鑑定能強化清除多麩醯胺酸堆積的新穎小分子藥物

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 鑑定能強化清除多麩醯胺酸堆積的新穎小分子藥物 Identification of A Small Molecule in Enhancing the Clearance of Polyglutamine Aggregation. 研究生；梁偉賢 Wai-Yin Leong 指導教授：方剛博士 Kang Fang. 中華民國 103 年 8 月.

(2) 誌謝. 轉眼之間兩年過去，從一開始連細胞都不會養的新生到現在論文完成，一路上有很多幫忙我的人，在此致上由衷的感謝。首先，我要感謝指導教授方剛老師的教導，包容我一開始的實驗失誤，耐心與我討論實驗結果，細心地幫我修改論文以及一直以來的支持和鼓勵。其次，我感謝口試委員黃偉邦教授和姚清發教授對論文的建議，使論文更加完整。另外，我要感謝實驗室同學兩年來的幫助，長亨學長教我實驗技術和討論實驗；景平學長和俊彥學長教我實驗技巧；Martin，采蓁和佩岑帶給我歡樂的研究生生活；柏緯學弟對我的幫忙。我也祝福丹玉，玉玲學妹，潮永學弟和文興學弟未來的研究生活一切順利。最後，我要感謝我的家人一直以來的支持和勉勵，讓人在外地的我可以專注學業，謝謝你們。. i.

(3) 目錄中文摘要————————————————2 英文摘要————————————————4 壹、文獻回顧——————————————5 貳、研究背景——————————————14 參、研究目標——————————————16 肆、研究材料與方法———————————18 伍、結果————————————————29 陸、討論————————————————36 柒、參考文獻——————————————41 捌、圖表————————————————48. 1.

(4) 摘要多麩醯胺酸疾病是由於突變基因表現不正常擴增的 CAG 三個核苷酸重複所引起的神經退化性疾病。突變基因會產生帶有過度擴增多麩醯胺片段的蛋白質所造成。擴增的多麩醯胺酸片段會導致錯誤摺疊並形成不可溶且具有神經毒性的聚合物，導致神經細胞生理功能受到影響進而引起細胞死亡。減少毒性蛋白的堆積被認為是能有效改善病情的治療策略，目前對這類疾病所發展出有效的治療藥物仍然有限。細胞自噬是細胞內降解蛋白質和胞器的重要方式。它能透過形成雙層膜結構包裹需降解蛋白後，與溶酶體融合進行分解。細胞自噬被認為能清除多麩醯胺酸疾病相關毒性蛋白，具有保護神經細胞的功能。因此，促進細胞自噬是被認為是治療多麩醯胺酸疾病的可行方式。本研究利用人類神經瘤母細胞表現過度延長多麩醯胺片段蛋白質作為篩選平台，鑑定一系列小分子合成化合物。實驗是以螢光染色標定細胞自噬相關標記，篩選出能誘導細胞自噬的化合物。再利用螢光顯微鏡確認藥物能加強清除毒性蛋白堆積物。並利用西方轉漬法確認藥物能促進細胞自噬的標記蛋白 LC3-I 轉換 LC3-II。此外，利用細胞自噬抑制劑發現細胞自噬受到抑制會使藥物效果減弱，證明藥物是透過促進自噬來清除毒性蛋白堆積物。未來仍應對藥物誘導自噬影響的機制作更深入的研究，希望能提供更多相關細胞自噬的證據，開發出更多有 2.

(5) 效治療多麩醯胺酸疾病的藥物。關鍵字: 多麩醯胺酸、神經退化性疾病、細胞自噬. 3.

(6) Abstract Polyglutamine diseases are a family of neurodegenerative diseases that are derived from a CAG trinucleotide repeat expansion in a specific gene. This produces a mutant protein that contains an abnormally elongated polyglutamine tract. The expanded polyglutamine tract confers the protein toxic aggregate that affects neuronal physiological functions and cell survival. There is no effective to prevent the progression of polyglutamine diseases. The increased clearance of mutant proteins has been proposed as a potential therapeutic approach. Autophagy is an intracellular proteins and organelles degradation process. It involves the formation of double membrane structures that can engulf protein and fuse with lysosomes for protein degradation. Autophagy had been reported that to enhance the clearance of polyglutamine diseases-related proteins. Thus, strategy to enhance autophagy may be beneficial approach for polyglutamine diseases treatment. In this study we screened a number of small molecular compounds using human neuroblastoma cells that express pathogenic polyglutamine proteins. We have identified a small molecule that could induce autophagy. Second, this molecule was proved capable of eradicating polyglutamine accumulations as indicated by fluorescence microscopy. The increased conversion of LC3-I to LC3-II forming autophagosome was evidenced by western blotting and confocal microscopy. In addition, the effects was reduced by pretreating the autophagy inhibitor. In future, we will continue to investigate the mechanisms of this molecule in autophagy-induced polyglutamine elimination. Key words: polyglutamine; neurodegenerative diseases; autophagy. 4.

(7) 壹、文獻回顧一、多麩醯胺酸疾病(Polyglutamine diseases) 多麩醯胺酸疾病是一類常染色體顯性遺傳的神經退化性疾病，其中包括亨丁頓氏症(Huntington’s disease, HD)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pollidoluysian atrophy, DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bulbar muscular atrophy, SBMA)和數類型的脊髓小腦萎縮症(Spinocerebellar ataxias, SCAs)等十種疾病(1,2) 。這些病症中受影響的大腦區域和神經元各有不同，但都有類似的致病機制。多麩醯胺酸疾病是由於相關基因都帶有 CAG 三個核苷酸的異常擴增，導致轉譯後的蛋白質中有一段過度擴增的麩醯胺酸區域，而這種突變的蛋白質在神經細胞中具有毒性，會影響神經細胞的正常運作，進一步造神經系統的功能的缺陷(3)。多麩醯胺酸疾病中，突變的蛋白質會對細胞帶有毒性主要是因為不正常擴增的麩醯胺酸區域會導致蛋白質的聚集，這些累積的蛋白質形成不可溶物產生毒性(4)。以亨丁頓氏症為例，致病蛋白—亨丁頓蛋白(Huntingtin, htt)的N端含有不正常擴增的麩醯胺酸片段，經過代謝後會切割出不正常擴增的麩醯胺酸片段(5)，這些片段形成錯誤摺疊(misfolding)，並逐漸由單體聯結成單聚體(oligomers)，單聚體繼續. 5.

