磁性奈米粒子的修飾與應用

第一章緒論

1.2 磁性奈米粒子

1.2.4 磁性奈米粒子的修飾與應用

應形成鍵結。藉由此方法Kouassi等人將L-aspartic acid鍵結於Fe₃O₄表面上

19(圖3)。

圖3. L-aspartic acid 修飾上 Fe3O4表面示意圖¹⁹

楚建軍等人將 Fe₃O₄表面以 EDTA 進行修飾官能基化，利用同樣的脫水反應概念製備出能夠螯合金屬離子和放射性離子的磁性材料¹。合成所得的EDTA@ Fe₃O₄應用於混合物中金屬離子的提取，並藉由Fe₃O₄磁性達到分離的效果。結果顯示，絕大多數的螯合效果隨著溫度的提高而有所增強(圖 4)。

圖4. Fe3O4@EDTA在不同溫度條件下螯合金屬離子¹

共沉澱法也屬於直接修飾法的一種，此法是將修飾劑與金屬離子預先混合製成前趨體，金屬離子均勻穩定地分散在修飾劑中，再加入合成試

劑生成的奈米顆粒產物中，修飾劑也同時組裝到生成的奈米粒子上。這種方法中，磁性粒子不是預先製備的，而是在反應中直接生成的。Mornet 等人曾將PEGFP-N1(DNA 的一種)與 Fe²⁺和Fe³⁺混合後，通過加入氨水製備成具有 DNA 修飾表面的 Fe₃O₄粒子 ²⁰。2006 年 Zhao 等人也利用共沉澱的方式將 oleic acid 自我組裝到磁性奈米粒子上形成薄膜 ²¹，並利用 XRD、TEM、EDS、ED、FTIR、TGA/DTA、DSC 和 VSM 等分析方法來比較 oleic acid 在 Fe₃O₄及 CoFe₂O₄上不同的組裝模式，並發現 Fe₃O₄ 及CoFe₂O₄皆具有超順磁性特質。2007 年 Tapan K. Jain 等人利用上述方法將oleic acid 修飾於 Fe₃O₄表面，而整齊排列的 oleic acid 中的疏水端便成為非親水性抗癌藥物Doxorubicin 的容器 ⁵(圖 5)。

圖5. Oleic acid@Fe3O4成為非親水性抗癌藥物Doxorubicin 的載體 ⁵

(2) 間接組裝法

間接組裝法是將分子組裝到先行修飾而具有-NH₂、-COOH、-SH 等官

能基的奈米顆粒表面，再藉由這些官能基與欲修飾物形成化學鍵結合改

2005 年 Yu-Chie Chen 等人欲將生物抗體 Vancomycin 直接修飾於 Fe₃O₄ 載體上，但發現直接修飾的效果不彰，乃改採 Vancomycin 先以 N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride 進行結合後 再與 Fe₃O₄ 反應，脫去 N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloridec 後將 Vancomycin 修飾於 Fe₃O₄表面⁷ (圖 8)。修飾於 Fe₃O₄ 載體上的 Vancomycin，藉由氫鍵作用可從尿液當中分離革蘭氏陽性菌，

最後將奈米顆粒由尿液中取出置於MALDI 游離源以質譜進行分析，成為一生物探針的運用。

圖7. (1)以 APTEM 進行 Fe3O4表面氨基化，(2)在磷酸緩衝液中加入 EDSC 和 NHS 對 BSA 進行修飾，(3)修飾後 BSA 與氨基化脫去尿素形成共價鍵結合²²

圖8. Vancomycin 以 Fe3O4為載體示意圖⁷

不同於氨基化，若改以將羧基化合物(-COOH)修飾到Fe₃O₄表面，則此羧基與具有-NH₂官能基化合物反應形成胜肽鍵結合，或與具-OH基化合物形成縮酸酯，若是要以雙硫鍵將化合物結合上Fe₃O₄，則先將具-SH官能基化合物修飾到Fe₃O₄上，在與另一化合物中的硫基發生硫醇反應則可達到目的。

