第二章、 文獻回顧
第二節、 細胞凋亡 (Apoptosis)
第二節 細胞凋亡 (Apoptosis)
當細胞受到損傷，而細胞無法自我修復的時候，細胞將漸漸的走入死亡，
細胞死亡的方式有三種：細胞凋亡 ( Apoptosis ) 、細胞自噬( Autophagy ) ， 以及細胞壞死 ( Necrosis )。細胞凋亡這一名詞源自希臘語，又可稱為程序 性細胞死亡25。細胞凋亡與細胞壞死比較(表1)。細胞凋亡常常發生在單一細 胞或是一小群細胞群落，細胞形態上和生化特徵發生改變，如細胞膜的皺 縮(Zeiosis or rapid blebbing)、胞內DNA被降解、細胞會逐漸皺縮(shrink)與 聚集(condense)、磷脂醯絲胺酸(PS)從胞內向外翻，同時細胞凋亡體(apoptotic body)形成，一旦形成碎裂的凋亡小體或細胞片段馬上被附近正常細胞或吞 噬細胞吃掉26-27。
表一. 細胞凋亡 (Apoptosis) 與細胞壞死 (Necrosis)28-29
Apoptosis Necrosis
組織學 個別細胞染色質濃縮，凋亡體 (apoptotic body)
細胞腫脹、凝固性壞死、胞 器瓦解
細胞膜 磷脂phosphatidylserine 外翻 完整性喪失
機轉 基因活化，核酸內切酶 ATP 用盡，細胞膜受損、自 由基傷害
細胞反應 沒有發炎反應，凋亡體被吞噬 有發炎反應
DNA 降解 斷裂成約180-200 bp 的片斷 隨意性且廣泛性斷裂
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引發細胞凋亡的路徑可分為兩種類型：一種是內在路徑(Internal pathway)，
另一種是外在路徑(External pathway)30。
第一、內在路徑(Internal pathway)
內 在 路 徑 主 要 是 藉 由 粒 線 體 (mitochondrial) 或 是 內 質 網 (endoplasmic reticulum)所引起 31，其中最重要的調控著是 Bcl-2 家族蛋白 30，Bcl-2 本身
為凋亡抑制基因，根據功能和結構可將Bcl-2 基因家族分為兩類，一類是抗 凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1；一類是促進 凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim。而整個 Bcl-2 家
族在粒線體參與的凋亡途徑調控作用 32-33，當粒線體接受到促死刺激時，
Bax 會轉移至粒腺體外膜引起膜電位下降，使其打開線粒體膜孔，釋放出 Cytochrome c
、
AIF、Endo G。Cytochrome c 會誘導 Apaf-1(apoptotic protease activating factor-1)跟 proCaspase-9 結合，引起 Caspase-9 的活性進而活化下 游的Caspase-3 活性並引起細胞凋亡 34。而AIF、Endo G 會直接進入細胞核 中對DNA 進行裂解，而引起細胞凋亡35。
第二、外在路徑(External pathway)
外在路徑(External pathway)，又稱為死亡受器路徑，此路徑是指細胞膜 表面存在著接受 apoptotic signals 的受器（receptor），當特殊的 ligand 結合 受器之後，便可誘使某些蛋白鍵結在受器上，並引發下游的 caspases 活化
9
36。CD95(Fas) 是死亡受器家族的一員，當 Fas 與配位體 (ligand)Fas Ligand (FasL)結合後會啟動下游蛋白 FADD (Fas-associated death dormain)37，將 Procaspase-8 裂解使之活化 Caspase-8，。活化的 Caspase-8 再使 Caspase-3
活化而導致細胞凋亡38。另外有文獻指出，部分活化Caspase-8 的會去裂解 Bid，Bid 會活化 Bax 使得粒線體膜電位下降和 Bcl-2(抗凋亡蛋白)受到抑制，
進一步地導致粒線體內Cytochrome c 釋放，引發內在路徑的開啟，最後形 成細胞凋亡39。
圖五. 外外在、內
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內在與其他他相關的凋凋亡路徑圖圖 40
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第三節 細胞核轉錄因子–κB (NF-B)活化路徑
NF-B是由不同的次單元體（subunits）組成的同二聚體（homodimers）。
家族成員依結構蛋白質的不同被分為五種：p50，p52，p65（Rel A）41。Rel B 以及 c-Rel。而p65, Rel B 及 c-Rel 都具有一段活化區域（activation domains），這一段活化區域的氨基酸序列稱為 Rel homology region（RHR）