(8) 堆積產生包涵體(inclusion body)(6,7)。過去研究顯示，多麩醯胺酸片段的單聚體結構可能是最具毒性的形式(8)，它可能會導致各方面的影響造成毒性，包含：轉錄功能失調(transcriptional dysregulation)、粒腺體功能障礙(mitochondrial dysfunction)和蛋白毒性壓力(proteotoxic stress)(4,9)。. 1. 轉錄功能失調一般的亨丁頓蛋白主要是位於細胞質中，但突變的亨丁頓蛋白被會移位至細胞核內(10)。一些轉錄因子會擁有多麩醯胺酸的功能區域，協助和相關蛋白交互作用結合到DNA上，例如specificity protein 1 (Sp1)。Sp1會透過本身的多麩醯胺酸結合區域與transcription factor II D (TFIID)結合執行轉錄(11)。當突變的亨丁頓蛋白進入細胞核時，會與Sp1麩醯胺酸聚集區(glutamine-rich)結合，從而影響Sp1與TFIID的交互作用，導致Sp1的功能受損(12)。Sp1的功能受到抑制會讓它所負責轉錄的基因表現下降，如多巴胺D2受體(dopamine D2 receptor)和神經生長因子受體(nerve growth factor receptor)(13)。另外，轉錄因子CREB (cAMP response element binding)的相關基因在HD模式的研究中也被發現表現量下降。轉錄因子CREB會與CBP (CREB binding protein)結合進行轉錄作用(14)，而CBP包括一段18個麩醯胺酸的區域。在小鼠 6.

(9) 模式研究中發現，亨丁頓蛋白的擴增麩醯胺酸片段也會與CBP結合成包涵體，影響CBP相關的轉錄功能，而過度表現CBP可以降低突變亨丁頓蛋白所誘導的細胞凋亡(15)。. 2. 粒腺體功能障礙粒腺體是維持神經細胞存活的重要胞器，它提供細胞能量和維持細胞膜的膜電位，也具有神經傳遞物質的釋放和回收等重要功能 (9)。在亨丁頓氏症患者和亨丁頓氏症模式小鼠中都可以觀察到粒腺體的數目、大小和形態都會產生變化(16,17)。在細胞模式中，過度表現突變的亨丁頓蛋白會讓粒腺體片段化，ATP濃度下降並且誘導 caspase-3活化(18)。粒腺體的片段化,可能由於粒腺體分裂相關蛋白 DRP1 (dynamin-related protein-1)被過度活化有關，在亨丁頓氏症患者大腦中發現突變的亨丁頓蛋白與DRP1共定位(colocalization)並讓 DRP1活化(16)。而表現沒活性DRP1的蛋白時，可以改善粒腺體片段化的情況,並且減少突變亨丁頓蛋白堆積引起的細胞凋亡(16)。. 3. 蛋白毒性壓力蛋白質的品質控制與神經退化性疾病有很大關聯。大多數的神經退化性疾病都與蛋白質的錯誤摺疊有關(19,20)。在細胞模式中，突變 7.

(10) 的亨丁頓蛋白所形成的包涵體會使蛋白酶體(proteasome)受損(21)。另外，蛋白質累積也會影響蛋白質的品質控制的相關蛋白，如伴護蛋白 (chaperone)的功能受到抑制之後會影響細胞對壓力的應變能力(22)。. 二、治療策略由於多麩醯胺酸疾病的相關突變蛋白會對細胞形成多方面的影響，因此目前對多麩醯胺酸疾病的治療策略主要分為：1.回復突變蛋白對細胞做成的生理功能損害。2.改變突變蛋白的表現和結構以減少對細胞造成的影響(4)。. 1. 回復突變蛋白做成的功能損害針對轉錄功能失調方面，由於突變蛋白會影響部份轉錄因子的功能，減少相關基因的表現，所以目前研究透過抑制與減少基因表現有關的 HDAC (histone deacetylase)，能回復受突變蛋白影響基因的表現 (23-25)。而粒腺體功能障礙方面，則透過增加表現促進粒腺體融合的蛋白 Mfn2 (Mitofusin 2)，可以減少粒腺體的片段化，改善粒腺體的功能(26)。. 2. 針對突變蛋白作調控基因療法是最直接的治療方法，利用 siRNA 專一性減少突變基因 8.

(11) 的表現，從而減少突變蛋白的產生。目前已經有研究在小鼠模式中利用 siRNA 治療多麩醯胺酸疾病(27,28)。由於多麩醯胺酸疾病的致病原因主要是突變蛋白的錯誤摺疊所引起的，所以針對改變突變蛋白的結構，阻止錯誤的摺疊的產生是另一個治療方向(29)。在果蠅模式上，轉入亨丁頓蛋白結合胜肽(htt-binding peptide)，可以抑制突變蛋白的聚集而減少毒性(30)。. 三、細胞自噬 (autophagy) 加強細胞對錯誤摺疊的致病蛋白進行降解方面，在細胞、果蠅和小鼠模式的研究中，增加細胞自噬的能力可以減少突變蛋白的數量，達到保護細胞的效果(31-33)。細胞自噬是一個由酵母菌至哺乳類都被發現的保守路徑，其功能是利用溶酶體(lysosome)降解細胞內的蛋白質複合物和老舊胞器 (34)。細胞自噬目前主要分為三種形式，分別為微自噬 (microautophagy)、伴護蛋白介導的自噬(chaperone-mediated autophagy) 和巨自噬(macroautophagy)(35)。一般對於巨自噬了解較多，下文簡稱為細胞自噬。. 四、細胞自噬的機制在酵母菌的研究中，發現約 30 個 Atg (autophagy-related gene)基 9.

(12) 因與細胞自噬有關，其中大部分都在哺乳類中找到同源基因(36)。這些基因參與細胞自噬的三個階段：開始形成自噬體(autophagosome)；接下來自噬體的膜延長形成完整自噬體；最後自噬體與溶酶體融合進行降解(37)。. 1. 起始階段細胞自噬開始的機制自今仍未明確，目前研究認為內質網、高爾基體和線粒體都可能參與形成自噬前體(phagophores)(37)。第三型 PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)-VPS34 是調控自噬前體形成的關鍵蛋白之一，抑制 VPS34 會阻斷細胞自噬(38)。VPS34 功能是形成 PI-3-P (phosphatidylinositol-3-phosphate)，而 PI-3-P 會吸引其他相關蛋白結合形成自噬前體(39)。Beclin 1 亦參與自噬前體的形成，Bcl-2 會與 Beclin 1 結合抑制 Beclin 1 釋放(40)。當細胞開始細胞自噬時，JNK1 (c-Jun N-terminal protein kinase 1)會磷酸化 Bcl-2，釋放 Beclin 1 形成自噬前體(41)。另外，ULK1 (unc-51-like kinase 1)也被發現會與 FIP200 (FAK family-interacting protein of 200 kDa)和 Atg13 形成複合物參與形成自噬前體(42)。. 2. 延長階段自噬前體的延長需要兩個類泛素反應(ubiquitin-like reactions)。在 10.

