林錫璋教授-國立成功大學醫學院 I. 摘要
中文摘要
背景/ 磁熱療法為新興的治療方法之一，本研究主要之目的是研究磁性奈米顆粒在 磁場變動產熱後，產生的溫度對於小鼠大腸腫瘤及大鼠肝腫瘤細胞株生長抑制之效 益，以及對動物腫瘤的治療效果。材料與方法/ 體外測試上，收 5 x 106 cells/ml 大腸及肝腫瘤細胞，分別加入培養液及磁性奈米顆粒，於變動磁場下進行加熱處理。
實驗後，進行 XTT assay 測試細胞存活率。動物實驗則先建立小鼠大腸腫瘤及大鼠 肝腫瘤動物模式，再分磁性奈米顆粒加 PBS、磁性奈米顆粒加 30 %溫感性水膠、生 理食鹽水三組進行治療，治療後取檢體進行病理切片染色觀察。結果/ 小鼠大腸腫 瘤及大鼠肝腫瘤細胞株加磁性奈米顆粒組與控制組比較，有顯著差異(P<0.001)。動 物實驗上，磁性奈米顆粒加 PBS 組、磁性奈米顆粒加 30%溫感性水膠與控制組比較 下，小鼠大腸腫瘤(P<0.05)、大鼠肝腫瘤(P<0.001)其腫瘤重量有明顯的抑制。由二 價鐵及三價鐵染色可證實磁性奈米顆粒存在於腫瘤組織中，而細胞凋亡染色則有廣 泛的壞死及凋亡的現象。結論/ 本實驗證實磁性奈米顆粒對小鼠大腸腫瘤及大鼠肝 腫瘤細胞株及腫瘤動物皆有抑制之效果，但尚未能完全消除腫瘤。
關鍵字：磁性奈米顆粒、腫瘤細胞株、細胞凋亡 Abstract
Background Magnetic nanoparticle-induced hyperthermia is one of treatment methods under active investigation. To study the thermal effects and the optimal operation conditions to kill tumor cells and animal tumor growth, we conduct this project.
Materials and methods In vitro, we collected 5 x 106cells/ml of CT-26 and N1-S1 cell, added culture medium with or without resovist and treated them in high frequency magnetic field. XTT assay was used to measured survival rate of cell after experimental treatment. In vivo, we set up CT-26 and N1-S1 animal model. Then, the animals were divided into groups receiving treatments using: resovist in PBS, resovist in 30% hydrogel and normal saline. After treatment, we took tumor sample for pathological
examinations. Result In vitro, resovist group compared with control group had
significant difference (P<0.001) in CT-26 and N1-S1 cell line. In vivo, both resovist in PBS and in hydrogel group had less tumor burden compared with control group (BALB/c murine CT-26 model, P<0.05 and SD rodent N1-S1 model, P<0.001). Pathology
examinations showed Fe2+and Fe3+presented in the tumor tissue. TUNEL assay also showed apoptosis and necrosis in tumor extensively. Conclusion Our study proved
nanoparticle, such as resovist, in high frequency magnetic fields could generate enough hyperthermia to inhibit tumor cell growth and animal tumor growth in animal models, but can’tcuretumorcompletely atpresent.However,ourcurrentresultsarevery promising, and need further investigation.
