第四章 結果
II. 細胞內 HBP1 表現降低時會增強 EGFR 與其下游 Akt 之活性
我們在 HBP1 過度表現的細胞中已觀察到具有抑制 EGFR 活性的作用，相對的，
我們則是將細胞中HBP1 knockdown 之後來觀察 EGFR 活性是否有顯著的改變。我 們利用RNA 干擾術將細胞中之 HBP1 knockdown 之後，以 RT-PCR 來觀察 mRNA 的表現，以空的pSR 載體轉染之細胞當作控制組。圖 4-6 為 pSR 控制組與 HBP1 knokcdown 細胞之 HBP1 mRNA 表現。在 HPB1 knockdown 細胞中之 HBP1 mRNA 表現確實顯著的低於控制組的細胞。接著，我們分別給予控制組與HBP1 過度表現 的細胞10ng/ml 之 EGF 於 0 分鐘、5 分鐘、15 分鐘、30 分鐘、1 小時與 2 小時或是 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與 70ng/ml 之 EGF 刺激 20 分鐘後，
以Western blot 觀察 EGFR、pEGFR、Akt 與 pAkt 的表現。圖 4-7 為以 EGF 刺激不 同時間後之EGFR 的活性，結果顯示無論在那個時間點之下，HBP1 knockdown 細 胞之pEGFR 表現皆高於 pSR 控制組的細胞。而在濃度的改變下也有相同的結果，
無論在那個濃度下，HBP1 knockdown 的細胞 pEGFR 也都顯著的高於控制組，見圖 4-8。圖 4-9 與 4-10 則是 EGFR 下游 Akt 活性的結果，也與 EGFR 結果一致，在 HBP1 knockdown 的細胞中也顯著的提升。綜合以上結果得知，當細胞內 HBP1 表現降低 時，EGFR 的活性與控制組相比有顯著的增加。
第四章 結果
二、HBP1 調控細胞內 EGFR 活化所伴隨的 ROS 之生合成
因為 HBP1 可藉由調控細胞內 NADPH 氧化酶次單位的活性，進而影響
superoxide 的生成。superoxide 的偵測是利用 lucigenin 試劑，lucigenin 會與 superoxide 發出冷光，我們再以冷光偵測儀來做分析，結果使用relative light units (RLU)來呈 現。首先，我們將HBP1 過度表現的質體轉染至細胞內，提升細胞內的 HBP1，並 與控制組相比superoxide 的生成是否有所變化。圖 4-11 為給予 EGF 誘導後 HBP1 過度表現的細胞內之superoxide 變化，隨著 EGF 給予的時間增加，與控制組相比有 較低的superoxide 生成量；相反地，我們以 RNAi 降低細胞內 HBP1，觀察 EGF 所 刺激之活性氧化物的生成有何影響。圖4-12 HBP1 knockdown 細胞的結果，隨著 EGF 給予的時間增加，超氧化物的生成量顯著的多於控制組。由此結果可知，增加細胞 內HBP1 的表現可抑制 superoxide 的生成；反之，在 HBP1 表現減少時，EGF 刺激 所伴隨的superoxide 生成則會增加。
第四章 結果
三、細胞內 ROS 生成量可調控 EGFR 及其下游的活性
由以上結果得知，HBP1 對 EGFR 的活性與 EGF 所刺激之 ROS 的生成有抑制 的效果，因此我們想要觀察細胞內的ROS 的濃度是否會影響 EGFR 與其下游的活 性。我們使用已知的NADPH 氧化酶抑制劑 DPI 與自由基清除劑 NAC 來處理細胞，
減少細胞內ROS 的濃度，並以 Western blot 觀察 EGFR、pEGFR、Akt 與 pAkt 的蛋 白表現。在使用DPI 後可觀察到 EGFR 與下游 Akt 的活性有顯著的被抑制，圖 4-13 與 4-14 可見 pEGFR 與 pAkt 表現有顯著的下降；而以 NAC 處理後的細胞也有相同 的結果，EGFR 與 Akt 的活性有顯著的被抑制，見圖 4-15 與 4-16。由此結果可知，
降低細胞內ROS 濃度增加時可抑制 EGFR 與下游 Akt 之活性表現。
第四章 結果
四、HBP1 調控 EGFR 及其下游的活性是藉由抑制 NADPH 氧化酶次單位 p47phox
的基因轉錄
由於 NADPH 氧化酶次單位 p47phox為已知的HBP1 調控因子，若是 p47phox的改 變可影響EGFR 與 Akt 的活性，便可間接證實 HBP1 對 EGFR 的調控。因此我們利 用p47phox siRNA 來模擬 HBP1 抑制 p47phox基因轉錄的情形。我們將p47phox之siRNA 轉染至細胞中，並以GFP 為 transfection marker，觀察 p47phox mRNA 的表現。圖 4-17 為RT-PCR 的結果，可看出 p47phox siRNA 的細胞中，mRNA 的表現量顯著的低於控 制組。接著，在p47 phox knockdown 與控制組細胞中分別以 EGF 刺激之後，以 Western blot 來觀察 EGFR、pEGFR、Akt 與 pAkt 的蛋白表現。圖 4-18 顯示，在 EGF 的刺 激下，p47phox siRNA 的細胞中，pEGFR 的表現顯著低於控制組，顯示 EGFR 的活性 有被抑制的情形，圖4-19 之 Akt 活性亦有相對應的結果。由此可知，當 p47phox受到 抑制之後的對EGFR 的活性確實有顯著的影響，也間接證實了可抑制 p47phox轉錄的 HBP1 確實經由對氧化還原平衡的調控來抑制 EGFR 的活性。
第四章 結果
圖4-1 pBabe 控制組與 HBP1 過度表現細胞中之 HBP1 mRNA 表現量。使用 RT-PCR 並以1% Agarose 跑膠觀察 HBP1 mRNA 表現量，18S 為 internal control。
pBabe (control)
HBP1 overexpression
HBP1
18S
第四章 結果
