蹤，經過培養 1 小時後，無明顯葉酸標的現象，但培養 3 小時後，即可發現進到細胞內的含葉酸磁性微胞，推測具有標靶癌細胞功效，也確實有較佳的傳遞情形發生，我們也成功的利用 Nile Red 來模擬藥物在磁性微胞在 KB 細胞的釋放，結果亦證明 FA-PF127-PAAIO 具較高的螢光顯示效果。在體外磁振造影實驗結果顯示含葉酸磁性微胞，於高濃度鐵的條件下其影像明顯較黑、訊號值下降多，相對於外層無葉酸配體的磁性微胞，其影像變化較少、訊號值下降亦不多，除了顯示含葉酸磁性微胞具標靶的功效外，也展現出磁振造影中診斷的能力。總結以上實驗結果，FA-PF127-PAAIO 具有高度標靶 KB 細胞的效果，我們也成功的利用 Nile Red 模擬藥物在 FA-PF127-PAAIO 針對 KB 細胞達到遞送的功效，同時展現出磁振造影中診斷的能力，因此 FA-PF127-PAAIO 具有多功能性發展的潛力。. 65.

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