Key words：Magnetic nanoparticle, tumor cell line, apoptosis II. 研究內容
A. 材料與方法 a. 細胞培養方法
(1) CT-26 細胞（大腸癌腫瘤細胞）
1. 以 9 公分滴管吸掉 flask 中舊的 medium (DMEM medium)。
2. PBS 5 ml wash，然後吸掉 PBS。
3. 加入 trysin，可輕拍培養瓶使 cell 自瓶壁脫落，把瓶口懸開一點放入 37℃
培養箱中作用數分鐘後，可輕拍使 cell 脫落。
4. cell 懸浮後，以 medium 終止 typsin 的作用。
5. 將 cell 吸起放入 50 ml 之離心管中。
6. 離心，800-1000 rpm，5 分鐘。此時，以 PBS wash flask，並在 flask 中加 入 10 ml medium。
7. 吸掉離心管中的上清液。
8. 以適量之 medium 沖散 cell。
9. 取一些 cell 至 flask 中。
10.將 flask 放入 37℃、5 % CO2培養箱中培養。
(2) N1-S1 細胞（肝癌腫瘤細胞）
1. 將 cell 吸起放入 50 ml 之離心管中。
2. 離心，800-1000 rpm，5 分鐘。此時，以 PBS wash flask，並在 flask 中加 入 20 ml medium(IMEM medium)。
3. 吸掉離心管中的上清液。
4. 以適量之 medium 沖散 cell。
5. 取一些 cell 至 flask 中。
6. 將 flask 放入 37℃、5 % CO2培養箱中培養。
b. 細胞體外測試 1. 細胞加熱
(1)CT-26 細胞
依照一般細胞培養方式收細胞，細胞數目為 5×106 cells/ml。分為 下列三組：
(a) Control 組：CT-26 細胞不做任何處理；
(a)Control 組：N1-S1 細胞不做任何處理；
(b)N1-S1 細胞組：N1-S1 細胞 + 0.4 ml medium，於變動磁場下， 使用高週波
2. XTT assay
製備 XTT working solution (1 mg / ml XTT 溶於 PBS，立即加入 5 mM PMS 5μl / ml)。加入 100μl / well 的 XTT solution，放入 37 ℃ 5% CO2的培養箱中 培養 6 小時。取出 300μl 至 96 well plate 讀取 450 nm 的 OD 值。
c. 建立腫瘤動物模式 (1) CT-26
1. 麻醉：balb/c mice 先稱重，再吸取足量之麻醉劑(Somnotol，施打劑量為 100 g / 0.08 ml)，從腹腔注射。
2. 種細胞：將麻醉之小鼠肛門剪一傷口，在肛門皮下黏膜注射 細胞數約 4 × 105cells / ml 的 CT-26 細胞 0.2ml。
3. 細胞打入 7 天後，開始分組進行治療。
(2) N1-S1
1. 麻醉：SD-rat 先稱重，然後吸取足量之麻醉劑(Somnotol，施打劑量為 100 g / 0.08 ml)，從腹腔注射。
待腫瘤形成後，於腫瘤分別打入 resovist 0.05 ml + PBS 0.15 ml、resovist 0.05 ml + hydrogel 0.15 ml 及控制組(PBS 0.2 ml)，再藉由外加磁場的方 式，使用高週波電感應加熱器，電流為 600A，磁場一萬七千高斯，每天對腫
瘤加熱 30 分鐘，每星期五次，持續兩週，共治療 10 次。每天量測其腫瘤大 小，並於療程結束後取腫瘤檢體做病理切片染色觀察，評估磁熱治療對腫瘤 具正面或負面之效果。
(2)N1-S1 細胞
待腫瘤形成後，於腫瘤分別打入 resovist 0.15 ml + PBS 0.15 ml、resovist 0.15 ml + hydrogel 0.15 ml 及控制組(PBS 0.3 ml)，再藉由外加磁場的方
由 N1-S1 細胞體外測試的結果可得知，利用高週波電感應器加上 resovist 可將肝癌癌腫瘤細胞殺死。
b. 腫瘤動物模式
種植 CT-26 細胞於肛門口腸黏膜處可成功長出大腸癌腫瘤，種植 N1-S1 細胞於 肝臟可成功於肝臟長出肝癌腫瘤（Fig 7.）。
c. 腫瘤動物實驗 (1) CT-26 細胞
resovist + PBS 組與控制組（只打 PBS）相比，腫瘤重量於第三、第四及第 九天有明顯的抑制（P<0.05）；resovist + hydrogel 組與控制組相比較下，
其腫瘤重量於第三、第四及第五天有明顯的抑制（P<0.05）（Fig 8.）。在 病理學觀察方面，由二價鐵及三價鐵染色（Fig 9.及 Fig 10.）來看，可發 現 resovist + hydrogel 組所存在的鐵較多。此外，藉由 TUNEL assay 染色
（Fig 11.）可看出腫瘤有廣泛的壞死與少量細胞凋亡的現象產生。
(2) N1-S1 細胞
resovist + PBS 組、resovist + hydrogel 組與控制組(normal saline)相 比，腫瘤重量於第第 12 天有明顯的抑制（P<0.001）（Fig 12.）。病理切片 染色觀察上，二價鐵及三價鐵染色（Fig 13.及 Fig 14.）以 resovist + hydrogel 組鐵存在範圍較大，而 TUNEL assay 染色（Fig 15.）可看出廣泛 壞死與細胞凋亡的現象。
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附錄
CT-26 cell in 0.2 ml medium CT-26 cell in 0.2 ml resovist
Fig 1. CT-26 細胞體外測試溫度曲線圖。此為使用高週波電感應器處理 60 min 結 果。加熱處理後，CT-26 細胞 in 0.2 ml medium 組溫度為 35.6 ℃，CT-26 細胞 in 0.2 ml resovist 組溫度則可達 62.7 ℃。
109
3
0 20 40 60 80 100 120
CT-26 cell in 0.2 ml medium CT-26 cell in 0.2 ml resovist 細胞存活率(%)
＊ ＃
Fig 2. CT-26 細胞體外測試 XTT assay 結果。此為 CT-26 細胞 in 0.2 ml medium 組及 CT-26 細胞 in 0.2 ml resovist 組，經由高週波電感應器處理 60 min，再培 養於 24 well plate 一天後的結果。＊表示與 control 組(不做任何處理)比較下，
有顯著差異(P<0.001)；＃表示與 CT-26 細胞 in 0.2 ml medium 組比較下，有顯著 差異(P<0.001)。
Fig 3. CT-26 細胞體外測試培養於 24 well plate 一天後細胞型態圖。A.為 control 組－CT-26 細胞不做任何處理；B.為 CT-26 cell in medium 組－CT-26 cell in 0.2 ml medium；C.為 CT-26 cell in resovist 組－CT-26 cell in 0.2 ml resovist，