圖4-2 HBP1 過度表現對 EGF 刺激不同時間後之 EGFR 活性的影響。pBabe 控制組 與HBP1 過度表現的細胞分別以 10ng/ml 之 EGF 處理 0 分鐘、5 分鐘、15 分鐘 、 30 分鐘、1 小時與 2 小時之後，以 5% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-EGFR 與 anti-pEGFR 抗體觀察EGFR 與 pEGFR 蛋白表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：pEGFR (ptyr845)
IB：EGFR
pBabe (Control) HBP1 Overexpression EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖4-3 HBP1 過度表現對不同濃度的 EGF 誘發之 EGFR 活性的影響。pBabe 控制組 與HBP1 過度表現的細胞分別以 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與 70ng/ml 濃度的 EGF 處理 20 分鐘之後，再以 5% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-EGFR 與anti-pEGFR 抗體觀察 EGFR 與 pEGFR 蛋白表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：pEGFR (ptyr845)
IB：EGFR
pBabe (Control) HBP1 Overexpression
EGF (20min)
第四章 結果
圖4-4 HBP1 過度表現對 EGF 刺激不同時間後之 Akt 活性的影響。pBabe 控制組與 HBP1 過度表現的細胞分別以 10ng/ml 之 EGF 處理 0 分鐘、5 分鐘、15 分鐘 、30 分鐘、1 小時與 2 小時之後，以 10% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗 體觀察Akt 與 pAkt 蛋白表現。
IB：pAkt (pser473)
IB：Akt
pBabe (Control) HBP1 Overexpression EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖4-5 HBP1 過度表現對不同濃度的 EGF 誘發之 Akt 活性的影響。pBabe 控制組與 HBP1 過度表現的細胞分別以 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與 70ng/ml 濃度的EGF 處理 20 分鐘之後，再以 10% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體觀察Akt 與 pAkt 蛋白表現。
IB：pAkt (pser473)
IB：Akt
pBabe (Control) HBP1 Overexpression
EGF (20min)
第四章 結果
圖4-6 pSR 控制組與 HBP1 knockdown 細胞中之 HBP1 mRNA 表現量。使用 RT-PCR 並以1% Agarose 跑膠觀察 HBP1 mRNA 表現量，18S 為 internal control。
pSR-HBP1i pSR
HBP1
18S
第四章 結果
圖4-7 HBP1 表現降低時對 EGF 刺激不同時間後之 EGFR 活性的影響。pSR 控制 組與HBP1 knockdown 的細胞分別以 10ng/ml 之 EGF 處理 0 分鐘、5 分鐘、15 分鐘 、 30 分鐘、1 小時與 2 小時之後，以 5% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-EGFR 與 anti-pEGFR 抗體觀察EGFR 與 pEGFR 蛋白表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：pEGFR (ptyr845)
IB：EGFR
pSR (Control) HBP1 shRNA (HBP1 Knockdown) EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖4-8 HBP1 表現降低時對不同濃度的 EGF 刺激之 EGFR 活性的影響。pSR 控制 組與HBP1 knockdown 的細胞分別以 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與70ng/ml 濃度的 EGF 處理 20 分鐘之後，再以 5% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-EGFR 與anti-pEGFR 抗體觀察 EGFR 與 pEGFR 蛋白表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr845) IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：EGFR
pSR (Control) HBP1 shRNA (HBP1 Knockdown)
EGF (20min)
第四章 結果
圖4-9 HBP1 表現降低時對 EGF 刺激不同時間之 Akt 活性的影響。pSR 控制組與 HBP1 knockdown 的細胞分別以 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與 70ng/ml 的EGF 處理 20 分鐘後，再以 10% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體 觀察Akt 與 pAkt 蛋白表現。
IB：pAkt (pser473)
IB：Akt
pSR (Control) HBP1 shRNA (HBP1 Knockdown) EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖4-10 HBP1 表現降低時對不同濃度的 EGF 刺激之 Akt 活性的影響。pSR 控制組 與HBP1 knockdown 的細胞分別以 0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml 與 70ng/ml 的 EGF 處理 20 分鐘後，再以 10% SDS-PAGE 跑膠並使用 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體觀察Akt 與 pAkt 蛋白表現。
