細胞存活率分析 - Blocking 與免疫轉漬(immunoblot) - 鑑定能強化清除多麩醯胺酸堆積的新穎小分子藥物

C. Blocking 與免疫轉漬(immunoblot)

8. 細胞存活率分析

藥物處理後的細胞，移除培養液並用 PBS 清洗後用胰蛋白酶 -EDTA 處理 5 min，用 PBS 沖洗收集細胞樣本。以 15 % 酒精處理 30 min 作為控制組。加入 0.5 ng/ml PI 染劑染色利用流式細胞

儀偵測細胞樣本，收集 10,000 個細胞樣本，利用程式分析 (CellQuest Pro)螢光強度的分佈比值。

伍、結果

一、鑑定脂溶性的化合物可以增加細胞自噬

將各式小分子的化合物溶入脂溶性介質 DMSO 中。將這些藥物利用神經瘤母細胞含有致病的不同長度 polyQ-EGFP 基因轉殖，並藉由 doxycycline 誘導表達後的細胞平台進行篩選。以溶酶體染劑

LysoTracker 作為篩選的指標。使用誘導四天的 Q79 細胞株，以 5、

10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時，可藉由流式細胞儀鑑定能使 LysoTracker 螢光量提高的藥物，Compound A 為本實驗室先前篩選出能隨藥品濃度使 LysoTracker 螢光量提高的藥物，作為正控制組。實驗結果顯示代號為 Compound B 的藥品會隨其濃度增加，讓

LysoTracker 螢光量上升(Fig. 1)。再利用不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株作進一步確記。由實驗結果中顯示在不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株中隨 Compound B 濃度增加，LysoTracker 螢光量會有不同程度提升，這可以自流式細胞儀分析結果中產生螢光強度曲線不同程度右移看出來(Fig. 2A)，實驗利用螢光量進行統計，以 20 μM Compound B 處理 48 小時後，Q36 的螢光強度增加 64 %、Q61 增加兩倍而 Q79 增加 1.4 倍，相較於控制組都達到顯著差異(Fig. 2B)。

二、經過藥物處理 48 小時可以有效清除堆積的多麩醯胺酸 利用達到致病重複次數的 Q79 細胞株誘導四天後，使其表現 79Q-EGFP，並可以藉由 EGFP 所釋放的螢光看到堆積物。以 5、10 和 20 μM 處理實驗藥物 48 小時後，再利用螢光顯微鏡觀察，並計算每 500 個有 79Q-EGFP 表現的細胞中具有堆積物細胞的數目，以 DMSO 的控制組為基準，觀察加藥組的堆積物比例是否有變化，另以 Compound A 為正控制組。實驗顯示隨 Compound A 和 Compound B 濃度增加，帶有堆積物的細胞的數量都有明顯降低(Fig. 3A)。在三次獨立實驗的統計中，Compound A 於 20 μM 可減少一半帶有堆積物的 細胞的數量，而 Compound B 於 10 μM 可減少一半帶有堆積(Fig. 3B)。

三、藥物透過促進細胞自噬去降解 polyQ-EGFP 的堆積物

為證明 79Q-EGFP 的堆積物的減少是因為藥物促進細胞自噬所造成。實驗利用 doxycycline 誘導四天的 Q79 細胞株，先以細胞自噬抑制劑—3-MA 或 Baf A1 處理 24 小時後，更換培養基，再分別以 5、

10 和 20 μM 處理藥物 48 小時後，利用螢光顯微鏡觀察並比較藥物處理和在有及缺乏抑制劑預處理的差異。實驗顯示抑制劑處理後藥物處理組中，以 3-MA 和 Baf A1 預處理都能使藥物所誘導生成細胞自噬下降，帶有 79Q-EGFP 堆積物的細胞的數量上升(Fig. 4A)。表示藥物

透過誘導細胞自噬而達到減少 79Q-EGFP 的堆積物的效果。在三次獨立實驗的統計也顯示，與藥物處理組比較，預處理 3-MA 帶有堆積物的細胞的數量增加兩倍，預處理 Baf A1 帶有堆積物的細胞的數量增加 2.3 倍(Fig. 4B)。