是用來與 DNA 鍵結或形成二聚體的區域。有研究已指出，NF-B的活化 作用與調控細胞凋亡（apoptosis）有關42-43。大多數細胞中NF-B以p65/p50 heterodimer存在41。在未活化狀態下NF-B在細胞質中與IB結合而抑制活性。
當細胞受到外來的刺激，如TNF-α、LPS，便會活化IKK（IB kinase），活
化 型 的 IKK 則 會 磷 酸 化 與 NF-B 相 結 合 的 IB ， 磷 酸 化 的 IB 受 到 ubiquitination而被26S proteasome分解而使 NF-B被釋放44-46。NF-B被釋放
後即進入細胞核中成為轉錄因子或是抑制細胞凋亡作用47-48。許多研究已經 顯示出，NF-B抑制細胞凋亡似乎是因為NF-B活化，促進x-IAP（X-linked inhibitor of apoptosis）、cIAPs（caspase inhibitors of apoptosis proteins）、Bcl-x
（B cell lymphoma x）、以及 Bcl-2（B cell lymphoma 2）表現，而抑制細 胞凋亡起始因子 Caspase-8 和 9 的活化作用49-51。此外NF-B除了跟調控 細胞凋亡（apoptosis）有關外，也參與細胞循環、細胞分化、細胞移動、血 管新生以及發炎反應，如調控基質金屬蛋白酶 9（MMP-9)、血管內皮細胞 生長因子 (VEGF)、一氧化氮合成酶 (iNOS) 的改變52-53。
圖六. N
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NF-B活化化相關路路徑54
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第四節 細胞週期(cell cycle)介紹
細胞週期可分四階段，分別為DNA合成前期（G1,gap 1），DNA合成期
（S, synthesis）和DNA合成後期（G2, gap2），有絲分裂期 (M,mitosis) 55。 在有絲分裂期的階段又可細分為五期，分別為prophase (前期)、metaphase (中 期),anaphase (後期),cytokinesis (細胞質分裂期)、telophase (末期)56。當細胞 由G1期→S期→G2期→M期分裂完時會離開細胞週期並停止分裂以等待下 次分裂的開始，此時稱為G0 phase57。
細 胞 週 期 主 要 受 到 cyclin,cyclin-dependent kinase (CDK) 以 及 CDK inhibitor (CKIs)調控。其中cyclin 及CDK兩著會在細胞質中結合形成complex 並進入核內促進cell cycle進行，如在G1期→S期主要是由cyclin D、E、CDK4、
6結合調控，G2期->M期主要由cyclin A,B,CDK2調控。而CDKIs則會和 cyclin,CDK所形成的complex結合，因而使cyclin及CDK分離造成cell cycle的
停止58-59。
然而細胞週期在每個階段也都設有checkpoint的機制來阻礙細胞週期 的進行。Checkpoint可分為(1)G1 checkpoint：主要決定是否應該細胞分裂、
延遲、停止分裂並檢查DNA是否受損。(2) G2 checkpoint，主要檢查細胞的 大小和DNA的複製過程是否完全。(3) spindle assembly checkpoint，主要檢 查染色體是否附著在紡錘體上60-61。
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第五節 研究目的
綜合有關Casticin 相關研究指出，Casticin 早期只當做抗發炎藥劑使用，
但現今逐漸被應用在抗癌方面。但未有研究指出Casticin 對於人類黑色素瘤 細胞株A375.S2 的抗癌效果與機制。因此本研究主要是利用 Casticin 是否對 人類的黑色素瘤細胞株 A375.S2 具有毒殺的效果，並進一步的推斷其造成 細胞死亡與細胞週期停滯而誘發產生細胞凋亡的分子機轉。
第一一節 實驗驗設計流程
第三章 程
圖七. 本
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章、研究材
本研究的
材料與方法
的實驗流程 法
程圖
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第二節 實驗材料 一、 細胞來源
本論文實驗所使用的細胞為人類黑色素瘤 (Human Melanoma cancer)細胞 株 A375.S2，購自新竹食品工業發展研究所 (Food Industry Research and Development Institute)
二、 藥品試劑
1. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)：購自 Amresco
2. 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine iodine (DiOC6)：購自 calbiochem 3. 40% Acrylamide/Bis (29:1)：購自 Amresco