(13) 第一個反應中，Atg12 透過異肽鍵(isopeptide bond)和 Atg5 結合與 Atg7 (E1-like enzyme)和 Atg10 (E2-like enzyme)反應(43-45)，進一步跟 Atg16L 形成一個約 800 kDa 的複合物(46,47)。Atg12-Atg5-Atg16L 複合物會結合到自噬前體，協助膜的延長，當完整的自噬體形成後會離開。另外，MAP1-LC3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 會結合 PE (phosphatidylethanolamine)，Atg4B 會裂解 MAP1-LC3 的 C 端的甘胺酸(glycine)，形成 LC3-I (48)。其次，Atg7 會與 LC3-I 結合形成中間產物(45)。最後 LC3-I 上的活性位置半胱胺酸(cysteine)會轉到 E2-like enzyme Atg3 形成 LC3-II。LC3-II 接合在自噬前體的外膜上協助膜的延長(49)。與 Atg12-Atg5-Atg16L 複合物不同的是，完整的自噬體形成後 LC3-II 仍會結合在膜上直至自噬體與溶酶體融合後才被 Atg4B 裂解回收(50)。前人研究指出，LC3-II 的多寡與細胞中自噬體的數量有關，它的消長可以作為細胞自噬的標記(51)。自噬前體延長包裹蛋白質複合物形成自噬體的過程中，p62 (SQSTM1)參與協助蛋白質複合物與自噬前體結合(52)。p62 是 LC3 相關蛋白，功能是結合蛋白質複合物上的泛素標記(ubiquitin)後，進一步與自噬前體膜上的 LC3 結合，協助自噬前體包裹蛋白質複合物，進一步在成熟階段時一同被溶酶體降解(53)。. 11.

(14) 3. 成熟階段在細胞自噬的最後階段，溶酶體會與自噬體融合形成自噬溶酶體 (autolysosomes)。完整的自噬體形成後，自噬體會利用 dynein-dynactin complex 沿微管(microtubules)移動至溶酶體周圍(54,55)，在 soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptors (SNAREs) 協助下與溶酶體融合，溶酶體內的水解酵素會水解自噬體內的內容物。溶酶體的功能與細胞自噬相關，抗生素 Bafilomycin A1 (Baf A1) 會抑制溶酶體的酸化，阻止溶酶體的水解。文獻指出，Baf A1 同時會抑制溶酶體與自噬體的融合(56)。. 五、細胞自噬的調控機制細胞自噬在細胞中受多個路徑所調控，其中絲胺酸—蘇胺酸激酶 (serine–threonine kinase) mTOR 扮演主要的負調控角色，其功能是阻斷 ULK1 complex 的活性去抑制細胞自噬的起始(57)。而 mTOR 的活性則受到上游多個訊號的影響，營養物的缺乏、生長因子減少或 ATP 濃度下降等都會抑制 mTOR 的活性，促進細胞自噬(58)。另外，PLC-ε 介導產生的 IP3 會引起內質網內的鈣離子釋放至細胞質，會活化 calpain 的活性，calpains 會降解 Atg5，讓細胞自噬被抑制(59)。. 12.

(15) 六、透過細胞自噬清除多麩醯胺酸蛋白堆積的優點在真核細胞中，清除錯誤摺疊蛋白質的機制除了前文所述的細胞自噬外，還有另一個降解系統—UPS (ubiquitin proteasome system)參與。與細胞自噬不同，UPS主要負責降解小分子可溶性蛋白質。此系統主要透過一個由76個胺基酸組成的多肽—ubiquitin，經過三個不同的酵素作用後在需降解蛋白上連接上一條polyubiquitin長鏈作為標記，再運送到蛋白酶體中水解(60)。前人研究指出，多麩醯胺酸蛋白無法透過蛋白酶體完全水解，經蛋白酶體作用後，仍會釋放出具多麩醯胺酸的蛋白片段(61,62)。因此細胞自噬被認為是目前較有效清除多麩醯胺酸蛋白堆積的機制。. 13.

(16) 貳、研究背景一、利用細胞自噬治療多麩醯胺酸疾病的優點前文提及有關多麩醯胺酸疾病的治療策略中，回復突變蛋白對細胞做成的功能損害的方式，缺點是只能針對單一病症作治療，延長細胞的生存時間，難以解決突變蛋白對細胞帶來的多方面影響。而基因治療方面，siRNA 的作用範圍較小，對治療如脊髓小腦萎縮症等影響範圍較大的神經退化疾病效果有限(4)。細胞自噬是細胞消除蛋白複合物的機制，能降解大分子蛋白堆積物。因此，本研究認為可以透過促進細胞自噬清除突變蛋白，從而減少突變蛋白對細胞的毒性，目前最有潛力對多麩醯胺酸相關疾病的治療方向。. 二、透過誘導細胞自噬清除多麩醯胺酸蛋白堆積在前人研究中，已經發現約三十多個物質能透過誘導細胞自噬，這種方式不但可以增加清除多麩醯胺酸蛋白堆積，並且保護細胞，維持細胞的存活(37)。這些誘導細胞自噬的機制可分為 mTOR 相關路徑和 mTOR 不相關路經兩類。Rapamycin 是 mTOR 路徑的抑制劑，它能通過抑制 mTOR 的活性以誘導細胞自噬。過去在體內和體外實驗中，Rapamycin 都能清除堆積的多麩醯胺酸蛋白，達到細胞保護的效果(31,32)。雖然已經有多個證據證實 Rapamycin 可以達到治療效果， 14.

(17) 但使用在人體身上仍有需要克服的問題，例如毒性的克服。mTOR 路徑是細胞中參與核糖體生合成以及調控蛋白質轉譯的重要訊息傳遞路經，抑制 mTOR 路徑可能會影響傷口癒合和抑制免疫反應等不良影響(63)。而 mTOR 不相關路經方面，海藻醣(trehalose)在亨丁頓氏症的細胞模式中，可促進細胞自噬，協助清除亨丁頓蛋白堆積，但其作用機制仍未確定(64)。. 15.