四、由分子層次證實藥物的功能

為進一步地去了解藥物的清除堆積物的效果和作用機制。利用西方轉漬法檢查 polyQ-EGFP 的堆積物和細胞自噬路徑中相關蛋白的表現。由於 polyQ-EGFP 累積時會產生不同大小的堆積物，因此在蛋白質電泳時會被分離，可觀察到 polyQ-EGFP 單體和一系列不同分子量的堆積物。利用表現不同長度的 Q36、Q61 和 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後萃取細胞蛋白質。

實驗結果顯示，隨 Compound B 濃度上升，Q61 和 Q79 細胞株的高分子堆積物會有下降。在 20 μM 處理下 Q61 的高分子堆積物下降 40 % 而 Q79 的高分子堆積物下降 30 %，而 Q36 沒有形成明顯的高分子堆積物 (Fig. 5A)。而 polyQ-EGFP 單體隨 Compound B 濃度上升而增加，在 10 μM 處理下 Q36 增加 10 %，Q61 增加 30 %而 Q79 增加 20%

(Fig. 5A)。另外，利用 Dot Blot 確認高分子堆積物的清除，Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後萃取

細胞蛋白質。實驗結果顯示，隨 Compound B 濃度上升，Q79 細胞株的高分子堆積物會有下降。在 20 μM 處理下，Q79 的高分子堆積物下降 60 %(Fig. 5B)。細胞自噬的路徑方面，西方轉漬法的結果可發現在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株中，細胞自噬相關蛋白 Beclin 1 和 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例都有增加，而 p62 隨著減少；在 20 μM 處理下，

Q36 的 Beclin 1 表現量增加 20 %、Q61 增加 40 %而 Q79 增加 60 %；

Q36 的 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例(LC3-II/LC3-I)增加兩倍、Q61 增加 30 %而 Q79 增加 2.3 倍；Q36 的 p62 表現量減少 30 %、Q61 減少 50 %而 Q79 減少 60 % (Fig. 6)。此外，為確定細胞自噬抑制劑能抑制 Compound B 的藥效，進一步證明 Compound B 是誘過促進細胞自噬去清除 polyQ-EGFP 的堆積物。將 Q79 細胞株誘導四天後，處理 20μM 濃度的細胞自噬抑制劑 3-MA 24 小時，再以 20 μM Compound B 處理 48 小時後萃取細胞蛋白質。由西方轉漬法的結果，將控制組和抑制劑組作比較，可以發現 Beclin 1 下降 10 %和 LC3 轉換率下降 30 %，

而高分子 79Q-EGFP 的堆積不會被清除，顯示 3-MA 可以抑制細胞自噬的進行(Fig. 7)。而比較加藥組和抑制劑預處理組，結果顯示 3-MA 讓細胞自噬和清除 79Q-EGFP 的堆積物的能力均受抑制，處理 20 μM Compound B 後高分子 79Q-EGFP 的堆積下降 30 %而預處理 3-MA 後高分子 79Q-EGFP 的堆積上升 40 % (Fig. 7)。這結果提供了更多的證

據，顯示 Compound B 是藉由促進細胞自噬去清除 polyQ-EGFP 的堆積物。

五、更多促進細胞自噬的證據

為更確定藥物促進完整的細胞自噬路徑，可以利用共軛焦顯微照相觀察細胞自噬相關現象。實驗利用誘導四天的 Q79 細胞株，以 5、

10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後利用免疫螢光標記 LC3 後在共軛焦顯微照相觀察。顯示 LC3 聚集形成自噬體會隨藥物濃度而上升(Fig. 8)。

自噬體與溶酶體融合是降解堆積物的重要步驟，為了解

Compound B 是否能促進兩者融合，將帶有綠色螢光標記的 LC3 重組基因(GFP-LC3)轉殖 SK-N-SH 細胞株後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時。接著用 LysoTracker 染色後於共軛焦顯微照相觀察。發現隨藥物濃度增加，可以看到更多 LC3 聚集體與溶酶體共定位(colocalization) (Fig. 9)。這些結果顯示 Compound B 能促進自噬體形成並與溶酶體結合進行降解，更進一步確定 Compound B 是利用細 胞自噬清除 polyQ-EGFP 的堆積。

