EDTA官能基化磁性奈米粒子之合成及其應用

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(1)國立高雄大學應用化學研究所碩士論文. EDTA官能基化磁性奈米粒子之合成及其應用. Synthesis of EDTA Functionalized Magnetic Nanoparticle and Its Applications. 研究生：潘守謙撰指導教授：何永皓博士. 中華民國九十七年八月.

(2) 謝誌兩年的研究生生崖告一段落，卻可以說是目前為止改變我最大的兩年。何永皓老師於這兩年來對我的教導，不論是在課業、研究以致於各種方面授予我的學習，我一定會永遠銘記於心。從一開始我的叛逆、偷懶跟不受教，老師給予我的空間、尊重以及不厭其煩的循循善誘，一直到我開始對研究產生真正的興趣，跟老師一起努力甚至有如戰友一般的感覺，在寫這篇謝誌時仍歷歷在目。在此，對幫助我順利完成碩士學位付出最多的何永皓老師獻上我最大的感激與感謝。在此感謝鄭建中老師、劉福鯤老師以及蔡振章老師，除了於研究方面給予我非常大的幫助外，更於百忙之中參加我的學位口試並給予我指導和很多寶貴的意見，非常感謝各位老師。特別感謝化材系的杰銘於儀器資源上的協助以及研究其間替我分擔許多工作實驗室的學弟妹們，汪達、大頭、瞬、叮叮、飄、子揚、峪緯、可惡、Tank 還有已經畢業離開實驗室都有很好發展的錦紋和胡林，這兩年在各方面給予我的幫助，沒有你們我無法完成我的碩士論文。同梯的敬燾、旼龍、白鯨等人，我不會忘記在研究遇到難題時，我們曾一起鼓勵、一起發洩、一起突破；最後感謝我的家人以及女友敏倫，總能在我遇挫不順利時給予我關懷，生活中有他們支持著我使我有更堅強的毅力完成我的學位。最後的最後，對於所有幫助過我的人再次誠摯的說聲謝謝你們！. 潘守謙中華民國九十七年八月二十五日 I.

(3) 目錄中文摘要--------------------------------------------------------------------------------1 英文摘要--------------------------------------------------------------------------------2 第一章緒論---------------------------------------------------------------------------3 1.1 前言----------------------------------------------------------------------------------3 1.2 磁性奈米粒子---------------------------------------------------------------------5 1.2.1 奈米粒子的特性-----------------------------------------------------------5 1.2.2 磁性的種類-----------------------------------------------------------------6 1.2.3 磁性奈米粒子的特性與合成方法--------------------------------------7 1.2.4 磁性奈米粒子的修飾與應用-------------------------------------------11 1.3 論文目的-------------------------------------------------------------------------17 第二章材料與方法-----------------------------------------------------------------20 2.1 藥品與溶液配製----------------------------------------------------------------20 2.2 儀器-------------------------------------------------------------------------------20 2.3 實驗流程-------------------------------------------------------------------------20 2.3.1 脫水鍵結法修飾-----------------------------------------------------------21 2.3.2 共沉澱法修飾--------------------------------------------------------------22 2.3.3 市售 Fe3O4 與 EDTA@Fe3O4 對胺基酸吸附的比較------------------23 2.3.4 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的脫附----------------------------------------23 2.3.5 TGA 實驗條件-------------------------------------------------------------24 第三章結果與討論-----------------------------------------------------------------25 3.1 Fe3O4 與羧基的脫水反應-------------------------------------------------------25 3.2 Fe3O4 與 EDTA 修飾量的探討-------------------------------------------------28 II.

(4) 3.2.1 EDTA@Fe3O4 表面特性的研究----------------------------------------36 3.2.2 不同的 EDTA 修飾條件-------------------------------------------------45 3.3 Fe3O4 的吸附行為----------------------------------------------------------------52 3.4 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的吸附行為-----------------------------------------56 3.5 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的脫附行為-----------------------------------------64 3.6 結論-------------------------------------------------------------------------------72 第四章參考文獻--------------------------------------------------------------------75. III.

(5) 圖目錄圖1.. 單位晶格的 Fe3O4 示意圖；紅，綠，及藍球代表 A-site 鐵，B-site 鐵及氧離子--------------------------------------------------------------------8. 圖2.. 熱分解前趨法製備磁性奈米粒子-----------------------------------------9. 圖3.. L-aspartic acid 修飾上 Fe3O4 表面示意圖-------------------------------12. 圖4.. Fe3O4@EDTA 在不同溫度條件下螯合金屬離子---------------------12. 圖5.. Oleic acid@ Fe3O4 成為非親水性抗癌藥物 Doxorubicin 的載體---13. 圖6.. 間接組裝修飾磁性奈米顆粒示意圖------------------------------------14. 圖7.. (1)以 APTEM 進行 Fe3O4 表面氨基化，(2)在磷酸緩衝液中加入 EDSC 和 NHS 對 BSA 進行修飾，(3)修飾後 BSA 與氨基化脫去尿素形成共價鍵結合---------------------------------------------------------15. 圖8.. Vancomycin 以 Fe3O4 為載體示意圖-------------------------------------15. 圖9.. 胺基酸置換草酸修飾於 Fe3O4 表面示意圖-----------------------------16. 圖10. Fe3O4 聚集形成中空的球體作為藥物 ibuprofen 的載體示意--------17 圖11. EDTA 在不同 pH 值下的電性分佈圖------------------------------------18 圖12. 本論文目的示意圖---------------------------------------------------------19 圖13. (a) pimelic acid；(b) 6-aminocaproic acid 結構圖----------------------25 圖14. 以 pimelic acid 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a) pimelic acid；(b) Fe3O4； (c) pimelic acid@ Fe3O4----------------------------------------------------26 圖15. 以 6-aminocaproic acid 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a) 6-aminocaproic acid；(b) Fe3O4；(c) 6-aminocaproic acid@ Fe3O4-----------------------27 圖16. 以不同重量比例 EDTA 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a)EDTA；(b) Fe3O4； IV.

(6) EDTA@ Fe3O4 (c)10%；(d) 20%；(e)30%；(f)40%----------------------29 圖17. (a) 脫水反應合成的 EDTA@ Fe3O4 (40%)；(b) Fe3O4 與 EDTA 以重量比 100：40 物理混合 IR 圖----------------------------------------------30 圖18. EDTA 中羧基與相鄰的 Fe 原子鍵結成 bridging 的結構--------------31 圖19. EDTA@ Fe3O4 IR 圖中，於 1683 cm-1 的吸收峰------------------------32 圖20. Fe3O4 的 TGA 圖-------------------------------------------------------------33 圖21. EDTA 的 TGA 圖------------------------------------------------------------33 圖22. EDTA @ Fe3O4 的 TGA 圖-------------------------------------------------34 圖23. EDTA 於 Fe3O4 表面的雙層結構示意圖--------------------------------35 圖24. 不同 pH 值下合成 EDTA@ Fe3O4，(a) pH 3；(b) pH 1-----------------36 圖25. 將 EDTA@ Fe3O4 用 pH 3 溶液清洗，(a) EDTA@Fe3O4 (40 %)；(b) 第三次清洗；(c) 第五次清洗 IR 圖-------------------------------------38 圖26. 將 EDTA@ Fe3O4 用 pH 5.6 溶液清洗，(a) EDTA@Fe3O4 (40 %)； (b) 第三次清洗；(c) 第五次清洗 IR 圖--------------------------------38 圖27. (a) Fe3O4；(b) EDTA@Fe3O4 (40%)；EDTA@Fe3O4 ；(c) 經五次酸洗後；(d) 經五次水洗後；(e) 經五次鹼洗後 IR 圖-------------------40 圖28. EDTA@Fe3O4 經三次鹼洗後的 TGA 圖--------------------------------41 圖29. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 5.6 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd (c) 3rd；(d) 4th；(e) 5th------------------------------------------------------42 圖30. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 9 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd； (c) 3rd-------------------------------------------------------------------------43 圖31. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 3 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd； (c) 3rd；(d) 4th；(e) 5th------------------------------------------------------44 V.

(7) 圖32. (a) EDTA@ Fe3O4 (40%)；(b) EDTA@ Fe3O4 (100%) IR 圖---------46 圖33. 文獻中所提出 EDTA 脫水修飾於 Fe3O4 表面 IR 圖-------------------47 圖34. (a) 市售 Fe3O4；(b) NaOH; (c) NH4OH 水溶液中以水熱合成 Fe3O4 之 X-Ray 圖-------------------------------------------------------------------48 圖35. (a)市售 Fe3O4；(b) NaOH; (c) NH4OH 水溶液中以水熱合成 Fe3O4 之 IR 圖------------------------------------------------------------------------49 圖36. (a) NaOH 水溶液中以水熱合成之 Fe3O4；(b) (a)中產物添加 EDTA 後之 EDTA@Fe3O4；(c) NH4OH 水溶液中以水熱合成之 Fe3O4；(d) (c)中產物添加 EDTA 後之 EDTA@ Fe3O4 所得 IR 圖----------------50 圖37. (a) 共沉澱法合成之 EDTA@Fe3O4；(b) 以 HCl 洗滌 EDTA@ Fe3O4 之 IR 圖------------------------------------------------------------------------52 圖38. (a) aspartic acid；(b) arginine 結構圖------------------------------------53 圖39. Fe3O4 吸附 aspartic acid 過程中溶液之質譜圖，(a) T0；(b) 吸附 5 min；(c) 吸附 20 min--------------------------------------------------------54 圖40. Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a) T0；(b) 吸附 5min; (c) 吸附 20 min-------------------------------------------------------------------55 圖41. pH 9 溶液中 Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖， (a) T0；(b) 吸附 5 min；(c) 吸附 20 min-----------------------------------------------56 圖42. (a) arginine；(b) histidine；(c) valine 結構圖----------------------------57 圖43. EDTA@ Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg 液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min；(e) 吸附 1 hour-------58 圖44. EDTA@ Fe3O4 吸附 histidine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M His 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min--------------------------59 VI.

(8) 圖45. EDTA@ Fe3O4 吸附 valine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min；(e) 吸附 1 hour---------61 圖46. pH 3 溶液中 EDTA@ Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min-------------62 圖47. EDTA@ Fe3O4 吸附 arginine，histidine 和 valine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg/His/Val 混合溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min----------------------------------------------------------------------63 圖48. EDTA@Fe3O4---Arg 水洗液質譜圖，(a) 第一次水洗液；(b)第二次水洗液------------------------------------------------------------------------64 圖49. EDTA@Fe3O4---Arg 於 pH 9 脫附時溶液質譜圖，(a) 第一次脫附液；(b) 第二次脫附液------------------------------------------------------65 圖50. EDTA@Fe3O4---Arg 於 pH 12 脫附時之質譜圖-----------------------66 圖51. EDTA@Fe3O4---His 水洗液質譜圖，(a) 第一次水洗液；(b)第二次水洗液------------------------------------------------------------------------66 圖52. EDTA@Fe3O4---His 於 pH 9 脫附時之質譜圖-------------------------67 圖53. EDTA@Fe3O4---AA 水洗液之質譜圖，(a)第一次水洗液；(b) 第二次水洗液；(c) 第三次水洗液---------------------------------------------69 圖54. EDTA@Fe3O4---AA 於 pH 9 脫附時溶液質譜圖，(a) 第一次脫附液；(b) 第二次脫附液；(c) 第三次脫附液-----------------------------70 圖55. EDTA@Fe3O4---AA 於 pH 10 脫附時溶液質譜圖，(a) 第一次脫附液；(b) 第二次脫附液；(c) 第三次脫附液-----------------------------71 圖56. EDTA@Fe3O4---AA 於 pH 12 脫附時溶液質譜圖，(a) 第一次脫附液；(b) 第二次脫附液；(c) 第三次脫附液；(d) 第四次脫附液-----72 VII.