IB：pAkt (pser473)
IB：Akt
pSR (Control)
HBP1 shRNA (HBP1 Knockdown) EGF (20min)
第四章 結果
圖 4-11 HBP1 表現增加對細胞內 EGF 誘發之 ROS 的生成之影響。細胞分別以 10ng/ml 的 EGF 處理 0 分鐘、5 分鐘 、15 分鐘與 30 分鐘後，以發光試劑 lucigenin 並使用化學冷光偵測儀分析superoxide 的生成量。
EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖 4-12 HBP1 表現降低時對細胞內 EGF 誘發之 ROS 生成之影響。細胞分別以 10ng/ml 的 EGF 處理 0 分鐘、5 分鐘 、15 分鐘與 30 分鐘後，以發光試劑 lucigenin 並使用化學冷光偵測儀分析superoxide 的生成量。
EGF (10ng/ml)
第四章 結果
圖4-13 以 DPI 降低細胞中 ROS 的生成量對 EGFR 活性的影響。細胞先以 0μM、
5μM、10μM、30μM 與 50μM的DPI 處理 18 小時後，再以 30ng/ml 的 EGF 刺激 15 分 鐘後，利用5% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-EGFR 與 anti-pEGFR 抗體觀察 EGFR 與 pEGFR 蛋白的表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：pEGFR (ptyr845)
IB：EGFR DPI (μM) / 18h
EGF (30ng/ml)/15min - + + + + + - - 5 10 30 50
第四章 結果
圖4-14 以 DPI 降低細胞中 ROS 的生成量對 Akt 活性的影響。細胞先以 0μM、5μM、
10μM、30μM 與 50μM的DPI 處理 18 小時後，再以 30ng/ml 的 EGF 刺激 15 分鐘後，
利用10% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體觀察 Akt 與 pAkt 蛋白的表 現。
.
IB：pAkt (pser 473)
IB：Akt
+ + +
+ + -
- - 5 10 30 50
DPI (μM) / 18h EGF (30ng/ml) / 15min
第四章 結果
圖4-15 以 NAC 降低細胞中 ROS 的生成量對 EGFR 活性的影響。細胞先以 15mM 的NAC 處理 0 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、20 分鐘與 30 分鐘後，再以 40ng/ml 的 EGF 刺激15 分鐘，利用 5% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-EGFR 與 anti-pEGFR 抗體觀察 EGFR 與pEGFR 蛋白的表現。
IB：pEGFR (ptyr 1086)
IB：EGFR
+ + +
+ + -
- - 5 10 20 30 NAC (15mM) / min
EGF (40ng/ml) / 15min
第四章 結果
圖4-16 以 NAC 降低細胞中 ROS 的生成量對 Akt 活性的影響。細胞先以 15mM 的 NAC 處理 0 分鐘、5 分鐘、10 分鐘、20 分鐘與 30 分鐘後，再以 40ng/ml 的 EGF 刺 激15 分鐘，利用 10% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體觀察 Akt 與 pAkt 蛋白的表現。
- - 5 10 20 30
+ + +
+ + -
pAkt (pser 473)
Akt NAC (min) / 15mM EGF (40ng/ml) / 15min
第四章 結果
圖4-17 pBabe 控制組與 HBP1 過度表現細胞中之 HBP1 mRNA 表現量。使用 RT-PCR 並以 1% Agarose 跑膠觀察 HBP1 mRNA 表現量，18S 為 internal control。
p47 phox 18S
第四章 結果
圖 4-18 模擬 HBP1 調控 p47phox表現來觀察EGFR 活性的變化。細胞分別以 0ng/ml、
5ng/ml、10ng/ml 與 50ng/ml 之 EGF 處理 20 分鐘後，利用 5% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-EGFR 與 anti-pEGFR 抗體觀察 EGFR 與 pEGFR 蛋白的表現。
IB：pEGFR (ptyr1173)
IB：pEGFR (ptyr1068)
IB：pEGFR (ptyr1045)
IB：pEGFR (ptyr845)
IB：EGFR
EGF (ng/ml) / 20min 0 5 10 50 0 5 10 50 0 5 10 50 Control GFP-siRNA p47phox-siRNA
第四章 結果
圖 4-19 模擬 HBP1 調控 p47phox表現來觀察Akt 活性的變化。細胞分別以 0ng/ml、
5ng/ml、10ng/ml 與 50ng/ml 之 EGF 處理 20 分鐘後，利用 10% SDS-PAGE 跑膠並以 anti-Akt 與 anti-pAkt 抗體觀察 Akt 與 pAkt 蛋白的表現。
IB：pAkt (pser 473)
IB：Akt
0 5 10 50 0 5 10 50 0 5 10 50 EGF (ng/ml) / 20min
Control GFP-siRNA p47phox-siRNA