取代反應則是另一種形式的間接修飾法，2006年Shao-Long Tie等人將 Fe²⁺和Fe³⁺與草酸於鹼性中合成草酸@Fe₃O₄的複合型磁性奈米粒子，而後在酸性溶液中以胺基酸將草酸置換出達到氨基酸與結合的目的²³(圖9)。

圖9. 胺基酸置換草酸修飾於 Fe3O4表面示意圖²³

2008 年 Shao-Wen Cao 等人更進一步將以微胞的方式將 Fe₃O₄顆粒聚集形成中空的球體，並在表面修飾聚乙二醇，將藥物ibuprofen 承載於中空球體中⁶，相較於只侷限於Fe₃O₄顆粒表面的承載方式，此方法可以又更多的藥物承載量(圖 10)。

圖10. Fe3O4聚集形成中空的球體作為藥物ibuprofen 的載體示意圖⁶

1.6 論文目的

由天然物中萃取生物鹼(alkaloids)，傳統上是利用物質於水層和有機層分佈係數的不同經多次萃取而得到 ⁴，這種分離方式需耗費許多有機溶劑，製程中所需的大量有機溶液不但增加操作成本，而且使用後的有機廢液對環境更是極大的汙染源，此外多次萃取的純化過程更是耗時。離子交換樹脂的使用可改善傳統萃取方式的缺點，藉由離子競爭或是改變 pH 值的方式，原先被離子交換樹脂所吸附的目標物可以被脫附而純化

24-27。然而離子交換樹脂所用的沖提液用量仍大，因此純化時目標物的濃

縮效率還可以進一步改善，此外離子交換樹脂需裝填於管柱中，固定的填充量使其在對不同樣品量的操作上較不具有彈性。

本實驗的目的在於找出一種能取代傳統方法，並較離子交換法具有更好的濃縮效果，以及在樣品量操作更具有彈性的特定物質純化方法，為達此目的我們將Fe₃O₄表面以EDTA 加以修飾，利用 EDTA 在極廣的 pH 值範圍內皆可以靜電吸引力吸附離子，再以少量特定pH 的溶劑依序將目

標物脫附，達到具選擇性和高濃縮率的純化效果。研究中以不同胺基酸的混合液做為測試樣品，以簡化實驗時可能遭遇到的變因，所得結果將可做為未來實際運用於萃取天然物中生物鹼的參考資料。

已知 Fe₃O₄本身就可以對胺基酸進行吸附脫附，然而 EDTA 具有多個羧基，而在pH 2-14 之間具有不同的負電性(圖 11)，除了可以提供較 Fe₃O₄

圖11. EDTA 在不同 pH 值下的電性分佈圖²⁸

或單一羧基化Fe₃O₄粒子較佳的吸附力，並可在以脫附方式純化目標物時有較佳的選擇性。研究中胺基酸的純化需藉助靜電力來吸附或脫附目標物，Fe₃O₄的等電點為6.53，因此 pH<等電點時有些陽離子型胺基酸會與 Fe₃O₄粒子表面正電荷因電性相同而排斥無法吸附，同樣的pH>等電點時 Fe₃O₄ 粒子表面為負電荷，有些陰離子型式胺基也因與 Fe₃O₄ 粒子表面電性相同而排斥，無法吸附。將 Fe₃O₄ 表面以 EDTA 修飾成 EDTA@Fe₃O₄，應可以大幅降低EDTA@ Fe₃O₄的等電點，而使更多種類

的胺基酸可被吸附，並以調節溶液 pH 的方式，依序將不同 pI 值的胺基酸脫附純化。

EDTA@Fe₃O₄純化胺基酸的量與 EDTA 於 Fe₃O₄表面的修飾量有直接關係，因此尋求 EDTA@Fe₃O₄的最佳生成條件為研究重點之ㄧ。探討的條件包含以不同EDTA 和 Fe₃O₄重量比進行合成，所用EDTA/Fe₃O₄比例為10 %、20 %、30 %、40 %，此外探討不同合成方式所得 EDTA@Fe₃O₄ 的差異性。

