DAPI 染色法 (DAPI staining)

DAPI (4’-6-diamidine-2-phenyl indole)是一種核酸螢光染劑，會專一性的 與DNA 雙股螺旋上的小溝 (minor groove)結合，當細胞凋亡時會出現染色 質凝集與DNA 斷裂等現象。結合時在螢光顯微鏡下觀察到的螢光強度越強，

表示 DNA 斷裂的情形越嚴重。A375.S2 細胞經過不同濃度的 Casticin 藥物 處理後，可發現隨著濃度增加其螢光強度明顯增強(圖十三)，表示 DNA 斷 裂與核質濃縮的現象越明顯。

圖十三. Casticin 對於 A375.S2 細胞染色質凝集之現象。A375.S2 細胞以不同 濃度 之 Casticin 處理 24 小時後。利用倒立式螢光顯微鏡所觀察其染 色質凝集之現象與拍攝。

第五

50

第六節 Casticin 藥物對黑色素瘤 A375.S2 細胞週期的影響

利用流式細胞儀檢測細胞內 DNA 的含量用以判別細胞週期的分布。當 A375.S2 細胞以濃度 2 M 的 Casticin 共同培養 12, 18, 24 小時後， 由分析 圖可發現G2/ M 的比例隨著處理時間的增長而增加 (圖十五)。由量化圖更 可明顯的看到細胞出現停滯在G2/ M 期的現象 (圖十六)。

51

Ce ll phas e di str ibuti on(%)

0

contorl 12 h

18 h 24 h

Channels (FL2-A)

0 40 80 120 160

Castacin (2 M) G0/G1

52

第七節 西方墨點法探討 Casticin 對黑色素瘤 A375.S2 細胞週期蛋白表現 當細胞 DNA 受損時，細胞週期會停滯，以西方墨點法觀察 G2/ M phase 停滯相關蛋白質表現量的變化。經實驗結果發現，Casticin 藥物會引起 G2/ M 期的相關蛋白 Cdc25c, Cyclin A, Cyclin B, CDK-1 蛋白質表現量下降與 CHK-2, p21 蛋白表現量上升 (圖十七)。顯示 Casticin 藥物引起細胞週期停 至於G2/ M phase 是藉由 CHK-2 活化，進而抑制下游 Cyclin A 與 Cyclin B 表現所導致，可證明 Casticin 藥物可誘使 A375.S2 細胞的細胞週期停滯在 G2/ M。

圖十十七. Cas Cas 期調

sticin 對於 sticin 藥 調控蛋白的

於 A375.S2 藥物處理 A

的表現變化

53

2 細胞週期 375.S2 細 化。

期調控蛋 細胞後，利

蛋白的表現 利用西方墨

現變化。以 墨點法檢測

以 2M 的 測細胞週 的 週

54

第八節 Casticin 藥物對黑色素瘤 A375.S2 細胞產生活性氧物 質(Reactive oxygen species, ROS)的影響

A375.S2 細胞以 2M 的 Casticin 藥物處理後，經過 1, 3, 6, 9, 12 小

時後，利用流式細胞儀偵測 DCF 螢光量，觀察 ROS 在細胞內的表現情形。

隨著處理藥物的時間越長 DCF 螢光量就開始有上升明顯增加的趨勢(圖十 八)，結果顯示 Casticin 藥物會促進細胞活性氧物質。

(A) (B)

圖十八. Casticin 對於 A375.S2 細胞產生活性氧物質影響。A375.S2 細胞以 2

M 的 Casticin處理後，利用流式細胞儀觀察 ROS 在細胞內的表現。

(A) 流式細胞儀觀察 ROS 在細胞內表現分析圖。(B) ROS 在細胞內 表 現 量 化 圖 ， 實 驗 數 據 以 三 重 複 求 其 平 均 值 與 標 準 差 ， 並 以 student＇s

t

-test 統計分析，*表示

p

<0.05

55

第九節 Casticin 藥物對黑色素瘤 A375.S2 細胞抑制劑檢測 ROS scavenger ( N-acetyl cysteine -NAC )的影響

為了證實細胞是因為受到氧化壓力的影響而導致細胞的死亡，本實驗 藉由N-acetyl cysteine (NAC) 做為 ROS 產生清除劑。A375.S2 細胞預先處 理5 mM NAC 3, 4 小時後，再添加 Casticin 藥物對細胞進行誘導。實驗結果 發現，經5 mM NAC 預先處理的細胞之細胞存活率明顯的提升(圖十九)。