(9) EDTA官能基化磁性奈米粒子之合成及其應用指導教授：何永皓博士國立高雄大學應用化學系研究所學生：潘守謙國立高雄大學應用化學所摘要 Fe3O4 奈米粒子因具有磁性而極易將其以外加磁場方式從複雜的基質中分離出，若將 Fe3O4 表面加以修飾使其具有特殊的官能基，則官能基化的 Fe3O4 則可與特定的目標物作用結合。基於這兩項特質，官能基化的 Fe3O4 適合用於取代現有以多次有機溶劑萃取純化天然物中特殊物質的操作，成為一符合綠色環保的技術。本研究以脫水反應將 EDTA 結合於 Fe3O4 粒子上(EDTA@Fe3O4)使其成為一具有強烈負電性的磁性奈米粒子，再以 EDTA@Fe3O4 針對不同胺基酸進行其吸附、脫附行為的探討。希望藉由此項研究結果，未來可將其應用於萃取天然物中生物鹼的功用上。研究中發現，不同實驗條件對 EDTA@Fe3O4 粒子上 EDTA 的結合量以及作用力有很大的影響。從 IR、TGA 及 MS 的資料顯示，EDTA 與 Fe3O4 之間的作用力可以離子鍵或共價鍵存在，而在這兩種作用力可簡易的由 IR 波數的 1683cm-1 和 1636cm-1 吸收峰代表，這種由 IR 圖中兩個不同吸收峰強度來代表 Fe3O4 表面修飾物作用力種類的方式，據我們所知為首次被提出。雖然 Fe3O4 本身於特定 pH 值下也可以對 aspartic acid 進行吸附，卻無法如 EDTA@Fe3O4 般可吸附 arginine 等鹼性胺基酸。以 EDTA@Fe3O4 對 arginine(Arg)、 histidine(His)和 valine(Val)三種胺基酸的吸附、脫附。研究結果顯示，Val 的吸附效果不佳，但藉由 pH 的調控是可以選擇性的將 His 和 Arg 提取純化。關鍵字：Fe3O4、官能基化、純化、胺基酸、IR、EDTA. 1.

(10) Synthesis of EDTA Functionalized Magnetic Nanoparticle and Its Applications. Advisor: Dr. Yeung-haw Ho Institute of Applied Chemistry National University of Kaohsiung Student: Shou-Chien Pan Institute of Applied Chemistry National University of Kaohsiung ABSTRACT. Due to the magnetic property, Fe3O4 nanoparticles can be easily removed from a complex system via applying a magnetic field. Moreover, surface of Fe3O4 can be modified and functionalized to interact with special components in solution. Hence, functionalized Fe3O4 has a potential to be an environmental friendly method to replace traditional method for purified components from nature products. Here, we demonstrate usage of Fe3O4 that its surface was modified by EDTA (EDTA@ Fe3O4) to purified amino acids from a solution. The EDTA@ Fe3O4 was obtained by condensation reaction between EDTA and Fe3O4. The technique can be used to purify alkaloids from nature products in the future. Studies showed that a double layers formed on the surface of Fe3O4 while it reacts with EDTA under pH 1 aqueous solution. The inner layer of double layers is consisted of covalent bonds between EDTA and Fe3O4 and the outer layer is formed by the ionic interactions between EDTA and Fe3O4. This phenomenon was confirmed by IR, TGA and MS analyses. Instead of typical one absorption peak, two peaks that related to νC=O(as),1636cm-1 and 1683cm-1 were appeared in IR spectra of EDTA@ Fe3O4. As we know, this is first time that used IR spectra but not TGA data to describe the formation of double layer on Fe3O4 surface. Although Fe3O4 itself can absorb acidic amino acids, it cannot absorbed basic amino acid. Result of using EDTA@ Fe3O4 to perform purification of amino acids from solution contained arginine (Arg), histidine (His) and valine (Val) showed that Arg and His can be absorbed and desorbed to achieved purification. Nevertheless, Val cannot be absorbed under the experimental conditions used. Keywords: Fe3O4、functionalized、purify、amino acids、IR、EDTA. 2.

(11) 第一章緒論 1.1 前言奈米粒子(nanoparticles)具有極大的表面積/體積比，衍生出所謂的奈米效應(nano effect)，現今被廣泛的應用於如醫療及生物科技等各種領域中 1,5,6,7. 。其中磁性奈米粒子因具有磁性特質可以外加磁場的方式控制其動. 向，又可在其表面加以修飾而成具有磁性以及特殊功能性的雙重性 (bifunctional)粒子，因而大為增強其應用性。靶向藥物的應用則是以磁性奈米粒子做為抗癌藥物載體並利用磁性控制其進入人體內的動向，直接針對患部做治療. 5,6. ，藥物承載量及在人體內藥物釋放時間的長短，則是. 與磁性奈米粒子表面的修飾物性質有關。值得注意的是，磁性奈米粒子易於從所處的環境中以外加磁場方式與基質(matrix)分離，使得磁性奈米粒子在化合物鑑定或純化的應用上有極佳的潛力。應用時可修飾磁性奈米粒子表面使其表面具有特殊官能基，而後借助此特殊官能基與複雜樣品中特定物質間的作用將分析物或目標物由複雜樣品中分離出. 1,7. 。分析. 物的鑑定可以兩種方式進行：(1) 測量因分析物與磁性奈米粒子作用所導致的樣品溶液物性改變 1；(2) 將已提取分析物的磁性奈米粒子以外加磁場的方式使其與樣品分離後對此奈米粒子進行分析 7。傳統上針對磁性奈米粒子表面官能基化的修飾方法可分為直接修飾與間接修飾兩種，然而已知文獻中對兩種不同修飾方法所得奈米粒子間成果的比較則較少著墨。本文中將討論於不同條件下 EDTA 與 Fe3O4 反應生成的 EDTA@Fe3O4 粒子間有何不同。依據 IR、TGA 和 MS 等分析資料所得，發現 EDTA@Fe3O4 樣品中 EDTA 與 Fe3O4 間的作用力，會因反應. 3.

(12) 時溶液 pH 的不同，而從共價鍵轉為離子鍵與共價鍵並存，致使 EDTA 在 Fe3O4 表面形成雙層結構。兼具特殊官能基化和磁性雙重性的磁性奈米粒子，既可從複雜的混合物樣品中吸附出目標物，又能不須經由過濾，即可輕易的將已吸附目標物的磁性奈米粒子從混合物中分離出，因而是一種極佳的環保材料。有鑑於此，本研究嘗試將 Fe3O4 表面以 EDTA 加以修飾成具有多個羧基 (-COOH)及磁性雙重性粒子，藉助 EDTA 具有多個 pKa 的特性，提供較一般單一羧基化磁性奈米粒子較佳的吸附力，並在脫附、純化目標物時有較佳的選擇性。研究中以胺基酸混合液作為樣品，探討胺基酸於 EDTA@Fe3O4 的吸附和脫附現象，其結果可提供未來從天然物等更複雜樣品中純化特定物質的參考。藉由 EDTA@Fe3O4 來純化天然物中特定物質的方法，將可省卻傳統純化方法中耗時的過濾處理，以及大量有機廢液的產生。離子交換樹脂的應用雖然也可以有相似的效果，然而磁性奈米粒子因具有高表面積，使其有較樹脂更佳的負載量。此外使用離子交換樹脂時，須隨不同的處理量而用不同規格的管柱，而將吸附於樹脂上的物質脫附時，需較大量的沖提液，相反的磁性奈米粒子的使用量可隨意添加而不受限制，使用時只需置入脫附液中攪拌，待目標物脫附後再以磁鐵將其移除即可，不但不需使用大量的沖提液並具有濃縮效果，因此以 EDTA@Fe3O4 來純化天然物中特定物質是一種較離子交換樹脂更佳的方法。. 1.2 磁性奈米粒子 1.2.1 奈米粒子的特性. 4.

(13) 一個物質大小縮至奈米以下時，會呈現有別於巨觀尺度下的物理、化學或生物特性與現象，導致原有材料性質發生改變或是出現新的性質，這個現象稱之為奈米效應；奈米效應包含表面積效應和量子尺寸效應。表面積效應為表面積增加而引發物質化學活性和光學或熱性質等物性的改變，奈米粒子其表面原子或分子較同粒子中非表面原子或分子具有更多的表面能，隨著粒子尺寸的縮小，粒子中表面原子數與總原子數的比值急速增加，表面能隨之增加而促使奈米粒子的活性和物性改變，原本具惰性的金(Au)製成奈米粒徑後可用來當作催化劑即為表面積效應的一例 8。縮小粒徑所誘導的另一種物理現象為量子尺效應。金屬物質其費米能階 9（Fermi level，絕對零度時電子占據的最高能階）附近的電子能階差，是與粒子直徑的三次方成反比。大尺寸的金屬粒子可視為由無限個原子組成，而其總電子數趨近無限大，因此電子能階差為零使能量呈現連續態。奈米粒子則因電子數目有限，能階有間距而呈不連續狀態。這種因粒徑變小而導致物質能階、能隙或能帶的改變稱之為量子尺寸效應。奈米科技充分利用了奈米效應來操作、控制原子或分子以組合成具有不同機能與特性的奈米尺度新結構，並以其為基礎製作組裝全新功能的材料、器具或系統。. 1.2.2 磁性的種類原子是由原子核以及核外的電子所組成的，磁性的來源是由於電子的移動，因為電子除了對原子核公轉之外，同時的也在自轉，所以產生了軌道磁性和自旋磁性，其中自旋(spin)有分 +1/2 、－1/2 兩種方向，產. 5.