六、藥物不會影響細胞的存活率

為了了解藥物是否影響細胞的存活。本研究進行細胞存活率的實

驗。利用 Q36、Q61 和 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後，收集細胞進行 PI 染色並利用流式細胞儀偵測，以 15 %酒精處理作為控制組。PI 染劑是一種不能通過完整細胞膜的 DNA 染劑，所以只有細胞膜破壞的死細胞會被染上 PI 染劑。在流式細胞儀分析後，可分離出沒有染上 PI 的活細胞群和染上 PI 的細胞群，利用程式分析(CellQuest Pro)可得到分佈的比值，本研究以沒有染上 PI 的活細胞群的比率作為細胞存活率的指標。由量化圖中可確認 Compound B 在本研究所使用的濃度下都不會影響細胞存活率，而 15 %酒精處理組，Q36 的存活率下降 10 %，Q61 的存活率下降 34.3 %而 Q79 的存活率下降 24.3 % (Fig 10.)。

七、藥物可以清除細胞核內的 79Q-EGFP 堆積物

在螢光顯微鏡觀察 Q79 細胞內 79Q-EGFP 的聚集時，發現細胞核內的 79Q-EGFP 堆積物亦會隨 Compound B 濃度增加而減少。因此利用螢光顯微鏡觀察在藥物處理下 Q79 細胞內 79Q-EGFP 堆積物的分佈並計數。結果顯示 Compound B 處理 48 小時後，細胞質與細胞核中的 79Q-EGFP 堆積物都會隨藥物濃度增加而減少(Fig. 11A)。在三次實驗的統計中，在 20 μM 濃度下，細胞質的堆積物減少 82 %而細胞核的堆積物減少 29 %，都具有顯著差異(Fig. 11B)。為進一步確定藥物清除細胞核內堆積物的能力，利用 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、

10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後收集細胞，分離並萃取細胞質和細胞核的蛋白質。西方轉漬法的結果顯示細胞質與細胞核的高分子 79Q-EGFP 堆積物都隨藥物濃度增加而減少，79Q-EGFP 單體隨之增加；在 20 μM 濃度下，細胞質的堆積物減少 40 %，細胞核的堆積物減少 80 %；而 10 μM 濃度下，細胞質的 79Q-EGFP 單體增加 30 %，

細胞核的 79Q-EGFP 單體增加 80 % (Fig. 12)。

陸、討論

在多麩醯胺酸疾病中，突變的蛋白質聚集形成不可溶物影響神經細胞的正常運作是其主要的致病機轉(3)。減少這些突變蛋白聚集被認為是具有潛力的治療策略，其中透過誘導細胞自噬去降解突變蛋白聚集被認為是有效的治療方式(4)。因此，本研究利用轉殖不同長度的 polyQ-EGFP 基因的細胞作為篩選平台，在一系列的合成化學物中篩選出能透過增強細胞內消除蛋白複合物的機制—細胞自噬去降解聚集的突變蛋白的藥物。

前文提及細胞自噬過程中最後階段自噬體會通過溶酶體融合去代謝內容物，因此細胞中溶酶體的數量可以用來表示細胞自噬的活性。而 LysoTracker 是一種標定紅色螢光的鹼性胺基酸，會自然的堆積在細胞內酸性區域也就是溶酶體(65)。所以本研究利用 LysoTracker 的螢光強度增加作為篩選藥物的指標。在 Q79 細胞株中利用

LysoTracker 篩選一系列的合成化學物後，發現 Compound B 能隨濃度提高 LysoTracker 螢光量。與本實驗室先前篩選出能細胞自噬清除多麩醯胺酸蛋白堆積的藥物 Compound A 有相似趨勢(Fig 1.)。這表示 Compound B 有可能具有促進細胞自噬的能力，接著在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株利用 Compound B 處理細胞 48 小時後，Compound B 在各細胞株中都能隨濃度使 LysoTracker 螢光量增加(64 % ~ 兩倍)，並在

三次獨立實驗中統計中具顯著差異(Fig 2B.)。這顯示 Compound B 具有發展潛力，因此進行後續實驗測試是否具有清除多麩醯胺酸蛋白堆積的效力。在細胞存活實驗中 Compound B 在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株都不會影響細胞存活率(Fig 10.)，表示 Compound B 不影響細胞存活。

本研究使用的細胞株表現具有螢光標記的致病蛋白，所以在螢光顯微鏡下可觀察到致病蛋白的位置和是否形成聚集。文獻指出可透過計算一定量細胞中，帶有致病蛋白聚集的細胞數作為評估蛋白聚集是

在文檔中鑑定能強化清除多麩醯胺酸堆積的新穎小分子藥物 (頁 29-61)