C ell via b ility (% o f con tro l)

0 20 40 60 80 100 120

Casticin NAC

- - + + +

- + 3h 4h

-*

圖十九. Casticin 藥物對於 A375.S2 細胞特異性抑制劑 NAC 的影響。A375.S2 細胞先後處理5 mM NAC 及 2 M 的 Casticin 藥物，對存活率的影 響。實驗數據以三重複求其平均值與標準差，並以 student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05。

56

第 十 節 Casticin 藥 物 對 黑 色 素 瘤 A375.S2 細 胞 粒 線 體 電 位 的 影 響 (Mitochondrial membrane potential, MMP, Δ



m)

A375.S2 細胞以 2M 的 Casticin 藥物處理後，經過 6, 12, 24, 36 小時後，

利用流式細胞儀偵測DiOC₆螢光量來觀察粒線體電位(



m)的變化。隨著 處理藥物的時間越長 DiOC6 螢光量顯著下降的趨勢(圖二十)，結果顯示 Casticin 藥物會影響 A375.S2 細胞內粒線體膜電位並使之下降。

(A) (B)

圖二十. Casticin 對於 A375.S2 細胞粒線體膜電位的影響。(A) 粒線體膜電 位的變化之分析圖。(B) 粒線體膜電位的變化之量化圖。實驗數據 以三重複求其平均值與標準差，並以student’s t-test 統計分析，*表 示p<0.05

57

第十一節Casticin 藥物誘導 A375.S2 細胞受到 Caspase-3 activity 的影響 Caspase-3 的活性常被做為細胞凋亡的指標之一，利用流式細胞儀偵測 PhiPhiLux，螢光的強度越強表示 Caspase-3 的活性增加。隨著處理 Casticin 藥物時間的增加，Caspase-3 的活性也就越高。Casticin 藥物可以誘發 Caspase-3 的活性也進一步的確認 Casticin 藥物可以引起細胞的凋亡。由實

驗結果得知，A375.S2 細胞經過 2M 之 Casticin 藥物處理 12, 24 小時之後，

Caspase-3 的螢光強度明顯增加 (圖二十一)，

(A

圖二十一. Casticin 對 A375.S2 細胞 Caspase-3 活性影響。(A) caspase-3 活性 之分析圖。(B) caspase-3 活性之量化圖。實驗數據以三重複求其 平均值與標準差，並以student’s t-test 統計分析，*表示 p<0.05

(B)

第十

圖二

60

第十三節 免疫螢光染色探討Casticin對A375.S2細胞中凋亡相關蛋白 表現與轉移之影響

利用免疫螢光染色法去觀察細胞中蛋白的表現與移動的現象。以2 M 的Casticin藥物處理A375.S2細胞12小時後，以免疫螢光染色與共軛膠顯微鏡 觀察。實驗結果顯示，當細胞以藥物處理12小時之後AIF (圖二十五)和Endo G (圖二十六)大量的表現與釋放之細胞質中。

61

圖二十五. 免疫螢光染色觀察AIF的表現與轉移。A375.S2細胞以2 M 的 Casticin處理，並經過12小時後，觀察AIF的表現與轉移。

圖二十六. 免疫螢光染色觀察Endo G的表現與轉移。A375.S2細胞以2M 的Casticin處理，並經過12小時後，觀察Endo G的表現與轉移。

第十

63

第十五節 Quantitative PCR Analysis探討Casticin對A375.S2細胞產生凋亡 相關蛋白之mRNA表現

利用Quantitative PCR Analysis探討當A375.S2細胞處理2 M Casticin藥 物之後，AIF, Endo G, Caspase-3, -9 mRNA表現量。實驗結果顯示在2 M Casticin藥物處理下Endo G, Caspase-3, -9 mRNA表現在12小時有上升的情 形 (圖二十八)。