(14) 生兩種不同的自旋磁性類型。若原子中，兩種不同自旋方向的電子數目一樣多，則兩種不同類型的自旋磁性可以互相抵銷，而原子是不帶磁性的。反之，若原子中的電子數目不一樣，則部份的磁性無法被抵銷，而導致整個原子都帶有磁性。磁性物質中原子磁矩之間彼此作用導致不同的排列方式，而形成不同的磁性，磁性可分成順磁性(paramagnetism)、反磁性 (diamagnetism) 、鐵磁性 (ferromagnetism) 和超順磁性 (superparamagnetic effect)四種，其中順磁、逆磁為暫時性，鐵磁性為永久性。有一些由原子和分子構成的物質，因其本身就是由許多微小的磁體組成，若無外力作用，它們不會造成任意排列，而且只是因本身的作用力會互相牽制，而不呈磁性。外加入一個磁場時，所得之方向與外加磁場相同，當外加磁場移除後，它的感應磁化量會回到零，故為暫時性的磁性，此種特性稱為順磁性，如：氯化銅、鋁、鈉、硫酸鎳等皆為此類。反磁性是相反於順磁性的一種磁性種類，當處在外加磁場中，會對磁場產生的微弱斥力，即相反於外加磁場方向的磁力方向。同樣的，當外加磁場移除後，它的感應磁化量會回到零，故亦為暫時性的磁性，如:氫原子等。不同於順磁性、反磁性，當外加磁場移除後，它的感應磁化量會回到零，一些物質的感應磁場不會因外加磁場的移除而完全消失，也就是這些物質受到磁化而擁有殘磁性屬於永久性的，這一類的元素我們稱之為鐵磁性物質，如：鐵、鈷、鎳等。一般鐵磁性物質於居里溫度以上時因具有足夠的熱能，破壞彼此分子間的磁性吸引力而能從鐵磁性轉變為順. 6.

(15) 磁性，居里溫度以下時熱能不夠，則可維持鐵磁性。於低於居里溫度時，熱能雖不足以破壞原子間的磁性作用力，卻足以改變 1-10 nm 微小晶體的磁性方向，導致整體物質自發性磁化強度為零而具有順磁性，此種現象稱之為超順磁性。因此，當鐵磁性物質粒徑在奈米尺度下會具有超順磁性。. 1.2.3 磁性奈米粒子的特性與合成方法常用的磁性奈米粒子有氧化鐵: Fe3O4、γ-Fe2O3 以及 MFe2O4(M=Mn、 Mg、Zn、Co、Fe)，其中 Fe2O3 由於其晶格排列方式而有 α-Fe2O3、γ-Fe2O3 等形式﹐其中 γ-Fe2O3 是具有磁性的，故較被廣泛使用。上述磁性奈米粒子中又屬 Fe3O4 和 γ-Fe2O3 於相關研究中被多數運用。鐵元素具有未成對電子，當與氧結合形成氧化鐵奈米粒子，原子間距離轉為緊密而電子間互相影響增大，原先鐵元素的鐵磁性因而轉變為超順磁性。經外加磁場感應產生磁化量後，氧化鐵奈米粒子具有一般順磁性磁化量的ㄧ百萬倍。除了所產生的奈米效應造成不同於一般材料的生物性能，而所擁有磁性更能提高了進行分離或做為磁控載體等功能的便利性。一個Fe3O4單位晶格中的鐵，因其所填充晶格位置的不同而可分為A型和B型兩種。晶格中三分之一的鐵會填充於周圍與四個氧原子鍵結的A型位置，位在A型位置的鐵都為Fe3+。另外三分之二的鐵則填充於周圍與六個氧原子鍵結的B型位置，B型位置的鐵則一半由Fe2+，一半由Fe3+所填充 (圖1)。. 7.

(16) 圖1. 單位晶格的 Fe3O4 示意圖；紅，綠，及藍球代表 A-site 鐵，B-site 鐵及氧離子水與Fe3O4作用時可形成結晶水或在Fe3O4表面羫基化形成羫基氧化鐵 (FeOH)。1987年Rocchiccioli-Deltcheff等人認為Fe3O4的IR圖中1620 cm-1 和3440 cm-1左右的吸收峰分別為結晶水和羫基氧化鐵所引起。以TGA分析Fe3O4可發現於150℃左右有重量的損失；而非100℃左右，證實IR圖中 1620 cm-1左右的吸收峰來自結晶水而非物理吸附的水分子10。Fe3O4表面羫基化的相關探討則有甘志鋒等人於2005年測定了Fe3O4的等電點2，以此等電點為依據可預測不同pH值下Fe3O4表面電性對不同胺基酸吸附量的影響。以下面反應式為例：. NPOH2+ Æ NPOH ＋ H+. Ka1=[NPOH][H+]/[NPOH2+]. NPOH Æ NPO- ＋ H+. Ka2=[NPOH] /[NPO-][H+]. 8.

(17) NP代表Fe3O4 奈米粒子，等電點pI = 1/2(pKa1 + pKa2)，甘志鋒等人量得 Fe3O4的等電點為6.53。當溶液中pH=3時，陽離子型式胺基酸會與Fe3O4 粒子表面正電荷因電性相同而排斥；pH=10時，陰離子型式胺基酸淨電荷為負，此時Fe3O4 粒子表面為負電荷，兩者電性相同而排斥，胺基酸應不能吸附於Fe3O4 粒子表面。但實驗结果顯示仍有一定量的胺基酸吸附，說明胺基酸與Fe3O4表面並非只有靜電吸引力存在，可能還有胺基酸離子和Fe3O4 表面羫基間的氫鍵作用。研究胺基酸在Fe3O4表面的吸附行為對實際應用有重要的意義。而磁性奈米粒子的合成方法有：(1) 熱分解前趨法、(2) 金屬醇塩水解法、(3) 凝膠溶膠法(gel-sol)及(4) 水熱合成法。分別敘述如下： (1) 熱分解前趨法熱分解前趨法是在液體(有機相或水相)中直接以高溫分解前趨體以製備磁性奈米顆粒的方法。IBM 公司的 Sun 和 Zeng 等，將 Fe(acac)3 在有機相 1,2-RCH(OH)CH2OH＋RCOOH＋RNH2 中熱分解製成粒徑小於 20 nm 的 Fe3O4 磁性顆粒 11,12 (圖 2)。. 圖2. 熱分解前趨法製備磁性奈米粒子 12. 9.

(18) Hyeon 等人則將 Fe(CO)5 在油酸中加熱至 100 ℃分解出分散的 Fe 奈米粒子 13，再加入弱氧化劑(CH3)3NO 氧化 Fe 成為 γ-Fe2O3 奈米粒子，藉由調控油酸和 Fe(CO)5 比例可以有效的控制粒子的粒徑，粒子的粒徑隨著 Fe(CO)5/油酸的莫爾數比升高而減小。製備出的 γ-Fe2O3 粒徑為 4-16 nm，且此方法所製備出的 γ-Fe2O3 再現性高。 (2) 金屬醇塩水解法金屬醇塩水解法是將金屬有機醇塩溶於有機溶劑，並與混雜其中的水進行水解生成氫氧化物或氧化物奈米粒子沉澱而出，金屬醇塩水解法合成的粒子粒徑取決於水解條件。2003 年 M. Kimata 等人將 Fe(OC4H9)3 加入混合溶劑(水+辛醇+乙脛)中進行水解製備了 γ-Fe2O3 顆粒 14。 (3) 凝膠溶膠法(gel-sol) 凝膠溶膠法(gel-sol)則在 1996 年由 T. Sugimoto 等人首度發展出 15。其基本原理是以高度濃縮的鐵金屬醇塩為基質，通過對其溶解再結晶處理，生長出金屬氧化鐵顆粒。 (4) 水熱合成法水熱合成法則是將 Fe3+和 Fe2+的化合物加入鹼性溶液中加熱還原成氧化鐵。例如在水中將 FeCl2．4H2O 和 FeCl3．6H2O 混合後加入 NH4OH，並以水浴的方式加熱維持在 80℃攪拌則可得 Fe3O4 奈米顆粒. 16. 。同樣的. 以 FeSO4．7H2O 和 FeCl3．6H2O 作為 Fe2+和 Fe3+的來源，於鹼性下加熱還原也是可以合成出 Fe3O4 奈米粒子 7。. 10.

(19) 1.2.4 磁性奈米粒子的修飾與應用磁性奈米粒子因具有磁性而容易將其從複雜的環境中分離出來，加上磁性奈米粒子表面可因應各種不同的需求而加以修飾，使得磁性奈米粒子的應用潛力無窮。具特殊表面官能基化的磁性奈米粒子在生物化學及工業生產中有著重要的研究和應用價值。所以如何修飾磁性奈米粒子使其符合特殊用途已成為現今奈米粒子研究中重要的一環。表面修飾的主要方法可分為直接修飾法和間接修飾法兩種。 (1) 直接修飾法直接修飾法是指通過磁性奈米粒子直接與修飾物吸附或形成化學鍵結等方法將修飾物直接連接到奈米顆粒表面上。奈米顆粒有極大的表面能，藉由化學或物理吸附其他物質可使奈米粒子降低活性而更趨穩定。利用此現象，Sousa 等人將谷氨酸(glutamic acid)藉胺基酸表面的-COOH 和 γ-Fe2O3 表面的-OH 形成氫鍵而吸附在 γ-Fe2O3 表面上達到修飾的目的 17。2004 年 Peng 等人則針對不同 pH 值下牛血清蛋白(BSA)於 Fe3O4 表面吸附的現象做了研究 18。BSA 為兩性物，因此處於其等電點附近的 pH 值時其分子內的電荷排斥力最小，分子緊密結合因而構形變化最小。研究結果發現 BSA 分子與 Fe3O4 的斥力最小，BSA 電性接近中性，不易形成離子溶於水中，因此有利 BSA 沉澱吸附於 Fe3O4 表面。 Fe3O4於酸性溶液可形成羫基氧化鐵，並與修飾物上的羧基進行脫水反應形成鍵結。藉由此方法Kouassi等人將L-aspartic acid鍵結於Fe3O4表面上 19. (圖3)。. 11.

(20) 圖3. L-aspartic acid 修飾上 Fe3O4 表面示意圖 19. 楚建軍等人將 Fe3O4 表面以 EDTA 進行修飾官能基化，利用同樣的脫水反應概念製備出能夠螯合金屬離子和放射性離子的磁性材料 1。合成所得的 EDTA@ Fe3O4 應用於混合物中金屬離子的提取，並藉由 Fe3O4 磁性達到分離的效果。結果顯示，絕大多數的螯合效果隨著溫度的提高而有所增強(圖 4)。. 圖4. Fe3O4@EDTA在不同溫度條件下螯合金屬離子1. 共沉澱法也屬於直接修飾法的一種，此法是將修飾劑與金屬離子預先混合製成前趨體，金屬離子均勻穩定地分散在修飾劑中，再加入合成試. 12.

(21) 劑生成的奈米顆粒產物中，修飾劑也同時組裝到生成的奈米粒子上。這種方法中，磁性粒子不是預先製備的，而是在反應中直接生成的。Mornet 等人曾將 PEGFP-N1(DNA 的一種)與 Fe2+和 Fe3+混合後，通過加入氨水製備成具有 DNA 修飾表面的 Fe3O4 粒子 20。2006 年 Zhao 等人也利用共沉澱的方式將 oleic acid 自我組裝到磁性奈米粒子上形成薄膜. 21. ，並利用. XRD、TEM、EDS、ED、FTIR、TGA/DTA、DSC 和 VSM 等分析方法來比較 oleic acid 在 Fe3O4 及 CoFe2O4 上不同的組裝模式，並發現 Fe3O4 及 CoFe2O4 皆具有超順磁性特質。2007 年 Tapan K. Jain 等人利用上述方法將 oleic acid 修飾於 Fe3O4 表面，而整齊排列的 oleic acid 中的疏水端便成為非親水性抗癌藥物 Doxorubicin 的容器 5(圖 5)。. 圖5. Oleic acid@Fe3O4 成為非親水性抗癌藥物 Doxorubicin 的載體 5. (2) 間接組裝法間接組裝法是將分子組裝到先行修飾而具有-NH2、-COOH、-SH 等官. 13.