(18) 參、研究目標一、利用具致病基因的細胞平台篩選未知化學分子，尋找能誘導細胞自噬的小分子化合物利用實驗室已建立的轉殖並表達致病的polyQ-EGFP基因的神經瘤母細胞株作為平台，以此可以篩選一些新的小分子化合物。實驗設計於細胞培養液中加入藥物，再藉由溶酶體的染色與觀察確認藥物是否能誘導細胞自噬，讓溶酶體增加。. 二、檢查所篩選出的化合物是否能降低細胞中polyQ-EGFP疾病蛋白的堆積及有效反應濃度觀察藥物能否有效地清除疾病蛋白的堆積，幫助增加細胞存活率，而且不影響細胞活性，期望保護細胞。同時觀察是否有其他助於減輕多麩醯胺酸疾病相關的現象，例如: polyQ-EGFP堆積移出細胞核。將藥物稀釋不同濃度後，處理細胞，觀察確認藥物在什麼濃度可以誘導細胞自噬和降解polyQ-EGFP疾病蛋白的堆積。. 三、確認藥物是否透過誘導細胞自噬去減少polyQ-EGFP疾病蛋白的堆積及分子機制利用細胞自噬抑制劑3-methyladenine (3-MA)處理細胞後，再進行 16.

(19) 藥物處理後觀察藥物清除polyQ-EGFP堆積的效果是否因細胞自噬被抑制而下降。這可以確認藥物的清除效果是由誘導細胞自噬所產生的。另外，利用西方轉漬法檢查polyQ-EGFP疾病蛋白和細胞自噬相關路徑的蛋白質表現變化，進一步了解藥物的清除效果和影響細胞自噬的方式。. 17.

(20) 肆、研究材料與方法一、培養基與藥物 1. 培養基使用 DMEM (Dulbecco’s Modifid Eagle’s Medium) (GIBCO BRL, Grand Island, NY)，調整 pH 值至 7.4。混合 10 %或 2 %胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) (GIBCO BRL, Grand Island, NY)作為細胞培養液。. 2. 小分子化學藥劑將來自實驗室合成的新穎化學物，DMSO (dimethyl sulfoxide) (SIGMA, St.Louis, MO)溶解，配置成 10 mM，避光保存於 4 ℃。代號為 Compound A ~ Compound I，共 9 種。. 二、實驗方法 1. 表現不同長度多麩醯胺酸基因的人類神經瘤母細胞株培養 A. 細胞培養人類神經瘤母細胞株(SK-N-SH)來自於 American Type Tissue Collection (Rockville, MD)。本實驗室已建立將不同重複 CAG 序列的 tet: polyQ-EGFP 基因轉殖到人類神經瘤母細胞的穩定表現細胞株。該基因表現系統在培養液中含有 20 g/mL doxycycline 18.

(21) (doxycycline hydrochloride)才會表現。細胞培養在含有 10 % FBS 的 DMEM 培養液中，並處於維持恆定 5 % CO2、37℃的條件的細胞培養箱中。. B. 細胞計數利用 PBS (phosphate-buffered saline)清洗細胞後用胰蛋白酶 -EDTA (0.25% trypsin/EDTA)處理後再以培養液將作用後的細胞沖洗下來，並將沖洗下來的細胞液移到 15 mL 離心管中，以 800 rpm 離心 5 min 後，去除掉上清液，再以 1 mL 培養液將沉澱的細胞沖散混勻，接著取 10 μL 的細胞液適當稀釋後，再與 Trypan blue 1:1 混勻後取 10 μL 放入血球計數器，計算出細胞總數。. C. 細胞冷凍利用 PBS 清洗細胞培養皿後用胰蛋白酶-EDTA 處理，再以培養液將作用後的細胞沖洗下來，經離心後去除上清液，並加入抗凍劑 DMSO 與細胞培養液以 1:9 的比例配置，混勻後放入冷凍小管，接著放入漸凍盒內置於 -80℃冰箱一天後，儲存到液態氮桶中保存。. 19.

(22) D. 誘導轉殖基因表現並形成不同程度的蛋白累積物將轉殖基因的細胞計數後種在培養皿中，以含有 2% FBS 的 DMEM 培養液培養 24 小時後，以 PBS 清洗加入含 20 g/mL doxycycline 和 2% FBS 的 DMEM 培養液，培養四天誘導轉殖基因表現並形成蛋白累積物。. E. 藥物處理誘導四天細胞，用 PBS 清洗，並加入含有 2% FBS 的 DMEM 培養液培養和加入待測試的藥物，處理 48 小時後進行後續實驗。. 2. 利用 LysoTracker 染劑篩選能誘導細胞自噬的藥物 A. 利用流式細胞儀偵測分析染劑強度藥物處理後的細胞，移除培養液並用PBS清洗後加入含有2% FBS的DMEM培養液和1:20,000稀釋LysoTracker染劑(LysoTracker Red DND-99)。染色20 min後移除培養液，用胰蛋白酶-EDTA處理 5 min，用PBS沖洗收集細胞樣本。利用流式細胞儀偵測細胞樣本，收集10,000個細胞樣本，利用程式分析(CellQuest Pro)可得到螢光強度的平均值。. 20.

(23) 3. 顯微鏡照相 A. 活細胞顯微鏡照相藥物處理後，移除培養液並用 PBS 清洗後，加入含有 2 % FBS、 1:20,000 稀釋 LysoTracker 和 1:20,000 稀釋細胞核染劑 Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 trihydrochloride)的 DMEM 培養液染色 20 min，再使用 PBS 清洗後加入適當的 PBS 做顯微觀察。. B. 共軛焦顯微照相用 95 %酒精浸泡的蓋玻片並過火將酒精蒸發，接著放入培養皿中。在玻片上加上計數後的懸浮細胞液細胞，使細胞貼覆於蓋玻片上生長，接著如同誘導轉殖基因表現和藥物處理的處理步驟，最後將蓋玻片取出，以 4 %的甲醛溶液固定 30 min，接著用 PBS 洗去甲醛並加入初級抗體作用 1 天；接繼用 PBS 洗去初級抗體並加入次級抗體作用一天；最後用 PBS 洗去次級抗體，在上頭滴上 mounting buffer，快速的將蓋玻片貼附細胞的一面向下，讓 mounting buffer 均勻覆蓋；保存在閉光下以雷射共軛焦顯微鏡觀察。. 21.