64

(A)

Caspase-3 Caspase-9 Endo-G AIF

R aw R Q (R ealative Q u antification)

0.0

圖二十八. Casticin對A375.S2細胞凋亡蛋白之mRNA影響。利用Quantitative PCR Analysis檢測AIF, Endo G, Caspase-3, -9 mRNA表現量。(A ) 所設計的primer。(B) mRNA表現量之量化圖。實驗數據以三重 複求其平均值與標準差，並以student’s t-test統計分析，*表示 p<0.05。

Primer Name Primer sequence

Human caspase-3-F CAGTGGAGGCCGACTTCTTG Human caspase-3-R TGGCACAAAGCGACTGGAT

Human caspase-9-F TGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTT Human caspase-9-R GTGAGCCCACTGCTCAAAGAT

Human AIF-F GGGAGGACTACGGCAAAGGT

Human AIF-R CTTCCTTGCTATTGGCATTCG

Human Endo G-F GTACCAGGTCATCGGCAAGAA

Human Endo G-R CGTAGGTGCGGAGCTCAATT

Human GAPDH-F ACACCCACTCCTCCACCTTT

Human GAPDH-R TAGCCAAATTCGTTGTCATACC

(B)

第十

第十

第十

68

第十九節 探討Casticin對A375.S2細胞內NF-B之轉移位置影響

利用免疫螢光染色法去觀察細胞中蛋白的表現與移動的現象。以2 M的

Casticin藥物處理A375.S2細胞6小時後，以免疫螢光染色與共軛膠顯微鏡觀 察。實驗結果顯示，當細胞以藥物處理6小時之後NF-B被抑制進入細胞核 內與DNA結合 (圖三十二)。

圖三十二. 免疫螢光染色法觀察NF-B之表現與轉移。A375.S2細胞以2M 的Casticin處理，並經過6小時後，免疫螢光染色與共軛膠顯微鏡 觀察NF-B的表現與轉移。

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第五章 實驗討論

惡性腫瘤 (癌症) 連續28年高居台灣國人十大死因首位，平均每13分10 秒有一人死於癌症。而惡性腫瘤其中之一疾病黑色素瘤的發生率占所有癌 症的百分之三至八成，據世界衛生組織報告，全球每年發生黑色素瘤有關 的死亡人數約48000。現今針對黑色素瘤的治療方式不外乎藉由外科治療(切 除)、放射治療、化學治療(DTIC, BCNU)、免疫治療，這些方式來去除。但

有時這些治療方法並不是非常顯著也帶有一定的副作用。因此我們極力尋 找中草藥，看是否可替代這些治療方式。許多研究指出，Casticin的類黃酮 具有多種腫瘤細胞毒性作用機制，Casticin可抑制人類肺癌細胞（PC- 12）

和人類結腸癌細胞 (HCT-116)的活性²³。細胞週期調控中可誘導 p21蛋白，

抑制CDK-1蛋白，使細胞週期調控蛋白Cyclin A表現量減少，造成細胞週期 G2/M停滯²²。另一方面Casticin也可誘導血癌細胞內抗凋亡蛋白Bcl-2表現量

下降，讓血癌細胞走向凋亡²⁴。然而並沒有文獻或相關的資料顯示出Casticin 會對人類惡性的黑色素瘤細胞造成影響，所以我們藉由Casticin藥物來對人 類黑色素瘤細胞株是否誘導細胞凋亡以及抗癌分子的機轉來加以探討。