(22) 能基的奈米顆粒表面，再藉由這些官能基與欲修飾物形成化學鍵結合改變奈米顆粒表面的官能性(圖 6)，一般常用於直接修飾無法達到目的的修. 圖6. 間接組裝修飾磁性奈米顆粒示意圖 3. 飾物。以下為一些先將 Fe3O4 表面氨基化使其帶有-NH2 官能基，再與目標物結合成具特殊官能基磁性奈米粒子的應用例子。2004 年 Mikhaylova 等人藉由 Fe3O4 表面的-NH2 與經修飾溶化後得生化高分子進行脫水反應形成胜肽鍵將 BSA 組裝到 Fe3O4 顆粒上 22，實驗過程可分為三個步驟: (1) 以 APTEM 進行 Fe3O4 表面氨基化，(2) 在磷酸緩衝液中加入 EDSC 和 NHS 對 BSA 進行修飾，(3) 修飾後 BSA 與氨基化脫去尿素形成共價鍵結合(圖 7)。 2005 年 Yu-Chie Chen 等人欲將生物抗體 Vancomycin 直接修飾於 Fe3O4 載體上，但發現直接修飾的效果不彰，乃改採 Vancomycin 先以 N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride 進行結合後再與 Fe3O4 反應，脫去 N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloridec 後將 Vancomycin 修飾於 Fe3O4 表面 7 (圖 8)。修飾於 Fe3O4 載體上的 Vancomycin，藉由氫鍵作用可從尿液當中分離革蘭氏陽性菌，. 14.

(23) 最後將奈米顆粒由尿液中取出置於 MALDI 游離源以質譜進行分析，成為一生物探針的運用。. 圖7. (1)以 APTEM 進行 Fe3O4 表面氨基化，(2)在磷酸緩衝液中加入 EDSC 和 NHS 對 BSA 進行修飾，(3)修飾後 BSA 與氨基化脫去尿素形成共價鍵結合 22. 圖8. Vancomycin 以 Fe3O4 為載體示意圖 7. 15.

(24) 不同於氨基化，若改以將羧基化合物(-COOH)修飾到Fe3O4表面，則此羧基與具有-NH2官能基化合物反應形成胜肽鍵結合，或與具-OH基化合物形成縮酸酯，若是要以雙硫鍵將化合物結合上Fe3O4，則先將具-SH官能基化合物修飾到Fe3O4上，在與另一化合物中的硫基發生硫醇反應則可達到目的。取代反應則是另一種形式的間接修飾法，2006年Shao-Long Tie等人將 Fe2+和Fe3+與草酸於鹼性中合成草酸@Fe3O4的複合型磁性奈米粒子，而後在酸性溶液中以胺基酸將草酸置換出達到氨基酸與結合的目的23(圖9)。. 圖9. 胺基酸置換草酸修飾於 Fe3O4 表面示意圖 23. 2008 年 Shao-Wen Cao 等人更進一步將以微胞的方式將 Fe3O4 顆粒聚集形成中空的球體，並在表面修飾聚乙二醇，將藥物 ibuprofen 承載於中空球體中 6，相較於只侷限於 Fe3O4 顆粒表面的承載方式，此方法可以又更多的藥物承載量(圖 10)。. 16.

(25) 圖10. Fe3O4 聚集形成中空的球體作為藥物 ibuprofen 的載體示意圖 6. 1.6 論文目的由天然物中萃取生物鹼(alkaloids)，傳統上是利用物質於水層和有機層分佈係數的不同經多次萃取而得到 4，這種分離方式需耗費許多有機溶劑，製程中所需的大量有機溶液不但增加操作成本，而且使用後的有機廢液對環境更是極大的汙染源，此外多次萃取的純化過程更是耗時。離子交換樹脂的使用可改善傳統萃取方式的缺點，藉由離子競爭或是改變 pH 值的方式，原先被離子交換樹脂所吸附的目標物可以被脫附而純化 24-27. 。然而離子交換樹脂所用的沖提液用量仍大，因此純化時目標物的濃. 縮效率還可以進一步改善，此外離子交換樹脂需裝填於管柱中，固定的填充量使其在對不同樣品量的操作上較不具有彈性。本實驗的目的在於找出一種能取代傳統方法，並較離子交換法具有更好的濃縮效果，以及在樣品量操作更具有彈性的特定物質純化方法，為達此目的我們將 Fe3O4 表面以 EDTA 加以修飾，利用 EDTA 在極廣的 pH 值範圍內皆可以靜電吸引力吸附離子，再以少量特定 pH 的溶劑依序將目. 17.

(26) 標物脫附，達到具選擇性和高濃縮率的純化效果。研究中以不同胺基酸的混合液做為測試樣品，以簡化實驗時可能遭遇到的變因，所得結果將可做為未來實際運用於萃取天然物中生物鹼的參考資料。已知 Fe3O4 本身就可以對胺基酸進行吸附脫附，然而 EDTA 具有多個羧基，而在 pH 2-14 之間具有不同的負電性(圖 11)，除了可以提供較 Fe3O4. 圖11. EDTA 在不同 pH 值下的電性分佈圖 28. 或單一羧基化 Fe3O4 粒子較佳的吸附力，並可在以脫附方式純化目標物時有較佳的選擇性。研究中胺基酸的純化需藉助靜電力來吸附或脫附目標物，Fe3O4 的等電點為 6.53，因此 pH<等電點時有些陽離子型胺基酸會與 Fe3O4 粒子表面正電荷因電性相同而排斥無法吸附，同樣的 pH>等電點時 Fe3O4 粒子表面為負電荷，有些陰離子型式胺基也因與 Fe3O4 粒子表面電性相同而排斥，無法吸附。將 Fe3O4 表面以 EDTA 修飾成 EDTA@Fe3O4，應可以大幅降低 EDTA@ Fe3O4 的等電點，而使更多種類. 18.

(27) 的胺基酸可被吸附，並以調節溶液 pH 的方式，依序將不同 pI 值的胺基酸脫附純化。 EDTA@Fe3O4 純化胺基酸的量與 EDTA 於 Fe3O4 表面的修飾量有直接關係，因此尋求 EDTA@Fe3O4 的最佳生成條件為研究重點之ㄧ。探討的條件包含以不同 EDTA 和 Fe3O4 重量比進行合成，所用 EDTA/Fe3O4 比例為 10 %、20 %、30 %、40 %，此外探討不同合成方式所得 EDTA@Fe3O4 的差異性。吸附性與脫附性將以 arginine (pI 10.76)、histidine (pI 7.5)和 valine (pI 6.0) 三種胺基酸做為樣本，實驗中除了探討單一胺基酸的表現，也將三種胺基酸混合，了解在競爭下各胺基酸的吸附情形。液相層析質譜儀(LC/MS) 將被用來偵測，胺基酸於特定 pH 的吸附性以及吸附量與時間的關係，同時也將用於探討不同 pH 時，特定胺基酸於 EDTA@ Fe3O4 表面的脫附性。整體實驗流程示意圖如下(圖 12)。. 圖12. 本論文目的示意圖. 19.

(28) 第二章材料與方法 2.1 藥品與溶液配置 Fe3O4 (98 %，< 50 nm)，EDTA diammonium salt (97 %)，FeCl3．6H2O (97 %)，FeCl2．4H2O (≧ 98 %)購自 Aldrich。Arginine (98 %)，hisdine (99 %) 以及 valine (98 %)購自 Sigma。NH4OH (28 % - 30 %)，HCl (37 %) 購自 J. T. Baker。實驗中所使用的 arginine (Arg)、histidine (His)以及 valine (Val)溶液皆是先行配製成 10-2 M 儲存溶液(stock solution)，單一胺基酸吸附實驗時，取 10 μL 胺基酸儲存溶液加入 990 μL 去離子水稀釋成 10-4 M 溶液使用。胺基酸混合液吸附實驗時，各取 10 μL 的 Arg、His 和 Val 10-2 M 儲存溶液以去離子水稀釋成 10-4 M 溶液。. 2.2 儀器 IR(傅氏轉換紅外光譜儀) : PerkinElmer Spectrum RXI FT-IR。 TGA(熱重分析儀) : LABSYSTM SETARAM Thermogravimetric Analyzer。 X-Ray(X 光粉末繞射儀)：Rigaku Corporation Multiflex 2KW X-RayPowder Diffraction，XRD。 LC-MS(液相層析質儀)：Micromass Q-TOF Liquid Chromatography- Mass Spectrometer，ESI 游離源，正電模式。. 2.3 實驗流程實驗中所使用的 Fe3O4 可分為兩種，除了直接購自 Aldrich 外，也採用水熱合成法自行合成。合成方法如下：取 0.1839 g 的 FeCl2．4H2O 與. 20.

(29) 0.5011 g 的 FeCl3．6H2O 分別以 7 mL 的去離子水溶解，將兩種溶液混合於錐形瓶中，以每次 1 mL 速度慢慢滴入 10 mL 的 1 M NaOH 溶液，或是以每次 100 μL 加入 700 μL 的 19.6 M NH4OH。滴加鹼液過程中，Fe3O4 黑色顆粒便不斷產生，未加鹼液前溶液為酸性，加入鹼液後 pH 值上升至 10-11 左右，且黑色固體生成量不再增加，以磁鐵測試黑色固體可以發現其具有磁性。添加鹼液後，將溶液置入超音波震盪器中震盪 10 min，震盪後的固體放入微量離心管中以 1 mL 的去離子水清洗 3 次後，再以 MeOH 置換殘餘的去離子水後放入真空離心式濃縮儀中抽乾，乾燥後 Fe3O4 儲放至-20 ℃冰箱保存。以去離子水清洗前後的 Fe3O4 皆取少量樣品供後續 TGA 分析使用，保存的 Fe3O4 可供後續合成 EDTA@Fe3O4 使用，於 Fe3O4 表面以 EDTA 修飾官能基化可採脫水鍵結與共沉澱兩種方式進行，各敘述如下。. 2.3.1 脫水鍵結法修飾 (1)市售 Fe3O4 表面上以 EDTA 修飾各放入 0.05 g 市售的 Fe3O4 於 5 個樣品瓶，以 10 mL 的去離子水清洗以去除可能殘存的雜質，清洗過程中以試管振盪器幫助攪拌以達清潔效果，以磁鐵吸引住 Fe3O4 後將水傾倒出，另外再放入 10 mL 的去離子水重複上述清洗步驟。取 4 個樣品瓶，各放入 0.005 g，0.01 g，0.015 g，0.02 g 的 EDTA 二胺塩，以 5 mL 的去離子水溶解後分別放入各個 Fe3O4 樣品瓶中進行反應。相較於 0.05 g 的 Fe3O4，上述不同重量的 EDTA 分別在重量比例上對應 10 %，20 %，30 %和 40 %，這些樣品將用來做為不同重量比例與修飾量關係的探討。EDTA 與 Fe3O4 混合約 10 分鐘後，分別加. 21.