4. Agarose：購自 MD 生化有限公司
5. Ammonium persulfate (APS)：購自 Amresco 6. Casticin：購自 Sigma Chemical Co
7. BioMax Flim：購自 Kodak
8. Bovine serum albumin (BSA)：購自 Merck
9. Dimethyl sulfoxide (DMSO)：購自 Sigma Chemical Co.
10. Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)：購自 Merck 11. ELC kit (Enhanced chemiluminescent kit)：購自 Amresco 12. Ethanol：購自 TEDIA
13. Fetal bovine serum (FBS)：購自 Invitrogen
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14. Formaldehyle：購自 Sigma Chemical Co.
15. 1Glycine ：購自 Amresco 16. L-Glutamine：購自 Invitrogen
17. Low melting agarose (LMA)：購自 USB 18. Methanol：購自 TEDIA
19. N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)：購自 Amresco 20. Fluo-3/AM：購自 Molecular Probes, Invitrogen
21. Penicillin-Streptomycin (PS)：購自 Invitrogen 22. Potassium chloride (KCl)：購自 Merck
23. Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) ：購自 Merck 24. Propidium iodide (PI)：購自 Sigma Chemical Co.
25. MEM medium ：購自 Gibco 3
26. Protein assay-Dye reagent concentrate：購自 Bio-Rad 27. Normal melting agarose (NMA)：購自 USB
28. PhiPhiLuxR kit：購自 OncoImmunin (Gaithersburg, MD, USA) 29. Protein extraction solution (PRO-PREP) ：購自 iNtRON
Biotechnology, Inc.
30. Protein marker：購自 Fermentas
31. RNase A (Ribonuclease A) ：購自 Amresco 32. Sodium chloride (NaCl) ：購自 Merck
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33. Sodium dodecyl sulfate (SDS) ：購自 Amresco