(24) 4. 蛋白質萃取與定量 A. 蛋白質萃取將藥物處理後的細胞樣品，移除培養液後使用 PBS 清洗一次，加入適量的 RIPA buffer ( 20mM Tris-HCL(pH 7.5), 1mM Na2EDTA, 1% sodium deoxycholate, 2.5mM sodium pyrophosphate, 1mM Na3VO4, 1 g/mL leupeptin )，充分覆蓋後放入 4℃冰箱中 5 min。以細胞刮勺(scraper)刮起細胞與蛋白，並將含有細胞與蛋白的 RIPA buffer 放入 eppendorf，以 13,000 rpm 離心 30 min。再將上清液取出移入另一個新的 eppendorf 中，接著保存於-20℃冰箱中存放，待後續的蛋白質定量實驗。. B. 核蛋白質萃取將藥物處理後的細胞樣品，移除培養液後使用 PBS 清洗一次，加入適量的細胞質萃取緩衝液 ( 10 mM HEPES, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 0.075% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF)，以細胞刮勺刮起細胞與蛋白，並將含有細胞與蛋白的萃取緩衝液放入 eppendorf，以 2,000 rpm 離心 10 min。收集上清液置於新的 eppendorf，沉澱物另加入適量的細胞核萃取緩衝液 ( 20 mM Tris-HCl, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 25 % glycerol)，與沉澱物混合均勻，置於冰上 30 min。以 13,000 rpm 離心 20 min。取上清液置於新的 eppendorf。保存於-20 22.

(25) ℃冰箱中存放，待後續的蛋白質定量實驗。. C. 蛋白質定量利用 Bradford 的原理，於 96-well plate 中各孔加入 300l Coomassie Blue (Bio-Rad protein assy, Coomassie® Brilliant Blue G-250 dye)。接著取出保存於-20℃冰箱的蛋白樣品取出回融，並使用已知的濃度的標準訂量品，蛋白質牛血清蛋白 BSA (Bovine Serum Albumin)回融後做為標準蛋白質，並將 BSA 分別以 PBS 倍率稀釋配置 1,000、500、250、125、62.5 g/mL 等不同濃度的標準蛋白質定量品。接著將標準蛋白質定量品以 4 L，而實驗蛋白質樣品以 1 L 加入 Coomassie Blue。充分混勻後避光反應 10 min，以連續性波長酵素免疫分析儀 (μQuant) 測量，用 OD595 的吸光值。再以標準蛋白質定量品的吸光值製作出標準曲線，後換算樣品的蛋白質濃度，分別便可以取樣 5 g 至 30 g 的蛋白質接續著做實驗。. 23.

(26) 5. 十二烷基硫酸鈉—聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE) Separating gel ddH2O 1.5M Tris-HCL 30% acrylamide (1:29) 10%SDS 10%APS TEMED. 12 % 2.69 mL 2.00 mL 3.20 mL 80 L 50 L 9 L. Stacking gel ddH2O 1.5M Tris-HCL 30% acrylamide (1:29) 10%SDS 10%APS TEMED. 5% 1.17 mL 500 L 333 L 20 L 20 L 3 L. A. 膠體的製備使用 CBS 系統膠體製備裝置，依成份表配置 12 %的分離膠 (separating gel)置入 CBS 系統膠體製備裝置中，並在上層加入異丙醇(isopropanol) 使分離膠表層平整。在分離膠凝固後將上層的異丙醇移除並吸乾，接著依成分表配置 5 %的聚集膠(stacking gel)，並將它置入膠體製備裝置中的上層後插入齒梳(comb)。等待膠體完全凝固，將電泳緩衝液(running buffer)加入直立式電泳槽，後將膠體組裝至電泳槽並避免氣泡殘留底部，再將電泳緩衝液蓋過齒梳接著把齒梳拔除便完成膠體製作。. B. 蛋白質樣品制備與置入將 20 ~ 25 g 的蛋白樣品，取一定量與 3× 的 sample buffer ( 350 mM Tris-HCL, pH 6.8, 12 % SDS, 0.02 % bromophenol bule, 35 % glycerol, 30 % -mercaptoethanol )均勻混和。接著利用乾浴槽 24.

(27) 以 95℃加熱 5 min；然後將樣品逐一置入分離膠中的 well 裡，並加入蛋白質分子量的標記蛋白(prestained molecular weight markers, Infinigen EZColor II TM ,IN1125)。. C. 膠體電泳利用電源線將電源供應器與直立式電泳槽連接，將負極電源線(黑色)接至上方，正極電源線(紅色)接至下方，以電流方向負到正向下電泳，先以 30 V 的電壓 20-30 min 使蛋白樣品聚集在聚集膠底部，再以 120 V 的電壓 60 min 進行分離膠的電泳，進行分離後，即完成電泳。. 6. 西方轉漬法 A. 轉漬準備準備兩張大小為 8 cm × 10 cm 濾紙，以及與膠體大小相似的聚二氟乙烯膜(PVDF)或硝化纖維膜(nitrocellulose membrane, NC membrane)，其中 PVDF 須以 100 %的甲醇於室溫下浸潤活化不超過 20 min，濾紙與海綿再轉漬前須先以 transfer buffer 浸潤後再進行轉漬。. 25.

(28) B. 裝置轉漬槽(transfer unit)與轉漬取出 SDS-PAGE 後將多餘膠體切除後，從轉漬板夾(transfer pads)負極端，依序疊上海綿、濾紙 1 張、膠體、代轉漬的膜、濾紙 1 張、海綿。將轉漬板夾夾緊組成轉漬三明治(transfer sandwich)。將轉漬三明治放入轉漬槽(HOEFER; Amersham Pharmacia)後裝填八分滿的轉漬緩衝液(blotting buffer)進行轉漬，以 80 V 的固定電壓轉漬 50 min，轉漬完畢後便可以利用冷光儀 (LAS3000, Fuji Film)中的 GFP 螢光影像呈像。. C. Blocking 與免疫轉漬(immunoblot) 使用 PBS-T (含 0.05 % Tween-20 的 PBS )搖晃清洗 5 min 後以 5 %的 blocking buffer (5 % skim milk 的 PBS-T)浸泡轉漬後的轉漬膜，用來蓋掉轉漬膜上非專一性的空白區域，在室溫下搖晃浸泡 1 小時，接著利用 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 5 min，之後加入適當稀釋倍率的一級抗體(primary antibody)，依需求短時間放在室溫下 1 到 4 小時不等，長時間放入 4℃冰箱中 16 小時至 3 天不等。一級抗體反應後，利用 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 5 min，接續加入以 1:3,000 稀釋的二級抗體(secondary antibody) 室溫下反應 1 小時。再以 PBS-T 搖晃清洗 3 次，每次 5 min 後加入 ECL (ECL™ 26.