(30) 入 15 μL 的 37 % HCl 溶液，反應 1 個小時後取部分樣品固體做分析檢測，取出的固體樣品皆以去離子水清洗吸附在 Fe3O4 表面 EDTA，再以甲醇置換去離子水放入真空離心濃縮儀乾燥。 EDTA 與 Fe3O4 之間作用力性質研究中，EDTA@Fe3O4 樣品須以不同 pH 的清洗液洗滌，以便移除可能存在的離子間作用力。此項實驗以及後續的脫附吸附研究中，所使用的 EDTA@Fe3O4 皆是以 EDTA : 市售 Fe3O4 = 0.4 : 1 (w/w) 脫水鍵結而成。以不同 pH 的清洗液洗滌過程如下：各別將 0.05 g 的 EDTA@Fe3O4 置入 1 mL pH 3 的 HCl 水溶液、pH 5.6 的去離子水和 pH 9 的 NH4OH 水溶液中連續攪拌 20 分鐘，取上層澄清液以質譜儀分析是否有 EDTA 解離，傾倒剩餘溶液再換新的溶液重複清洗和分析步驟。以 HCl 水溶液和去離子水清洗時，各進行 5 次清洗和分析步驟， NH4OH 水溶液的清洗，因已無 EDTA 解離則只做 3 次。 (2)水熱合成法 Fe3O4 上 EDTA 的修飾取 0.1514 g 的 EDTA 以 1 mL 去離子水溶解，將此 EDTA 溶液加入水熱合成實驗中所保留的 Fe3O4 中，慢慢滴加 37 % HCl 溶液，直至溶液 pH 值為 3 左右。添加 HCl 溶液時以手不斷搖晃，結束後將溶液放入超音波震盪器中震盪 10 min，震盪後取出少量的固體放入微量離心管中以 1 mL 的去離子水清洗 3 次後，再以 MeOH 置換去離子水後放入真空離心式濃縮儀中抽乾以便後續分析使用。. 2.3.2 共沉澱法修飾取 0.1839 g 的 FeCl2．4H2O 與 0.5011 g 的 FeCl3．6H2O 分別以 7 mL. 22.

(31) 的水溶解，另取 0.1514 g 的 EDTA 以 1 mL 去離子水溶解，將三種溶液混合於錐形瓶中，以每次 1 mL 速度慢慢滴加入 10 mL 的 1 M NaOH 溶液，此時有黑色顆粒產生，將錐形瓶放入超音波震盪器中震盪 1 小時，震盪後將固體取出放入微量離心管中以 1 mL 的去離子水清洗 3 次後，再以 MeOH 置換去離子水放入真空離心式濃縮儀中抽乾。. 2.3.3 市售 Fe3O4 與 EDTA@Fe3O4 對胺基酸吸附的比較各取 0.05 g 的 Fe3O4 與 EDTA@Fe3O4 放入 500 μL 的 10-4 M 胺基酸溶液中，隨即取 5 μL 的澄清液注入質譜儀檢測，將此時間點設定為 T0。以 T0 為基準，於吸附反應進行 5 分鐘、20 分鐘、1 小時皆各取 5 μL 的澄清液以質譜儀進行分析。針對 Arg 的吸附，除了進行在水中的吸附外，也進行 pH 3 溶液中的實驗，步驟如下：取 10 mL 的 10-4 M Arg 溶液加入 1.2 M 的 HCl 溶液 50 μL，此時 pH 約為 3，取 0.05 g 的 EDTA@Fe3O4 放入 500 μL 上述溶液中，放入後隨即取 5 μL 的澄清液注入質譜儀檢測並將此時間點設定為 T0，以 T0 為基準，於吸附反應進行 5 分鐘、20 分鐘、1 小時皆各取 5 μL 的澄清液以質譜儀進行分析。. 2.3.4 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的脫附 (1) Arginine 將吸附了 Arg 的 EDTA@Fe3O4(EDTA@Fe3O4---Arg)，先以去離子水清洗兩次，每次洗液皆注入液相層析質儀檢測。以 500 μL 的 pH 9 NH4OH 溶液與 EDTA@Fe3O4---Arg 混合 20 分鐘進行脫附，第二階段利用 pH 12. 23.

(32) 左右 10 %的 NH4OH 溶液進行 10 分鐘的脫附。 (2) Hisdine 將吸附 His 的 EDTA@Fe3O4(EDTA@Fe3O4---His)，先以去離子水清洗兩次，每次洗液皆注入液相層析質儀檢測。以 500 μL 的 pH 9 NH4OH 溶液與 EDTA@Fe3O4---His 混合 20 分鐘進行脫附。 (3) Arginine + Hisdine + Valine 將吸附了 Arg 、 His 和 Val 的 EDTA@Fe3O4 (EDTA@Fe3O4---AA)以 500 μL 的去離子水連續清洗 3 次；再以 500 μL pH 9 的 NH4OH 溶液脫附 3 次，每次 10 分鐘；再以 500 μL pH 10 的 NH4OH 溶液脫附 3 次，每次 5 分鐘；最後以 500 μL pH 12 的 10 % NH4OH 溶液脫附 3 次，每次 10 分鐘。. 2.3.5 TGA 實驗條件取 0.01 g 的 EDTA@Fe3O4 樣品於氮氣下以 5 ℃ / min 加熱速度由 50 ℃ 加熱至 700 ℃。. 24.

(33) 第三章結果與討論 3.1 Fe3O4 與羧基的脫水反應為了初步了解本研究的可行性以及未來的擴展性，我們先嘗試將 Fe3O4 與 pimelic acid (PA)和 6-aminocaproic acid (6AA)進行脫水反應。EDTA 分子中具有多個羧基，雖可較為穩定欲吸附的胺基酸，卻也有可能因為分子間的排斥力太大造成與 Fe3O4 結合時修飾量過低導致後續實驗執行上的困難，因此先以只含兩個羧基排斥力較小的 PA (圖 13a)與 Fe3O4 表面進行反應。而以 EDTA 或 PA 修飾 Fe3O4 時，Fe3O4 表面為帶負電性羧基化，適用於吸附樣品中具正電性的物質。為了解未來計畫的擴展性，選擇了含羧基與氨基的 6AA(圖 13b)與 Fe3O4 表面作用將其表面氨基化而可對樣品中具負電性的物質進行吸附。. (a). (b). 圖13. (a) pimelic acid；(b) 6-aminocaproic acid 結構圖與未修飾的 Fe3O 4 IR 圖比較，PA@Fe3O4 於 1700 cm-1 左右多了一個 IR 吸收峰，位置接近 PA 中的 νC=O 的吸收波長，而在 1200-1400 cm-1 左右亦. 25.

(34) 出現原本在 Fe3O4 所沒有的吸收峰(圖 14)。此外，3400 cm-1 左右吸收強度相對於 600 cm-1 左右吸收強度也因 Fe3O4 與 PA 結合而增大。. 圖14. 以 pimelic acid 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a) pimelic acid；(b) Fe3O4； (c) pimelic acid@Fe3O4 相反的，6AA@ Fe3O4 和 Fe3O4 的 IR 圖之間並無明顯變化(圖 15) ，暗示著 6AA 並沒有如預期般的結合上 Fe3O4，代表著在我們選用的條件下尚無法達到將 Fe3O4 表面以 6AA 修飾的目的。. 26.

(35) 圖15. 以 6-aminocaproic acid 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a) 6-aminocaproic acid；(b) Fe3O4；(c) 6-aminocaproic acid@Fe3O4. 成功的在 Fe3O4 表面以 PA 加以修飾後，我們改以探討如何將 EDTA 與 Fe3O4 結合。由於 EDTA 與 Fe3O4 的結合已有文獻報導 1，但對於其間如何達到最佳的結合量卻無著墨，因此我們針對兩者反應時的一些參數進行改變，期望能達到一個較佳的修飾量，以便後續的吸附和脫附實驗中也能獲得最佳效益。. 27.

(36) 3.2 Fe3O4 與 EDTA 修飾量的探討比對不同 EDTA 與 Fe3O4 的重量比例所合成出的 EDTA@Fe3O4 IR 圖，可發現重量比為 10 %的 IR 圖在 1636 cm-1 及 1400 cm-1 出現新的吸收(圖 16c) ，這兩個吸收位置相似於 EDTA 的 νC=O(as，1686 cm-1)以及的 νC=O(s， 1420 cm-1)，並因 EDTA 與 Fe3O4 表面結合造成 C=O 振動能改變而產生紅位移。因此，IR 圖支持 Fe3O4 表面有與 EDTA 結合。曾有文獻指出將胺基酸修飾於 Fe3O4 表面，於 IR 中的觀察亦是以胺基酸中的 C=O 吸收出現於修飾後的 Fe3O4 為指標，其吸收位於 1600 cm-1 νC=O(as)左右及 1400 cm-1 νC=O(s)左右 29。隨著 EDTA 使用重量比例的增加，1300 cm-1 和 1450 cm-1 附近也開始出現一些吸收，當比例到達 40 %時，800~1000 cm-1 附近的吸收也逐漸增強，這部分的吸收峰應是對應著 EDTA 中 C-H 與 N-H 等震動能(圖 16)。換言之，合成時隨著 EDTA 所佔的重量比例增加，其能修飾於 Fe3O4 表面的修飾量也跟著增加。為了更進一步證實 C=O 吸收波長的位移情形是來自 EDTA 與 Fe3O4 之間化學作用力的影響而非簡單的物理混合，於是將 Fe3O4 與 EDTA 以重量比 100：40 的比例置於研缽之中研磨後測試其 IR 圖，再將其與脫水反應合成的樣品做比較(圖 17)。結果顯示，物理方式混合 EDTA 的 C=O 吸收峰仍維持在 1686 cm-1 位置，在 1636 cm-1 的位置卻沒有吸收峰出現，證實了在 EDTA 與 Fe3O4 反應所得的產物 IR 圖中 1636 cm-1 的吸收確實是代表著 EDTA 與 Fe3O4 的鍵結造成了 C=O 吸收峰的位移。. 28.

(37) 圖16. 以不同重量比例 EDTA 修飾 Fe3O4 表面 IR 圖，(a)EDTA；(b) Fe3O4； EDTA@ Fe3O4 (c) 10%；(d) 20%；(e) 30%；(f) 40%. 29.

