一、实验目的
1．学习放线菌的纯化和鉴定方法。
2．掌握放线菌的形态鉴定技术。
二、实验原理
从混杂微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法为分离。纯种（纯培养）是 指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生 的后代。由于它们很微小，因此人们的肉眼无法观察到它们的存在。将分离得到 的各种菌进行纯培养，而后鉴定。
放线菌是介于细菌和真菌之间的一大类原核微生物，在自然界中分布广泛，
种类繁多，经济价值较大，许多菌株已为人类做出重大的贡献和带来了巨大的的 经济效益。鉴定放线菌时形态特征和生理特征兼用，同时配合化学鉴定方法和分 子鉴定方法，才能准确鉴定到种或属。
三、材料和方法 1．菌种
实验第一部分 筛选得到的未知放线菌菌株；如天蓝色链霉菌（Streptomyces parvullus ）， 细 黄 链 霉 菌 （ S ． miroflavua ）， 珊 瑚 色 诺 卡 氏 菌 （ Nocardia corallina），青铜小单胞菌（Micrornonosporachalcea）。
2．培养基
高氏一号培养基(可溶性淀粉 20. 00 g，KN03 1.00 g，NaCI 0.50g，K2 HP04
0.50g，MgS04 0. 50 g, FeS04 0.01 g．琼脂 20g，水 1 000 mL, pH 7.2～7.4) 3．方法
(1)纯化方法：采用三区划线法，用接种针黏取放线菌的孢子在高氏一号平 板上划线，在 28 ℃恒温箱中培养 5—7 d，挑取单菌落，再划线，再挑取单菌落，
重复 3~5 次的挑取单菌落后，接种高氏一号斜面，该菌株被视为纯化菌株。
(2)培养特征鉴定方法：配制用于放线菌鉴定的培养基（培养基配方见参考 资料。），把纯化好的放线菌接种各种培养基上，置 28℃培养，分别在 7 d.14 d 和 28 d 观察其培养特征和颜色变化。取稳定成熟的颜色特征为其培养特征，作 为定种的依据。观察记录：
①气生菌丝体颜色（即孢子丝未形成前的颜色）；
②孢子丝和孢子的颜色（即孢子丝成熟形成孢子堆的颜色）
③基质菌丝体的颜色（即菌落或菌苔背面的颜色）；
④可溶性色素的颜色（指渗入到培养基内色素的颜色）o (3)形态鉴定方法
①插片法：用灭菌的镊子将无菌盖玻片以 45 0 倾斜角插入高氏一号培养基 琼脂平板内，插入深约为 1/2 或 1/3，然后将放线菌接种到盖玻片与平皿培养基 的界面上，倒置于 28 CC 恒温培养箱培养 3~7 d 后，小心取出盖玻片（此时该玻 片上已有放线菌），有菌面朝上，放在载玻片上，置显微镜下观察。
②压印法：在凝固的高氏一号培养基平板上用划线分离法得到单一的放线 菌菌落。用灭菌的小刀（或刀片）挑取有单一菌落的培养基一小块，放在洁净的
载玻片上。用镊子取一洁净盖玻片，在火馅上稍微加热（注意：勿将盖玻片烤 碎），然后把玻片盖放在带菌落的培养基小块上，再用小镊子轻轻压几下，使菌 落的部分菌丝体印压在盖玻片上。将印压好的盖玻片放在洁净的载玻片上（菌体 朝向载玻片），然后放置在显微镜下观察。
③埋片法：在已凝固的琼脂平板上用灭菌小刀切开两条小槽，宽度小于 1.5 cm。把放线菌接种在小槽边上，盖上已灭菌的盖玻片 1~2 片，盖好培养皿盖。
将制作好的平板放在 28 C|C 恒温箱培养 3~4 d。取出培养皿，可以打开皿盖，将 培养皿直接置于显微镜下观察；也可以取下盖玻片，将其放在洁净载波片上，放 在显微镜下观察。
四、预期结果
1．记录各个放线菌菌株的培养性状和形态鉴定结果。
2．查阅放线菌的鉴定检索表，初步判断鉴定菌株的类型。
思考题
1．在培养基上如何区分放线菌和真菌、放线菌和细菌的菌落形态？
2．什么类型的放线菌的菌落与细菌相似，如何分辨这些相似的类型？
参考文献
[l]阎逊初编著．放线菌的分类与鉴定[M]．北京：科学出版社，1992．
[2]周德庆主编．微生物学实验教程．2 版[M]．北京：高等教育出版社，
2006．
五、注意事项
1．生长抑制物的浓度不能太高，处理时间不能过长，否则稀有放线菌也容 易死亡。
2．许多放线菌在干热下 100℃处理 30 min 不会死亡，但在湿热下只能用
50~55 ℃处理 30 min。样品如果用湿热处理，温度不能太高，时间不能太长。
六、思考题
1．阐述每一类稀有放线菌筛选时的富集培养的设计思路。并查找资料佐证。
2．除涂布法外，你还知道哪些分离方法？比较各种分离方法的优缺点。
七、考核评价
评分标准(满分 100 分)
序号 考核内容
正确熟练 正确不熟 练
在指导下
完成 不能完成
得分
1 培养基配制 40 35 25 10
2 土样的采集 40 35 25 10
3 作业与实训报告完成情况 20（优） 15（良） 12（合格） 6（不合 格）