(29) Western Blotting Detection Reagents)，均勻覆蓋在轉漬膜上，再以冷光儀(LAS3000, Fuji Film)中的可見光與冷光影像呈像。. D. Stripping 呈像後的轉漬膜會以 stripping buffer (0.78 mL β-mercaptoethanol, 20 mL 10%SDS, 12.5 mL 0.5 M Tris-HCl, 加水至 100 mL)清除抗體，於 57℃下作用 15 min。之後便可以重新進行 Blocking 、免疫轉漬與呈像。 7.. Dot Blot 組裝 96 孔免疫轉漬器，把轉漬膜放在轉漬器中間，再鎖上固. 定。將 20 ~ 25 g 的蛋白樣品，與 100 L PBS 混合。混合後樣品置入轉漬器中，利用真空幫浦把樣品吸引通過轉漬膜。只有不可溶蛋白質會留在膜上，而可溶性蛋白會穿透轉漬膜。取出轉漬膜後參考前文西方轉漬法中 Blocking 與免疫轉漬方法進行轉漬和呈像。. 8.. 細胞存活率分析藥物處理後的細胞，移除培養液並用 PBS 清洗後用胰蛋白酶. -EDTA 處理 5 min，用 PBS 沖洗收集細胞樣本。以 15 % 酒精處理 30 min 作為控制組。加入 0.5 ng/ml PI 染劑染色利用流式細胞 27.

(30) 儀偵測細胞樣本，收集 10,000 個細胞樣本，利用程式分析 (CellQuest Pro)螢光強度的分佈比值。. 28.

(31) 伍、結果一、鑑定脂溶性的化合物可以增加細胞自噬將各式小分子的化合物溶入脂溶性介質 DMSO 中。將這些藥物利用神經瘤母細胞含有致病的不同長度 polyQ-EGFP 基因轉殖，並藉由 doxycycline 誘導表達後的細胞平台進行篩選。以溶酶體染劑 LysoTracker 作為篩選的指標。使用誘導四天的 Q79 細胞株，以 5、 10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時，可藉由流式細胞儀鑑定能使 LysoTracker 螢光量提高的藥物，Compound A 為本實驗室先前篩選出能隨藥品濃度使 LysoTracker 螢光量提高的藥物，作為正控制組。實驗結果顯示代號為 Compound B 的藥品會隨其濃度增加，讓 LysoTracker 螢光量上升(Fig. 1)。再利用不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株作進一步確記。由實驗結果中顯示在不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株中隨 Compound B 濃度增加，LysoTracker 螢光量會有不同程度提升，這可以自流式細胞儀分析結果中產生螢光強度曲線不同程度右移看出來(Fig. 2A)，實驗利用螢光量進行統計，以 20 μM Compound B 處理 48 小時後，Q36 的螢光強度增加 64 %、Q61 增加兩倍而 Q79 增加 1.4 倍，相較於控制組都達到顯著差異(Fig. 2B)。. 29.

(32) 二、經過藥物處理 48 小時可以有效清除堆積的多麩醯胺酸利用達到致病重複次數的 Q79 細胞株誘導四天後，使其表現 79Q-EGFP，並可以藉由 EGFP 所釋放的螢光看到堆積物。以 5、10 和 20 μM 處理實驗藥物 48 小時後，再利用螢光顯微鏡觀察，並計算每 500 個有 79Q-EGFP 表現的細胞中具有堆積物細胞的數目，以 DMSO 的控制組為基準，觀察加藥組的堆積物比例是否有變化，另以 Compound A 為正控制組。實驗顯示隨 Compound A 和 Compound B 濃度增加，帶有堆積物的細胞的數量都有明顯降低(Fig. 3A)。在三次獨立實驗的統計中，Compound A 於 20 μM 可減少一半帶有堆積物的細胞的數量，而 Compound B 於 10 μM 可減少一半帶有堆積(Fig. 3B)。. 三、藥物透過促進細胞自噬去降解 polyQ-EGFP 的堆積物為證明 79Q-EGFP 的堆積物的減少是因為藥物促進細胞自噬所造成。實驗利用 doxycycline 誘導四天的 Q79 細胞株，先以細胞自噬抑制劑—3-MA 或 Baf A1 處理 24 小時後，更換培養基，再分別以 5、 10 和 20 μM 處理藥物 48 小時後，利用螢光顯微鏡觀察並比較藥物處理和在有及缺乏抑制劑預處理的差異。實驗顯示抑制劑處理後藥物處理組中，以 3-MA 和 Baf A1 預處理都能使藥物所誘導生成細胞自噬下降，帶有 79Q-EGFP 堆積物的細胞的數量上升(Fig. 4A)。表示藥物 30.

(33) 透過誘導細胞自噬而達到減少 79Q-EGFP 的堆積物的效果。在三次獨立實驗的統計也顯示，與藥物處理組比較，預處理 3-MA 帶有堆積物的細胞的數量增加兩倍，預處理 Baf A1 帶有堆積物的細胞的數量增加 2.3 倍(Fig. 4B)。. 四、由分子層次證實藥物的功能為進一步地去了解藥物的清除堆積物的效果和作用機制。利用西方轉漬法檢查 polyQ-EGFP 的堆積物和細胞自噬路徑中相關蛋白的表現。由於 polyQ-EGFP 累積時會產生不同大小的堆積物，因此在蛋白質電泳時會被分離，可觀察到 polyQ-EGFP 單體和一系列不同分子量的堆積物。利用表現不同長度的 Q36、Q61 和 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後萃取細胞蛋白質。實驗結果顯示，隨 Compound B 濃度上升，Q61 和 Q79 細胞株的高分子堆積物會有下降。在 20 μM 處理下 Q61 的高分子堆積物下降 40 % 而 Q79 的高分子堆積物下降 30 %，而 Q36 沒有形成明顯的高分子堆積物 (Fig. 5A)。而 polyQ-EGFP 單體隨 Compound B 濃度上升而增加，在 10 μM 處理下 Q36 增加 10 %，Q61 增加 30 %而 Q79 增加 20% (Fig. 5A)。另外，利用 Dot Blot 確認高分子堆積物的清除，Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後萃取 31.