(38) 圖17. (a)脫水反應合成的 EDTA@Fe3O4 (40%)；(b) Fe3O4 與 EDTA 以重量比 100：40 物理混合 IR 圖. IR 圖於 EDTA 與 Fe3O4 形成共價鍵時，羧基與 Fe 原子的結合型式則可從 νC=O(as)與 νC=O(s)的差值提供線索，依據文獻三種不同結合型態會導致不同結果的差 30。EDTA 的 IR 圖顯示 νC=O(as)與 νC=O(s)吸收分別位於 1686 cm-1 與 1420 cm-1，其差值為 266 cm-1。EDTA 與 Fe3O4 結合時，其間不同結合型態所產生的 νC=O(as)與 νC=O(s)震動吸收峰差與相對應的理論鍵結形式如下所示:. 30.

(39) (1)遠大於 266 時. M. (2)遠小於 266 時. O. O C. O. R. M. M. C O. (3)接近 266 時 O. R. C M. R. O. 檢視 Fe3O4@EDTA 的 IR 圖可發現 νC=O(as)與 νC=O(s)吸收分別位於 1636 cm-1 與 1400 cm-1，其差值為 236 cm-1 是小於 266 cm-1 的，因此較符合文獻報導中第二種形式，據此推論 EDTA 與 Fe3O4 的結合是較傾向於所謂的 bidentate。由於文獻所提供為有機金屬中羧基與一個金屬離子間的鍵結關係，而在此討論的是羧基與奈米顆粒大小的 Fe3O4 間作用力關係，因此更有可能是羧基各別與相鄰的 Fe 原子鍵結成類似 bridging 的結構(圖 18)。. 圖18. EDTA 中羧基與相鄰的 Fe 原子鍵結成 bridging 的結構值得注意的是，在 IR 圖中比例為 30 %、40 %中，比 νC=O(s) 1636 cm-1 較高的 1683 cm-1 也有一吸收峰(圖 19)，而且 40 %的吸收又強於 30 %的吸收。這項發現暗示著 EDTA@Fe3O4 中的 C=O 有兩種不同的作用力型態存在。對照 IR 圖(圖 16)可以觀察出 10 %和 20 %樣品於這個位置 1683 cm-1 的吸收幾乎不可見，代表著在 EDTA 重量比例較少時，只有一種作用力存在，當重量比例增加至 30 %和 40 %時，第二種作用力便隨之產生。. 31.

(40) 圖19. EDTA@Fe3O4 IR 圖中，於 1683 cm-1 的吸收峰. 為了進一步探討高重量比的 EDTA@Fe3O4 粒子是否存在兩種不同作用力影響 C=O 的振動能，我們將以重量比 40 % EDTA 合成的 EDTA@Fe3O4 進行 TGA 測試。首先由 Fe3O4(圖 20)和 EDTA(圖 21)的 TGA 圖發現，Fe3O4 圖中一開始的重量損失為些許於 Fe3O4 表面的雜質，180 ℃左右為結晶水的重量損失，由此可觀察出結晶水的含量約為 1.5 %。550 ℃左右則有另一個重量損失的情形。根據文獻，Fe3O4 在超過 570 ℃的高溫下會轉後成一種熱穩定物 FeO19，此重量損失便是此轉換情形所造成的。至於 EDTA 很明顯的在 200 ℃左右有一強大的重量損失(圖 21)，這與理論 EDTA 的熱裂解溫度 220 ℃結果大致相符。. 32.

(41) 圖20. Fe3O4 的 TGA 圖. 圖21. EDTA 的 TGA 圖. 進一步由 EDTA@Fe3O4 的 TGA 圖發現(圖 22)，在 200 ℃、330 ℃以及 580 ℃皆有重量損失。於 TGA 圖中 580 ℃的重量損失現象應如同前述代. 33.

(42) 表著 Fe3O4 轉換為 FeO 的過程， 200 ℃和 330 ℃的重量損失則應來自於 EDTA，而兩個不同溫度的重量損失代表著 EDTA 與 Fe3O4 之間的鍵結型式可能有兩種，作用力不同導致 EDTA 在不同的溫度下熱烈解。TGA 實驗結果支持前述 IR 圖中所發現的 1636 cm-1 和 1683 cm-1 的吸收峰代表著 Fe3O4 和 EDTA 之間存在兩種不同作用力。其中 330 ℃的損失應是代表著因脫水而鍵結於 Fe3O4 表面的 EDTA，由於鍵結的產生導致能量上升，使得裂解溫度由原本的 200 ℃上升至 330 ℃，結果顯示其含量約為 5 %。而於 200 ℃中 8 %的重量損失，扣除 Fe3O4 的 TGA 實驗中結晶水含量 1.5 %後，剩餘的 6.5 %則來自另一種作用力的 EDTA。由於其裂解溫度和自由 EDTA 的裂解溫度接近，在加上 IR 圖中 1683 cm-1 的吸收位置亦接近於自由 EDTA 的 1686 cm-1，故我們判斷另一種作用力的 EDTA 處於一種接近自由 EDTA 的狀態。. 圖22. EDTA @Fe3O4 的 TGA 圖. 34.

(43) 另一種作用力的存在可能導因於 EDTA 與 Fe3O4 反應時的 pH 值條件。於本實驗當中是在 pH 1 的條件下對 Fe3O4 表面進行 EDTA 的修飾，由圖 12 得知 EDTA 在 pH 值為 1 的情形下，理論上其帶電的形式有下列四種： H6Y2+、H5Y+、H4Y 和 H3Y-，Fe3O4 表面的-OH2 與帶負電的 EDTA 進行＋. －. 脫水形成共價鍵後，鍵結於 Fe3O4 表面的 EDTA 中的-COO 以靜電吸引的方式吸附存在於反應溶液中正電型式的 EDTA(圖 23)，也就是說 EDTA 在 Fe3O4 表面形成雙層的結構，內層為以脫水方式鍵結的 EDTA，外層則為因靜電吸引力而被內層 EDTA 所吸附的 EDTA，而此 EDTA 便較接近自由 EDTA 的狀態。兩種以不同作用力存在於 Fe3O4 表面的 EDTA 因其振動能的改變量不同，故在 IR 吸收中造成不同的位移量，且於 TGA 中也有不同的熱損失溫度。. 圖23. EDTA 於 Fe3O4 表面的雙層結構示意圖. 為了證實上述說法，我們將 EDTA 修飾的 pH 值改為 3，由圖 11 得知 H2Y2-三種，在這樣的條件下 EDTA EDTA 在此時的帶電型態為 H4Y、H3Y、. 除了在 Fe3O4 表面脫水形成共價鍵外，因沒有帶正電的形式，故不會形成上述外層的結構。比較於兩種不同 pH 值條件下合成的 EDTA@Fe3O4 的 IR 圖(圖 24)可發現，原出現於 pH 1 合成條件下樣品的 IR 圖中位於 1683 cm-1 和 800-1500. 35.

(44) cm-1 附近的吸收峰並沒有出現於 pH 3 合成條件下的樣品，此結果顯示 EDTA 於 pH 3 時與 Fe3O4 作用可能只有因脫水形成共價鍵結，而在 IR 圖中顯現位於 1636 cm-1 以及 1400 cm-1 兩個吸收峰。至於 pH 1 時，EDTA 與 Fe3O4 作用時的產物較為複雜，不但有共價鍵作用力，也可能多了離子間作用力而在 Fe3O4 表面形成雙層結構導致 IR 圖中出現 1636cm-1 和 1684 cm-1 兩個 νC=O(as)吸收峰。. 圖24. 不同 pH 值下合成 EDTA@Fe3O4，(a) pH 3；(b) pH 1. 3.2.1 EDTA@Fe3O4 表面特性的研究前述 IR 和 TGA 資料顯現可能有兩種不同作用力存在於 EDTA 和 Fe3O4. 36.

(45) 之間(雙層結構)，而 EDTA 與 Fe3O4 反應時 pH 值高低會影響到雙層結構的出現與否。為了進一步證實此現象，我們計畫將對於雙層結構外層以離子間作用力而吸附於 Fe3O4 上的 EDTA 以調控溶液 pH 值的方式，改變 EDTA 的電性使其因排斥力而從 EDTA@Fe3O4 釋放出。將於 pH 1 條件下所合成出具有雙層結構的 EDTA@Fe3O4 分別以 pH 3、pH 5.6 (置於空氣下純水的 pH 值)和 pH 9 三種不同 pH 值溶液中清洗，除了以 IR 分析經清洗後的 EDTA@Fe3O4 固體外，並將以 LC-MS 分析清洗液觀察是否有 EDTA 存在於清洗液中，若 EDTA 只存在於鹼性洗液中而不存在於酸性洗液中，則可證實離子間作用力的存在。由 IR 圖(圖 25、 26)可以發現，不論經酸或水洗的 EDTA@Fe3O4 顆粒其位於 1683 cm-1 的吸收強度隨著清洗的次數越多而越來越低。此外，像是 1300 cm-1、1450 cm-1 的吸收峰也皆有降低，這些強度的變化顯示這些吸收峰可能來自於外層結構的 EDTA。pH 3 和 pH 5.6 相較於合成時的條件 pH 1 而言，帶正電型式的 EDTA 比例減少，因而減少了外層 EDTA 的存在量。經脫附外層 EDTA 後，1636 cm-1 νC=O(as)以及 1400 cm-1 νC=O(s)的吸收強度不因酸液或水的清洗而變化，則是代表著內層共價鍵型式的 EDTA 振動能，此結果與在 pH 3 的條件下合成 EDTA@Fe3O4 一致。經由 1300 cm-1、1450 cm-1 的吸收峰也觀察到，同樣清洗至第五次，酸洗仍保留部分吸收，而水洗則幾乎不可見(圖 25c、26c)。換句話說，酸洗仍保留部分外層結構。由於 pH 3 仍有部份帶正電型式的 EDTA，故外層的 EDTA 依舊存在；當 pH 值在 5.6 的情況下，EDTA 全部屬於負電型式，外層因帶正電而被吸附的情形便不可見。. 37.

(46) 圖25. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 3 溶液清洗，(a) EDTA@Fe3O4 (40 %)；(b) 第三次清洗；(c) 第五次清洗 IR 圖. 圖26. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 5.6 溶液清洗，(a) EDTA@ Fe3O4 (40 %)；(b) 第三次清洗；(c) 第五次清洗 IR 圖. 經由整體的 IR 圖中(圖 27)，EDTA @Fe3O4 與酸洗和水洗後的 IR 吸收作比較，確實經清洗後屬於內層共價鍵形式 EDTA 的吸收只有在 1636. 38.