本研究中從細胞的形態來看，發現經Casticin藥物治療後的A375.S2細胞

株的細胞型態改變呈現皺縮，並隨著濃度增加與時間的增長，細胞數目減 少、細胞膜變的不規則與細胞質呈空泡化 (圖八、圖九)。然而由細胞存活 率得知Casticin有時間與劑量的依存性 (time-dependent and dose- dependent)

70

抑制A375.S2細胞生長，並在高濃度、長時間下對於人類正常角質細胞 (HaCaT cell)才具有毒殺效果 (圖十、圖十一)。當細胞凋亡時，DNA會嚴重 受損(damage)與斷裂(fragmentation)，細胞質產生凝集現象，細胞膜會往內 皺縮形成凋亡小體。由彗星試驗 (comet assay)可檢測DNA受損情形，當DNA 受損情形越嚴重則彗星拖尾的現象越長，實驗結果顯示隨著Casticin濃度的 增加彗星拖尾的情形越長 (圖十二)。由DAPI試驗與DNA膠體電泳可觀察 DNA是否斷裂 (fragmentation)，細胞質是否產生凝集現象。實驗結果顯示 經Casticin處理過後的A375.S2細胞，DAPI所發出的螢光隨著濃度增加而變 強，細胞質產生凝集（圖十三）。DNA斷裂的情形也越來越嚴重(圖十四)。

有研究指出Casticin可誘導 p21蛋白，抑制CDK-1蛋白，使細胞週期調控 蛋白Cyclin A表現量減少，造成細胞週期G2/M停滯²²。但還沒有文獻指出說 Casticin是否可調控G2/M期的Cyclin B, CHK-2, p53, Cdc25等相關蛋白表現。

本研究中利用流式細胞儀來分析Casticin藥物對於人類黑色素瘤細胞

A375.S2是否產生細胞週期停滯及細胞凋亡的現象，結果顯示隨著藥物處理 的時間增加，細胞週期逐漸停滯G2/M期，而Sub-G1也有明顯的增加(圖十五)。

另一方面藉由西方墨點法來分析蛋白變化 p53, p21, CHK-2蛋白明顯得增 加，而Cyclin A, B, Cdc25c表現有被抑制的情形 (圖十七)。上述結果可得知 Casticin也調控Cyclin B, Cdc25c, p53, CHK-2等蛋白造成A375.S2細胞株的細 胞週期停滯G2/M期和細胞凋亡。

另外我們也藉由流式細胞儀來觀察細胞凋亡時的變化，有研究指出，活

71

性氧化物自由基群ROS (Reactive oxygen species)的增加會引起粒線體膜電 位 



m,Mitochondrial membrane potential)下降，而活化下游的caspase的活

性，造成細胞凋亡⁷⁵。而在相關文獻部分並無指出說Casticin可造成ROS大量 釋放引起粒線體膜電位的改變。藉由實驗結果得知，利用Casticin處理 A375.S2細胞後，活性氧化物自由基群ROS的螢光量在1小時後開始上升 (圖

十 八) ， 為 了 證 實 ROS 是 否 影 響 細 胞 凋 亡 ， 我 們 使 用 了 ROS 清 除 劑 N-Acetyl-cysteine (NAC)，在加藥前預先處理後，以MTT assay來檢測細胞存 活率，發現在加藥前預先處理ROS清除劑N-Acetyl-cysteine (NAC)，細胞存 活有回升的情形 (圖十九)。另外實驗結果也顯示粒線體膜電位在12小時後 開始下降 (圖二十)。最後檢測與粒線體相關凋亡路徑中Caspase-3的活性，

結果顯示在A375.S2處理藥物後，Caspase-3活性有上升的情形 (圖二十一) 由以上結果可得知Casticin可藉由ROS大量釋放造成細胞凋亡並促使粒線體

結果顯示在A375.S2處理藥物後，Caspase-3活性有上升的情形 (圖二十一) 由以上結果可得知Casticin可藉由ROS大量釋放造成細胞凋亡並促使粒線體

在文檔中 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/41306 (頁 61-0)