(34) 細胞蛋白質。實驗結果顯示，隨 Compound B 濃度上升，Q79 細胞株的高分子堆積物會有下降。在 20 μM 處理下，Q79 的高分子堆積物下降 60 %(Fig. 5B)。細胞自噬的路徑方面，西方轉漬法的結果可發現在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株中，細胞自噬相關蛋白 Beclin 1 和 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例都有增加，而 p62 隨著減少；在 20 μM 處理下， Q36 的 Beclin 1 表現量增加 20 %、Q61 增加 40 %而 Q79 增加 60 %； Q36 的 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例(LC3-II/LC3-I)增加兩倍、Q61 增加 30 %而 Q79 增加 2.3 倍；Q36 的 p62 表現量減少 30 %、Q61 減少 50 %而 Q79 減少 60 % (Fig. 6)。此外，為確定細胞自噬抑制劑能抑制 Compound B 的藥效，進一步證明 Compound B 是誘過促進細胞自噬去清除 polyQ-EGFP 的堆積物。將 Q79 細胞株誘導四天後，處理 20μM 濃度的細胞自噬抑制劑 3-MA 24 小時，再以 20 μM Compound B 處理 48 小時後萃取細胞蛋白質。由西方轉漬法的結果，將控制組和抑制劑組作比較，可以發現 Beclin 1 下降 10 %和 LC3 轉換率下降 30 %，而高分子 79Q-EGFP 的堆積不會被清除，顯示 3-MA 可以抑制細胞自噬的進行(Fig. 7)。而比較加藥組和抑制劑預處理組，結果顯示 3-MA 讓細胞自噬和清除 79Q-EGFP 的堆積物的能力均受抑制，處理 20 μM Compound B 後高分子 79Q-EGFP 的堆積下降 30 %而預處理 3-MA 後高分子 79Q-EGFP 的堆積上升 40 % (Fig. 7)。這結果提供了更多的證 32.

(35) 據，顯示 Compound B 是藉由促進細胞自噬去清除 polyQ-EGFP 的堆積物。. 五、更多促進細胞自噬的證據為更確定藥物促進完整的細胞自噬路徑，可以利用共軛焦顯微照相觀察細胞自噬相關現象。實驗利用誘導四天的 Q79 細胞株，以 5、 10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後利用免疫螢光標記 LC3 後在共軛焦顯微照相觀察。顯示 LC3 聚集形成自噬體會隨藥物濃度而上升(Fig. 8)。自噬體與溶酶體融合是降解堆積物的重要步驟，為了解 Compound B 是否能促進兩者融合，將帶有綠色螢光標記的 LC3 重組基因(GFP-LC3)轉殖 SK-N-SH 細胞株後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時。接著用 LysoTracker 染色後於共軛焦顯微照相觀察。發現隨藥物濃度增加，可以看到更多 LC3 聚集體與溶酶體共定位(colocalization) (Fig. 9)。這些結果顯示 Compound B 能促進自噬體形成並與溶酶體結合進行降解，更進一步確定 Compound B 是利用細胞自噬清除 polyQ-EGFP 的堆積。. 六、藥物不會影響細胞的存活率為了了解藥物是否影響細胞的存活。本研究進行細胞存活率的實 33.

(36) 驗。利用 Q36、Q61 和 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後，收集細胞進行 PI 染色並利用流式細胞儀偵測，以 15 %酒精處理作為控制組。PI 染劑是一種不能通過完整細胞膜的 DNA 染劑，所以只有細胞膜破壞的死細胞會被染上 PI 染劑。在流式細胞儀分析後，可分離出沒有染上 PI 的活細胞群和染上 PI 的細胞群，利用程式分析(CellQuest Pro)可得到分佈的比值，本研究以沒有染上 PI 的活細胞群的比率作為細胞存活率的指標。由量化圖中可確認 Compound B 在本研究所使用的濃度下都不會影響細胞存活率，而 15 %酒精處理組，Q36 的存活率下降 10 %，Q61 的存活率下降 34.3 %而 Q79 的存活率下降 24.3 % (Fig 10.)。. 七、藥物可以清除細胞核內的 79Q-EGFP 堆積物在螢光顯微鏡觀察 Q79 細胞內 79Q-EGFP 的聚集時，發現細胞核內的 79Q-EGFP 堆積物亦會隨 Compound B 濃度增加而減少。因此利用螢光顯微鏡觀察在藥物處理下 Q79 細胞內 79Q-EGFP 堆積物的分佈並計數。結果顯示 Compound B 處理 48 小時後，細胞質與細胞核中的 79Q-EGFP 堆積物都會隨藥物濃度增加而減少(Fig. 11A)。在三次實驗的統計中，在 20 μM 濃度下，細胞質的堆積物減少 82 %而細胞核的堆積物減少 29 %，都具有顯著差異(Fig. 11B)。為進一步確定藥物清除細胞核內堆積物的能力，利用 Q79 細胞株誘導四天後，以 5、 34.

(37) 10 和 20 μM 不同濃度處理藥物 48 小時後收集細胞，分離並萃取細胞質和細胞核的蛋白質。西方轉漬法的結果顯示細胞質與細胞核的高分子 79Q-EGFP 堆積物都隨藥物濃度增加而減少，79Q-EGFP 單體隨之增加；在 20 μM 濃度下，細胞質的堆積物減少 40 %，細胞核的堆積物減少 80 %；而 10 μM 濃度下，細胞質的 79Q-EGFP 單體增加 30 %，細胞核的 79Q-EGFP 單體增加 80 % (Fig. 12)。. 35.

(38) 陸、討論在多麩醯胺酸疾病中，突變的蛋白質聚集形成不可溶物影響神經細胞的正常運作是其主要的致病機轉(3)。減少這些突變蛋白聚集被認為是具有潛力的治療策略，其中透過誘導細胞自噬去降解突變蛋白聚集被認為是有效的治療方式(4)。因此，本研究利用轉殖不同長度的 polyQ-EGFP 基因的細胞作為篩選平台，在一系列的合成化學物中篩選出能透過增強細胞內消除蛋白複合物的機制—細胞自噬去降解聚集的突變蛋白的藥物。前文提及細胞自噬過程中最後階段自噬體會通過溶酶體融合去代謝內容物，因此細胞中溶酶體的數量可以用來表示細胞自噬的活性。而 LysoTracker 是一種標定紅色螢光的鹼性胺基酸，會自然的堆積在細胞內酸性區域也就是溶酶體(65)。所以本研究利用 LysoTracker 的螢光強度增加作為篩選藥物的指標。在 Q79 細胞株中利用 LysoTracker 篩選一系列的合成化學物後，發現 Compound B 能隨濃度提高 LysoTracker 螢光量。與本實驗室先前篩選出能細胞自噬清除多麩醯胺酸蛋白堆積的藥物 Compound A 有相似趨勢(Fig 1.)。這表示 Compound B 有可能具有促進細胞自噬的能力，接著在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株利用 Compound B 處理細胞 48 小時後，Compound B 在各細胞株中都能隨濃度使 LysoTracker 螢光量增加(64 % ~ 兩倍)，並在 36.