(47) cm-1 以及 1400 cm-1，皆是來自於單純的 EDTA 最強的 C=O 吸收。較為不同的是鹼洗，從 IR 圖(圖 27e)來看，經鹼洗後的 EDTA @Fe3O4 回復成像未修飾前 Fe3O4 的 IR 圖(圖 27a)，除了 C=O 在 1400 cm-1 的 νC=O(s)吸收不見外，C=O 的 νC=O(as)相對於 600 cm-1 左右吸收強度也已經降低到像單純 Fe3O4 中結晶水那樣微弱。換句話說，剩下的只有單純 Fe3O4 表面在 1636cm-1 結晶水的吸收。由此可判定，在鹼洗為 pH 9 的情況之下，除了洗去外層的 EDTA 外，原本經由在酸性下脫水而鍵結上去的共價鍵形式的 EDTA 也在鹼液清洗的過程當中被水解掉。由 TGA 圖更可發現，原本在 330℃屬於共價鍵形式 EDTA 的斷鍵脫附所產生的重量損失情形消失了。也就是經鹼處理過後，共價鍵形式的 EDTA 也跟著被水解下來了(圖 28)。清洗液的質譜圖結果則直接或間接的進一步證實有 EDTA 從 EDTA@ Fe3O4 洗出，由 pH 5.6 與 pH 9 洗液中可發現質子化 EDTA 的離子訊號(m/z = 293)(圖 29、30)，但於 pH 3 洗液中我們卻只看到少數的 m/z = 293 的訊號，而主要的離子訊號為 m/z = 346(圖 31)，於 pH 5.6 洗液中也個發現這離子的存在。進一步檢視 EDTA 化合物本身的質譜圖卻沒發現 m/z = 346 的存在，因此這離子應非來於 EDTA 本身。結果顯示，有物質從 EDTA@Fe3O4 表面被酸液沖洗而出，但成份未定。因此，酸性洗液的質譜結果無法充分證明外層結構的 EDTA 存在。. 39.

(48) 圖27. (a) Fe3O4；(b) EDTA@Fe3O4 (40%)；EDTA@Fe3O4 ；(c) 經五次酸洗後；(d) 經五次水洗後；(e) 經五次鹼洗後 IR 圖. 40.

(49) 圖28. EDTA@Fe3O4 經三次鹼洗後的 TGA 圖. 41.

(50) 圖29. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 5.6 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd (c) 3rd；(d) 4th；(e) 5th. 42.

(51) 圖30. 將 EDTA@ Fe3O4 用 pH 9 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd； (c) 3rd. 43.

(52) 圖31. 將 EDTA@Fe3O4 用 pH 3 洗液清洗的各次質譜圖，(a) 1st；(b) 2nd； (c) 3rd；(d) 4th；(e) 5th. 44.

(53) 3.2.2 不同的 EDTA 修飾條件我們探討 EDTA 在市售的 Fe3O4 表面形成雙層結構，並將其經過酸洗、水洗和鹼洗來探討此兩層不同作用力形式的 EDTA 在 Fe3O4 表面的變化。接下來我們改變不同的實驗條件，其中包含再提高 EDTA 的比例達 100%以及改用水熱合成法所形成的 Fe3O4 顆粒進行修飾和利用共沉澱的修飾方法比較有何不同。 (1)改變 EDTA 的比例針對合成時不同的 EDTA@Fe3O4 比例在 IR 圖上有不同的變化，實驗初期為了盡快了解後續吸附與脫附操作的可能性，因此於得到的 40 %樣品後就沒針對更高的比例作探討。然而，經由我們對於 EDTA 與 Fe3O4 合成時所形成的雙層結構型式型式做了進一步的了解後，乃將重量比進一步提升至 100 %及 5 倍(500 %)，並經合成條件控制於 pH 3 的情況下，使其只產生內層脫水鍵結型式的 EDTA，觀察其 IR 的變化。結果顯示 IR 圖中有極明顯的變化(圖 32)。除了原本在 1630 cm-1 和 1400 cm-1 附近的吸收不變，EDTA 比例為 100 %時 3100 cm-1 開始產生一新的吸收峰。當 EDTA 比例增加至 Fe3O4 的五倍時，890 cm-1 和 795 cm-1 附近一開始出現新的吸收峰。2005 年楚建軍等人曾同樣利用脫水鍵結的方式將 EDTA 修飾上 Fe3O4 表面 1，實驗中 EDTA 的重量比例為 Fe3O4 的 50 倍，於文獻中他們所提出的 IR 圖中(圖 33)，3400 cm-1 和 3160 cm-1 為 Fe3O4 表面 OH 的吸收變化，部分-OH 脫水接上 EDTA 導致吸收往低波數移動； 1630 cm-1 和 1400 cm-1 則分別為 EDTA 中 C=O 的 νC=O(as)和 νC=O(s)的吸收；890 cm-1 和 795 cm-1 為 EDTA 中 C-O、CH2-CH2、C-N 的吸收。比較. 45.

(54) 楚建軍等人的結果和圖 32 可發現於我們的實驗中當 EDTA 比例提升至高於 Fe3O4 時，3160 cm-1 吸收峰更為明顯，而 800-1000 cm-1 附近則出現了兩種極為明顯的吸收峰，這與文獻的結果一致。綜合在不同 EDTA 重量比例下合成 EDTA@Fe3O4 的 IR 圖資料顯示，當 EDTA 的比例偏低時，EDTA 在 Fe3O4 表面所表現的吸收峰僅出現於 1400 cm-1 和 1636 cm-1，但隨著 EDTA 的比例增加到 100 %時，隨之而來的是在 3160 cm-1 的特徵吸收。若 EDTA 重量比例進一步提升到 5 倍時，更會在 890 cm-1 和 795 cm-1 出現代表 C-O、CH2-CH2、C-N 的振動形態吸收峰。由於資源及時間的關係，我們並沒對高重量比例 EDTA/Fe3O4 (> 100 %)的 EDTA@Fe3O4 作進一步分析，未來若能對這些粒子做進一步分析並測試其吸附脫附能力，將是一有趣的課題。. 圖32. (a) EDTA@Fe3O4 (40%)；(b) EDTA@Fe3O4 (100%) IR 圖. 46.

(55) 圖33. 文獻中所提出 EDTA 脫水修飾於 Fe3O4 表面 IR 圖 1 (原圖無 x 軸標). (2)不同 Fe3O4 來源的影響已知市售的 Fe3O4 粒徑< 50 nm，我們希望藉著自我合成較小顆粒來達到較佳的吸附量效果。以水熱合成 Fe3O4 時，我們同時探討了以不同鹼液合成的差異性，所用的鹼液為 NaOH 或 NH4OH。將市售的 Fe3O4 經 X-Ray 偵測後發現(圖 34a)，其主要的吸收峰有五個，其中最強的吸收峰存在於 33°，這是來自於 Fe3O4 晶格中(3.1.1)的晶格面，利用此吸收峰我們計算市售的 Fe3O4 粒徑約為 30 nm。相較於水熱合成法所得的 Fe3O4 的 X-Ray 圖 (圖 34b、c)，我們發現自我我合成的 Fe3O4 具有磁性並可觀察到在(3.1.1) 晶格面的吸收，但在 X-Ray 的吸收峰較不明顯，這現象可能導因於結晶性不佳或是粒徑較市售顆粒來的小。若以 IR 圖比對市售的 Fe3O4 與水熱合成法所得的黑色固體(圖 35)，可發現兩者具有相同的特徵吸收峰，分別為 3400 cm-1 左右的 Fe3O4 表面-OH 吸收， 1630 cm-1 左右的結晶水吸收以及在 590 cm-1 左右的吸收為 Fe-O 的吸收，其中又分為 Fe3O4 顆粒表面的 Fe-O 和顆粒內部的 Fe-O。. 47.

(56) 圖34. (a) 市售 Fe3O4；(b) NaOH; (c) NH4OH 水溶液中以水熱合成 Fe3O4 之 X-Ray 圖經由 X-Ray 以及 IR 的偵測，我們判斷利用 Fe2+和 Fe3+在鹼性條件(約 pH 11)下所合成出的確實是 Fe3O4 顆粒。確認為 Fe3O4 後，便直接添加 EDTA 於溶液中進行反應，也就是說並未將 Fe3O4 從其合成母液分離出來，而是直接添加 EDTA(此為重量比 EDTA/ Fe3O4=50 %)並將溶液 pH 由鹼調至 pH 3 進行反應合成 EDTA@Fe3O4。由 IR 結果發現(圖 36)，修飾效果與市售 Fe3O4 加入重量比 40 %的 EDTA 似乎沒有太大的差別，經修飾上的 EDTA 其吸收同樣出現於 1636 cm-1 和 1400 cm-1 附近。. 48.

(57) 圖35. (a)市售 Fe3O4；(b) NaOH; (c) NH4OH 水溶液中以水熱合成 Fe3O4 之 IR 圖. 49.

(58) 圖36. (a) NaOH 水溶液中以水熱合成之 Fe3O4；(b) (a)中產物添加 EDTA 後之 EDTA@Fe3O4；(c) NH4OH 水溶液中以水熱合成之 Fe3O4；(d) (c)中產物添加 EDTA 後之 EDTA@Fe3O4 所得 IR 圖. 50.

(59) (3)共沉澱法與脫水鍵結法不同的是將 Fe3O4 形成的同時修飾上 EDTA 的共沉澱法，目的在於與脫水鍵結的方法做比較。不同於脫水鍵結是先獲得 Fe3O4 顆粒再在酸性下進行脫水反應修飾上 EDTA，共沉澱是將 Fe2+和 Fe3+以及 EDTA 同時處在鹼性環境下， Fe2+ 和 Fe3+會均勻的分佈在 EDTA 周圍，當鹼形條件使 Fe2+和 Fe3+開始形成 Fe3O4 顆粒時，EDTA 也會同時組裝到 Fe3O4 顆粒上。在共沉澱的修飾條件當中 EDTA 的比例為 50 %，在 IR 圖中(圖 37a)除了在 1630 cm-1 和 1400 cm-1 C=O 的吸收外，於 890 cm-1 和 795 cm-1 和 1500 cm-1 也出現與脫水鍵結法合成的 EDTA@Fe3O4 非常不同的吸收。為了解此新的生成峰是否與 Na+有關，共沉澱法所得的 EDTA@Fe3O4 粒子乃加以酸液洗濯。結果顯示(圖 37b)，1500 cm-1 的吸收峰消失了，伴隨著 3000 cm-1、890 cm-1 和 795 cm-1 吸收更為明顯增強。若以文獻當中 EDTA@Fe3O4 對照(圖 33)，可以發現由共沉澱法修飾經洗去鈉離子後的 IR 圖完全相符。若單純以 IR 作依據，結果顯示共沉澱的方法只須以 50 % EDTA 重量比例，便可達到在脫水鍵結方法中以 50 倍 EDTA 的效果。至於共沉澱法所得的 EDTA@Fe3O4 吸附脫附效果如何則有待探討。. 51.

(60) 圖37. (a) 共沉澱法合成之 EDTA@Fe3O4；(b) 以 HCl 洗滌 EDTA@Fe3O4 之 IR 圖. 3.3 Fe3O4 的吸附行為為了瞭解 EDTA@Fe3O4 是否對胺基酸有較好的萃取能力，首先以 Fe3O4 －. 做一對照實驗。已知文獻 pH > 6.53 時，Fe3O4 表面是以 Fe-O 存在；相反的，pH < 6.53 為 Fe-OH2+存在 2。針對這兩種不同形式的 Fe3O4 粒子靜電吸引力能力的測試，我們選擇了 aspartic acid (pI 2.77)和 arginine (pI 10.76) 進行探討(圖 38)。. 52.