A. B.
C.
B 及 C 組於變動磁場下，使用高週波電感應器處理 60 min。細胞數目皆為 2×105cells。
N1S1 cell in 0.4 ml medium N1S1 cell in 0.4 ml resovist
Fig 4. N1-S1 細胞體外測試溫度曲線圖。此為使用高週波電感應器處理 60 min 之
N1S1 cell in 0.4 ml medium N1S1 cell in 0.4 ml resovist 細胞存活率(%)
有顯著差異(P<0.001)；＃表示與 N1-S1 細胞 in 0.4 ml medium 組比較下，有顯著 差異(P<0.001) 。
Fig 6. N1-S1 細胞體外測試培養於 24 well plate 一天後的情況。A.為 Control 組
－N1-S1 細胞不做任何處理；B.為 N1-S1 cell in medium 組－N1-S1 cell in 0.4 ml medium；C.為 N1-S1 cell in resovist 組－N1-S1 cell in 0.4 ml resovist，B 及 C 組於變動磁場下，使用高週波電感應器處理 60 min。細胞數目皆為 5×105cells。
C 組其細胞型態上與 Control 組大不相同，為單顆狀細胞，細胞明顯有被破壞。
A. B.
C.
A. B.
Fig 7. 腫瘤動物模式圖。A.為 CT-26 細胞大腸腫瘤動物圖；B.為 N1-S1 細胞肝腫瘤 動物圖。
Fig 8. CT-26 腫瘤重量曲線圖。＊表示與 PBS(Control)比較下，有顯著差異 (P<0.05)。
Fig 9. CT-26 腫瘤二價鐵染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.
為 resovist + Hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。二價鐵染色後呈 褐色，可看出 C 組明顯較多。
B-1. C-1.
A-1.
B-2. C-2.
A-2.
B-1. C-1.
A-1.
B-2. C-2.
A-2.
Fig 10. CT-26 腫瘤三價鐵染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.
為 resovist + Hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。三價鐵染色後呈 藍色，可看出 C 組明顯較多。
Fig 11. CT-26 腫瘤 TUNEL assay 染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.為 resovist + hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。壞死或凋 亡的細胞染色後呈深褐色，可看出 C 組明顯較多。
Fig 12. N1-S1 腫瘤重量曲線圖。＊表示與 PBS(Control)比較下，有顯著差異 (P<0.001)。
B-1. C-1.
A-1.
B-2. C-2.
A-2.
Fig 13. N1-S1 腫瘤二價鐵染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.
為 resovist + Hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。二價鐵染色後呈 褐色，可看出 C 組明顯較多。
Fig 14. N1-S1 腫瘤三價鐵染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.
為 resovist + Hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。三價鐵染色後呈 藍色，可看出 C 組明顯較多。
B-1. C-1.
A-1.
B-2. C-2.
A-2.
B-1. C-1.
B-2. C-2.
A-2.
Fig 15. N1-S1 腫瘤 TUNEL assay 染色圖。A.為 Control 組；B.為 resovist + PBS 組；C.為 resovist + hydrogel 組。panel 1.為 100X；panel 2.為 400X。壞死或凋 亡的細胞染色後呈深褐色，可看出 C 組明顯較多。