34. Tris (Tris(hydroxoymethyl)-aminomethane) ：購自 Amresco 35. Triton X-100：購自 Sigma Chemical Co.
36. Trypan Blue：購自 Sigma Chemical Co.
37. Tween-20：購自 Amresco
38. Trypsin-EDTA：購自 Sigma Chemical Co.
39. Tween-20：購自 Amresco 40. 顯影劑、定影劑：購自 Kodak 41. Primary antibody (1°antibody)
I. Anti-actin：購自 Sigma Chemical Co.
II. Anti-AIF：購自 BD III. Anti-Bid：購自 Chemicon IV. Anti-Bax：購自 Upstate V. Anti-Bcl-2：購自 Upstate
VI. Anti-Caspase-3：購自 Sigma Chemical Co.
VII. Anti-Caspase-9：購自 Upstate VIII. Anti-Cdc25c：購自 BD
IX. Anti-Cytochrome c：購自 biovision X. Anti-Endo G：購自 Santa cruz XI. Anti-CDK-1：購自 Upstate
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XII. Anti-CHK-2：購自 Upstate XIII. Anti-CyclinA：購自 BD XIV. Anti-CyclinB：購自 BD XV. Anti-Bcl-xL：購自 Santa cruz
XVI. Anti-Bak：購自 Cell Signaling Technology XVII. Anti-x-IAP：購自 Santa cruz
XVIII. Anti-Mcl-1：購自 Santa cruz XIX. Anti-PCNA：購自 Santa cruz XX. Anti-P65 NF-B：購自 Santa cruz XXI. Anti-P50 NF-B：購自 Santa cruz XXII. Anti-IB：購自 Santa cruz
XXIII. Anti-p-IB：購自 Santa cruz XXIV. Anti-Ikk：購自 Santa cruz XXV. Anti-p-Ikk：購自 Santa cruz 42. Secondary antibody (2°antibody)
I. Goat anti-mouse IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon
II. Goat anti-rabbit IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon
III. Goat anti-sheep IgG (HRP) horseradish peroxidase conjugated antibody：購自 Chemicon
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三、儀器設備
1. 無菌操作台、細胞培養皿、細胞培養箱、冷凍管、Pipetmen、恆溫離心 機、血球計數板、倒立式顯微鏡、Dispenser。
2. 去離子水製造機、電源供應器、酸鹼值測定器 (pH meter)、震盪器、
SDS-PAGE 電泳槽套組、Transfer Cell Bolt Kit、
加熱板。
3. 流式細胞儀、高速離心機、酵素免疫分析儀、單細胞電泳槽。
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第三節 實驗方法 一、Casticin 的配製
Casticin 為固體藥物，別名 Vitexicarpin。Casticin 的分子量為 374.35 g/mol ，純度為 98%，黃酮類化合物。利用 DMSO 為溶劑配置成 10 mM 的 庫存液 (stock solution)，並分裝於 1.5 ml 微量離心管。庫存液儲存於-20℃
冰箱中備用，於每次實驗前利用DMSO 稀釋成所需之濃度。
二、人類黑色素瘤A375.S2 細胞培養
A375.S2 所使用的培養基為 MEM medium，額外添加胎牛血清 (FBS)、
抗生素(PS)與 L-Glutamine (LG)，使細胞培養基最終含有 10% FBS、1% PS
與2 mM L-Glutamine。細胞培養箱環境具有 5% CO2 與 37℃的溫度。約隔 1 至 2 天換一次培養基，當細胞在細胞培養瓶中生長至八、九分滿時，避免
細胞生長過於擁擠而導致細胞狀態不良，甚至死亡，所以可進行繼代培養 或分盤以供實驗之用。
A375.S2 屬貼附型細胞，因此每次繼代培養或分盤實驗時都需要利用 Trypsin-EDTA 將細胞懸浮。先以磷酸緩衝液 (Phosphate buffer saline, PBS) 清洗細胞，再加入1~3 ml 的 0.5 mg/ml Trypsin-EDTA 處理 3 至 5 分鐘，當 細胞完全懸浮時，加入培養基以終止Trypsin-EDTA 的反應，移至離心管中，
並離心1500 rpm，5 分鐘。離心完後去除上清液，加入培養基稀釋細胞。一 部分細胞至新的培養瓶中進行繼代。剩餘的細胞則是利用血球計數盤與
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Trypan blue 來計算細胞數。Trypan blue 可以染死細胞而活細胞不會被染色，
藉此來分辨出活細胞與死細胞，再配合血球計數盤便可以計算出活細胞數。
計算完細胞數後，再依實驗所需之細胞數種至培養皿或培養盤中並進行實 驗。
三、細胞的冷凍保存
將 A375.S2 細胞大量培養後，在細胞處於生長狀態良好且存活率高之 情況下進行冷凍細胞。首先冷凍保存之細胞濃度：5×106 cells/ml。配置抗凍 劑，使用DMSO 與 FBS 混和配置成含有 5% DMSO 的 FBS，置於室溫下待 用。將細胞收集後，將抗凍液加入細胞中並分裝置冷凍小管中，標示好細 胞名稱、數目及冷凍日期。冷凍順序分別依序按照以下步驟進行降溫：4℃
存放30 分鐘，-20℃存放 60 分鐘，最後於-80℃存放至隔夜，之後再移至液 態氮桶中保存。
四、冷凍細胞的活化
解凍細胞的過程需要以快速為原則，如此可避免冰晶的產生與濃度過高 的DMSO 對細胞造成的傷害，導致細胞的死亡。因此將細胞從液態氮桶中 取出後，馬上以 37℃水浴槽快速回溫。等待溶解後加入培養基並均勻混和 以便稀釋DMSO 濃度，並使用離心機轉速 1500 rpm 5 分鐘，將抗凍劑去除。
移去上清液後加入新鮮培養基。種細胞於培養瓶中並於隔日更換新的培養 基，約培養一週後，待解凍的細胞恢復正常活性後才能開始實驗。
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五、細胞存活率 (Cell Viability)62
MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)是一種黃色水溶性
MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)是一種黃色水溶性