(61) (a). (b). 圖38. (a) aspartic acid；(b) arginine 結構圖. 將 Fe3O4 置入 10-4 M 的 Asp 溶液(pH 5.6)後，以質譜儀偵測[M+H]+離子訊號，可發現開始時(T0)，Asp 的離子訊號(m/z = 134)約在 5000 counts 左右，隨著吸附時間的增加[M+H]+離子訊號跟著減少，到 20 分鐘後訊號降至原來的 10 %左右(圖 39)，因此 Fe3O4 本身對酸式胺基酸 Asp 已具有非常好的吸附效果。由於 Fe3O4 顯示對 Asp 有極佳的吸附力，接著我們檢測 Fe3O4 對鹼性胺基酸 Arg 的吸附效果。首先同樣在 pH 5.6 下，也就是單純將 Arg 溶在水中後再置入 Fe3O4。由質譜圖(圖 40)可看出在此 pH 5.6 下 Fe3O4 對 Arg 並沒有甚麼吸附能力，進行了 20 分鐘的吸附，[M+H]+離子訊號(m/z = 175) 並沒有下降的跡象，這是由於 pH 5.6 時 Fe3O4 表面為 Fe-OH2+存在進而與質子化的 Arg 排斥現象而無法結合。. 53.

(62) 圖39. Fe3O4 吸附 aspartic acid 過程中溶液之質譜圖，(a) T0；(b) 吸附 5 min；(c) 吸附 20 min. 54.

(63) 圖40. Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a) T0；(b) 吸附 5min;(c) 吸附 20 min. －. 進一步將溶液 pH 調至 9，理論上此時 Fe3O4 表面應是 Fe-O ，而 Arg 應仍維持相當的正電性，但結果顯示並無明顯吸附現象發生(圖 41)。因此，雖然 Fe3O4 可吸附酸性胺基酸，但對鹼性胺基酸效果不佳，是以 EDTA@Fe3O4 有其應用的潛在價值。. 55.

(64) 圖41. pH 9 溶液中 Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖， (a) T0；(b) 吸附 5 min；(c) 吸附 20 min. 3.4 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的吸附行為以 EDTA@Fe3O4 進行各別對 10-4 M 的 arginine(pI 10.76)、histidine(pI 7.5) 和 valine(pI 6.0) (結構如圖 42 所示)溶液進行吸附測試。此時三種胺基酸溶液 pH 皆為 5.6，因此皆具有正電性。將 10-4 M 的 Arg 溶液置入. 56.

(65) (a). (b). (c). 圖42. (a) arginine；(b) histidine；(c) valine 結構圖. EDTA@Fe3O4 吸附，5 分鐘後可發現溶液中[M+H]+離子訊號 (m/z = 175) 降至原來的 30 %左右，1 小時後則為 15 % (圖 43) ，因此有別於 Fe3O4 只能對酸性胺基酸產生作用力，EDTA@Fe3O4 對於酸性胺基酸和鹼性胺基酸皆可作用，其實用性較 Fe3O4 來的廣泛。. 57.

(66) 圖43. EDTA@Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg 液；(b) T0；(c) 吸附 5min；(d) 吸附 20 min；(e) 吸附 1 hour His 的吸附實驗中，吸附液中 His 的[M+H]+離子訊號(m/z = 156)和 [2M+H]+離子訊號(m/z = 311)隨著吸附時間的增長跟著減少(圖 44)。吸附. 58.

(67) 20 分鐘後，[2M+H]+的離子訊號已經不見，[M+H]+強度則減少了約 50 %。與 Arg 的吸附性相比，EDTA@Fe3O4 對 His 的吸附效果似乎沒有 Arg. 圖44. EDTA@Fe3O4 吸附 histidine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M His 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min. 59.

(68) 來的好，原因可能有兩種： (1) His 的結構中的 imidazole 環造成 EDTA@Fe3O4 對 His 吸附上的立體障礙；(2) pH 5.6 與 His 的 pI 值 7.5 相近，造成 His 無法像 Arg 有較強的正電性，而與 EDTA@Fe3O4 的鍵結力變的較為薄弱容易脫離不利吸附。 Val 的 pI 值為 6.0，於 pH 5.6 下應有正電性，但由於太接近 pI 值，正電性可能微弱不利 EDTA@Fe3O4 吸附。因此針對 Val 吸附性的探討便將溶液的 pH 值調至 3，希望 Val 具較強的正電性而有較佳的靜電作用力。然而，Val 吸附溶液中[M+H]+離子訊號(m/z = 118)並沒有因吸附時間的增加而下降，其訊號皆維持在 300 counts 左右(圖 45)，顯示正電性的 Val 並沒受到帶負電的 EDTA@Fe3O4 所吸引，原因可能導因於 EDTA@Fe3O4 上的 EDTA 羧基於 pH 3 下已不具負電性甚至質子化。雖 EDTA 本身在 pH 2-14 皆有負電性，於 pH 3 時 EDTA@Fe3O4 中的 EDTA 已與 Fe3O4 結合，因此其具負電性的範圍應已改變而與胺基酸造成排斥的現象。為了進一步探討 Val 吸附性不佳是否導因於 Fe3O4@EDTA 於 pH 3 時負電性不足，我們將觀察 Arg 於 pH 3 水溶液中的吸附現象。pH 3 下對 Arg 吸附性大為降低。於 pH 5.6 時，吸附 5 分鐘後 Arg 的[M+H]+離子訊號下降約 70 % (圖 43) ，但於 pH 3 時則只降低了 35 % (圖 46) 。雖然 pH 3 時吸附效果如預期般的不如 pH 5.6，但由[M+H]+ 訊號降低顯示， EDTA@Fe3O4 於 pH 3 仍保有對質子化胺基酸的吸附能力，雖然其能降低了一半左右。此外，我們在執行其他實驗時也注意到 pH 9 時，EDTA 會從 EDTA@Fe3O4 上水解下來，因此 EDTA@Fe3O4 若要發揮既定的效果，吸附溶液 pH 值要控制在 pH 9 以下。至於 pH 3 時雖然不能吸附 Val，但. 60.

(69) 也可以將此結果做為一種於多樣混合胺基酸中萃取特定胺基酸的方法。. 圖45. EDTA@Fe3O4 吸附 valine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min；(e) 吸附 1 hour. 61.

(70) 圖46. pH 3 溶液中 EDTA@Fe3O4 吸附 arginine 過程中溶液之質譜圖，(a)10-4 M Arg 溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min. 在完成了個別胺基酸吸附力的研究後，我們進一步將 Arg、His 和 Val 三種胺基酸混合進行較複雜樣品下吸附性的觀察。將三種胺基酸混合液 (pH 5.6)置入 EDTA@Fe3O4 5 分鐘後發現 Arg 的[M+H]+離子訊號將低約. 62.

(71) 90 %、His 下降約 80 %，Val 則反而增強 (圖 47)。結果顯示在 Arg 與 His 共存下並不會因 Arg 具有較高的 pI 值而抑制 His 的吸附，於混合液吸附過程中可發現[Arg+H]+和[His+H]+訊號同時降低。. 圖47. EDTA@Fe3O4 吸附 arginine，histidine 和 valine 過程中溶液之質譜圖，(a) 10-4 M Arg/His/Val 混合溶液；(b) T0；(c) 吸附 5 min；(d) 吸附 20 min. 63.

(72) 3.5 EDTA@Fe3O4 對胺基酸的脫附行為研究最後探討了將吸附於 EDTA@Fe3O4 上不同的胺基酸以調控溶液 pH 值方式依序釋放出達到純化的可行性，首先先單獨探討各別吸附 Arg 和 His 的 EDTA@Fe3O4 脫附現象。Arg 的脫附主要分為三個階段，第一階段以水清洗可能吸附於 EDTA@Fe3O4 上的 Arg；第二階段將 pH 調控至 9 進行 Arg 的脫附，預期此時的 Arg 應仍具正電性，而不會從 EDTA@Fe3O4 脫附出；第三階段則將 pH 調控至 12，此時因 pH 值高於 Arg 的 pI 值， Arg 轉而帶負電性而與 EDTA@Fe3O4 的負電性相斥而脫附出。圖 48 為吸附了 Arg 的 EDTA@Fe3O4 脫附液的質譜圖，總共進行了兩次脫附，明顯的可看到 Arg 的[M+H]+離子訊號的出現，代表著 EDTA@Fe3O4 樣品中有些較弱的 Arg 鍵結會因溶於水而洗出，這些 Arg 是以何種方式附著於上，目前則不得而知。. 圖48. EDTA@Fe3O4 ---Arg 水洗液質譜圖，(a) 第一次水洗液；(b)第二次水洗液. 64.

(73) 改以 pH 9 的 NH4OH 溶液洗滌吸附 Arg 的 EDTA@Fe3O4 固體，結果與水洗滌相似有少量的[M+H]+離子訊號出現在質譜圖中(圖 49)。. 圖49. EDTA@Fe3O4 ---Arg 於 pH 9 脫附時溶液質譜圖，(a) 第一次脫附液；(b) 第二次脫附液. 進一步將 pH 值調至 12 高於 Arg 的 pI 值時，脫附液的質譜圖顯示了強烈的[M+H]+訊號，其離子訊號強度是 pH 9 時的 12 倍之多(圖 50)。這項結果顯示於水中或 pH 9 脫附液中，由於平衡的關係而有部分的 Arg 解離出。但於 pH 大於 12 時，因 Arg 上的-NH3+基轉為-NH2，使得 Arg 大量脫附而出。. 65.

(74) 圖50. EDTA@Fe3O4---Arg 於 pH 12 脫附時之質譜圖. 圖51. EDTA@ Fe3O4 ---His 水洗液質譜圖，(a) 第一次水洗液；(b)第二次水洗液. 66.

(75) 有關 His 的脫附，則分為兩個階段。第一階段同樣為用水清洗吸附了 His 的 EDTA@Fe3O4；第二階段為將 pH 值調控至 9 進行脫附。以吸附時溶液中[M+H]+訊號降低作為參考，以水洗脫附已可使相當量的 His 被脫附出，約為原吸附量的 60 % (圖 51)。也因此 pH 9 脫附液的質譜圖中， His 的[M+H]+訊號並沒有太大變化 (圖 52)，因殘留於 EDTA@Fe3O4 的量已不多。. 圖52. EDTA@Fe3O4---His 於 pH 9 脫附時之質譜圖. Arg 和 His 於 EDTA@Fe3O4 的脫附實驗支持了可以調控 pH 與 pI 值的關係來進行脫附。因此，原本預定探討吸附了 Arg、His 和 Val 三種胺基酸 EDTA@Fe3O4 的脫附行為。然而由於 Val 本身不易吸附於 EDTA@Fe3O4，所以以下 EDTA@Fe3O4 粒子於吸附過程中，雖然處於含 Arg、His 和 Val 的環境下，但應視為只有少量的 Val 吸附於上。脫附的過程主要分為四個階段，第一階段為用水清洗吸附了 Arg、His 和 Val 的 EDTA@Fe3O4 固體，目的在於洗去只是單純附著於 EDTA@Fe3O4 上的. 67.