吸附性與脫附性將以 arginine (pI 10.76)、histidine (pI 7.5)和 valine (pI 6.0) 三種胺基酸做為樣本，實驗中除了探討單一胺基酸的表現，也將三種胺基酸混合，了解在競爭下各胺基酸的吸附情形。液相層析質譜儀(LC/MS) 將被用來偵測，胺基酸於特定pH 的吸附性以及吸附量與時間的關係，同時也將用於探討不同pH 時，特定胺基酸於 EDTA@ Fe₃O₄表面的脫附性。

整體實驗流程示意圖如下(圖 12)。

圖12. 本論文目的示意圖

第二章材料與方法

實驗中所使用的 arginine (Arg)、histidine (His)以及 valine (Val)溶液皆是先行配製成10^-2 M 儲存溶液(stock solution)，單一胺基酸吸附實驗時，取 10 μL 胺基酸儲存溶液加入 990 μL 去離子水稀釋成 10^-4M 溶液使用。胺基酸混合液吸附實驗時，各取10 μL 的 Arg、His 和 Val 10^-2 M 儲存溶液以去離子水稀釋成10^-4M 溶液。

2.2 儀器

IR(傅氏轉換紅外光譜儀) : PerkinElmer Spectrum RXI FT-IR。

TGA(熱重分析儀) : LABSYS^TM SETARAM Thermogravimetric Analyzer。

X-Ray(X 光粉末繞射儀)：Rigaku Corporation Multiflex 2KW X-RayPowder Diffraction，XRD。

LC-MS(液相層析質儀)：Micromass Q-TOF Liquid Chromatography- Mass Spectrometer，ESI 游離源，正電模式。

2.3 實驗流程

實驗中所使用的 Fe₃O₄可分為兩種，除了直接購自Aldrich 外，也採用水熱合成法自行合成。合成方法如下：取 0.1839 g 的 FeCl₂．4H₂O 與

0.5011 g 的 FeCl₃．6H₂O 分別以 7 mL 的去離子水溶解，將兩種溶液混合

入15 μL 的 37 % HCl 溶液，反應 1 個小時後取部分樣品固體做分析檢測，

的水溶解，另取0.1514 g 的 EDTA 以 1 mL 去離子水溶解，將三種溶液

左右10 %的 NH₄OH 溶液進行 10 分鐘的脫附。

(2) Hisdine

將吸附 His 的 EDTA@Fe₃O₄(EDTA@Fe₃O₄---His)，先以去離子水清洗兩次，每次洗液皆注入液相層析質儀檢測。以500 μL 的 pH 9 NH₄OH 溶液與EDTA@Fe₃O₄---His 混合 20 分鐘進行脫附。

(3) Arginine + Hisdine + Valine

^將吸附了Arg 、 His 和 Val 的 EDTA@Fe₃O₄ (EDTA@Fe₃O₄---AA)以 500 μL 的去離子水連續清洗 3 次；再以 500 μL pH 9 的 NH₄OH 溶液脫附 3 次，每次 10 分鐘；再以 500 μL pH 10 的 NH₄OH 溶液脫附 3 次，每次 5 分鐘；最後以 500 μL pH 12 的 10 % NH₄OH 溶液脫附 3 次，每次 10 分鐘。

2.3.5 TGA 實驗條件

^取0.01 g 的 EDTA@Fe₃O₄樣品於氮氣下以5 ℃ / min 加熱速度由 50 ℃ 加熱至700 ℃。

第三章結果與討論

3.1 Fe

O

與羧基的脫水反應

為了初步了解本研究的可行性以及未來的擴展性，我們先嘗試將Fe₃O₄ 與pimelic acid (PA)和 6-aminocaproic acid (6AA)進行脫水反應。EDTA 分子中具有多個羧基，雖可較為穩定欲吸附的胺基酸，卻也有可能因為分子間的排斥力太大造成與 Fe₃O₄ 結合時修飾量過低導致後續實驗執行上的困難，因此先以只含兩個羧基排斥力較小的PA (圖 13a)與 Fe₃O₄表面進行反應。而以EDTA 或 PA 修飾 Fe₃O₄時，Fe₃O₄表面為帶負電性羧基化，

適用於吸附樣品中具正電性的物質。為了解未來計畫的擴展性，選擇了含羧基與氨基的6AA(圖 13b)與 Fe₃O₄表面作用將其表面氨基化而可對樣品中具負電性的物質進行吸附。

(a) (b)

圖13. (a) pimelic acid；(b) 6-aminocaproic acid 結構圖

與未修飾的Fe₃O₄IR 圖比較，PA@Fe₃O₄於1700 cm^-1左右多了一個IR 吸收峰，位置接近PA 中的 ν_C=O的吸收波長，而在 1200-1400 cm^-1左右亦

出現原本在 Fe₃O₄所沒有的吸收峰(圖 14)。此外，3400 cm^-1左右吸收強度相對於600 cm^-1左右吸收強度也因Fe₃O₄與PA 結合而增大。

圖14. 以 pimelic acid 修飾 Fe₃O₄表面 IR 圖，(a) pimelic acid；(b) Fe₃O₄； (c) pimelic acid@Fe₃O₄

相反的，6AA@ Fe₃O₄和Fe₃O₄的IR 圖之間並無明顯變化(圖 15) ，暗示著 6AA 並沒有如預期般的結合上 Fe₃O₄，代表著在我們選用的條件下尚無法達到將Fe₃O₄表面以6AA 修飾的目的。

圖15. 以 6-aminocaproic acid 修飾 Fe3O4表面 IR 圖，(a) 6-aminocaproic acid；(b) Fe3O4；(c) 6-aminocaproic acid@Fe3O4

成功的在 Fe₃O₄表面以PA 加以修飾後，我們改以探討如何將 EDTA 與 Fe₃O₄結合。由於 EDTA 與 Fe₃O₄的結合已有文獻報導 ¹，但對於其間如何達到最佳的結合量卻無著墨，因此我們針對兩者反應時的一些參數進行改變，期望能達到一個較佳的修飾量，以便後續的吸附和脫附實驗中也能獲得最佳效益。

3.2 Fe

O

與 EDTA 修飾量的探討

圖16. 以不同重量比例 EDTA 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a)EDTA；(b) Fe3O4； EDTA@ Fe3O4 (c) 10%；(d) 20%；(e) 30%；(f) 40%

圖17. (a)脫水反應合成的 EDTA@Fe3O4 (40%)；(b) Fe3O4與EDTA 以重量比100：40 物理混合 IR 圖

IR 圖於 EDTA 與 Fe₃O₄形成共價鍵時，羧基與Fe 原子的結合型式則可從ν_C=O(as)與 ν_C=O(s)的差值提供線索，依據文獻三種不同結合型態會導致不同結果的差³⁰。EDTA 的 IR 圖顯示 ν_C=O(as)與 ν_C=O(s)吸收分別位於 1686 cm^-1與1420 cm^-1，其差值為266 cm^-1。EDTA 與 Fe₃O₄結合時，其間不同結合型態所產生的ν_C=O(as)與 ν_C=O(s)震動吸收峰差與相對應的理論鍵結形式如下所示:

(1)遠大於 266 時 (2)遠小於 266 時 (3)接近 266 時

圖19. EDTA@Fe3O4 IR 圖中，於 1683 cm^-1的吸收峰

在文檔中 EDTA官能基化磁性奈米粒子之合成及其應用 (頁 19-0)

第一章 緒論