(39) 三次獨立實驗中統計中具顯著差異(Fig 2B.)。這顯示 Compound B 具有發展潛力，因此進行後續實驗測試是否具有清除多麩醯胺酸蛋白堆積的效力。在細胞存活實驗中 Compound B 在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株都不會影響細胞存活率(Fig 10.)，表示 Compound B 不影響細胞存活。本研究使用的細胞株表現具有螢光標記的致病蛋白，所以在螢光顯微鏡下可觀察到致病蛋白的位置和是否形成聚集。文獻指出可透過計算一定量細胞中，帶有致病蛋白聚集的細胞數作為評估蛋白聚集是否減少的方法(66)。因此，本研究利用螢光顯微鏡觀察具有致病蛋白聚集的數量作為藥效測試。實驗顯示 Compound B 於 10 μM 的濃度下，具突變蛋白聚集的細胞數已顯著減少一半，而 Compound A 則於 20 μM 的濃度下，具突變蛋白聚集的細胞數已顯著減少一半， Compound B 有更好的清除效果(Fig 3B.)。因此認為 Compound B 可以進一步研究。在 Dot Blot 的結果中，大分子的 79Q-EGFP 在 Compound B 處理後減少(40 ~ 60 %)。而西方轉漬法的結果中，大分子的 polyQ-EGFP 在 Compound B 處理後減少(30 ~ 40 %)，這與螢光顯微鏡觀察結果吻合，提供了更多 Compound B 能清除突變蛋白堆積物的證據。此外也觀察到 polyQ-EGFP 單體分子上升(10 ~ 30 %)，這可能由於大分子的 polyQ-EGFP 被降解成單體分子所引起的(Fig 5.)。 37.

(40) 為證明 Compound B 的清除能力是由於促進細胞自噬而造成的，利用兩種細胞自噬抑制劑：3-MA 和 Baf A1 進行實驗。3-MA 是一種 PI3K 抑制劑，能抑制第三型 PI3K 的活性去阻斷 PI-3-P 的產生(67)。 PI-3-P 參與形成自噬前體的形成，因此 3-MA 能抑制細胞自噬的發生 (39)。而 Baf A1 是透過抑制溶酶體與自噬體的融合而導致無法降解自噬體的內容物抑制細胞自噬的完成。若藥物透過促進細胞自噬去降解 polyQ-EGFP 的堆積物，則細胞自噬抑制劑會讓藥物的清除能力會降低。螢光顯微鏡觀察結果顯示，比較有處理細胞自噬抑制劑和沒處理抑制劑的控制組，可以發現 Compound B 清除突變蛋白聚集的能力會被自噬抑制劑所影響，導致聚集的突變蛋白無法清除，帶有蛋白聚集的細胞數增加(兩倍 ~ 2.3 倍)(Fig 4A.)，並在量化統計中具有顯著差異(Fig 4B.)。3-MA 和 Baf A1 都能抑制 Compound B 的清除能力，表示藥物促進細胞自噬的方式可能是促進自噬前體的形成和促進自噬體與溶酶體的融合，在未來仍需要作進一步探討。而西方轉漬法的結果中 Compound B 在 3-MA 抑制下，大分子的 polyQ-EGFP 無法清除，大分子的 polyQ-EGFP 增加 40 %。而 Beclin 1 的上升趨勢同樣受抑制，下降 10 % (Fig 7.)，這些結果均顯示 Compound B 清除蛋白聚集的能力會因細胞自噬受抑制所降低，證明 Compound B 的藥效是由於細胞自噬所透導產生。 38.

(41) 而細胞自噬機制方面，利用共軛焦顯微鏡觀察細胞自噬的相關蛋白 LC3 的聚集是細胞自噬的重要證據。Compound B 在 5、10 和 20 μM 下處理 48 小時後，可以觀察到 LC3 的聚集的情況增加的趨勢(Fig 8.)，而且利用轉殖 GFP-LC3 和 LysoTracker 染色的結果，可以發現標記自噬體的 LC3 聚集點和標記溶酶體的 LysoTracker 有共定位的現象 (Fig 9.)，這表示 Compound B 能促進形成自噬體以及自噬體與溶酶體融合。細胞自噬進行時形成自噬前體相關蛋白 Beclin 1 的表現會上升 (40)，自噬前體的膜延長時 LC3-I 被切割成 LC3-II 導致 LC3-I 轉換成 LC3-II 比率上升(51)，而 p62 會被自噬溶酶體降解而下降(53)。這三個蛋白質的表現量可代表細胞自噬的三個階段。在 Q36、Q61 和 Q79 細胞株處理不同濃度 Compound B 的西方轉漬法的結果中都可以發現相同趨勢：在 20 μM 濃度時，Beclin 1 上升 20 ~ 60 %(Fig 6.)，LC3-I 轉換成 LC3-II 比率(LC3-II/LC3-I)上升 30 %~ 2.3 倍，p62 減少 30 ~ 60 %，以上實驗結果提供了更進一步的證據來證實 Compound B 能促進細胞自噬進行。另外，Beclin 1 的表現上升顯示藥物促進細胞自噬的調控點是在起始階段之前，這表示 Compound B 的促進效果有可能是透過影響更上遊的調控路徑。前人研究指出，突變多麩醯胺片段會進入細胞核內聚集形成包涵體，影響轉錄功能(10)。而細胞自噬只會發生在細胞質中，沒有降解 39.

(42) 細胞核內蛋白的功能。螢光顯微鏡觀察 Compound B 清除致病蛋白聚集的能力時，可以發現細胞核內的蛋白聚集也有顯著下降(Fig. 11B.)，在西方轉漬法的結果也顯示 Compound B 能減少細胞核內高分子的 79Q-EGFP 堆積物，在 20 μM 濃度時減少 80 %(Fig. 12.)。這可能由於 Compound B 清除細胞質中的 79Q-EGFP 因而減少 79Q-EGFP 在細胞核堆積機會。另外，過去文獻指出細胞核運輸蛋白 exportin-1 能協助細胞核內的多麩醯胺片段移送到細胞質(68)，Compound B 有可能同時促進 exportin-1 的功能，這方面在未來需要進一步的探討。綜合本研究的結果，Compound B 是一種在低濃度(5 ~ 20 μM)下即具有促進細胞自噬降解突變的多麩醯胺酸蛋白堆積物的脂溶性化合物，未來可以針對 Compound B 調控細胞自噬的機制作更深入的探討。. 40.

(43) 柒、參考文獻. 1. 2.. Orr, H. T., and Zoghbi, H. Y. (2007) Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci 30, 575-621 Wilburn, B., Rudnicki, D. D., Zhao, J., Weitz, T. M., Cheng, Y., Gu, X., Greiner, E., Park, C. S., Wang, N., Sopher, B. L., La Spada, A. R., Osmand, A., Margolis, R. L., Sun, Y. E., and Yang, X. W. (2011) An antisense CAG repeat transcript at JPH3 locus mediates expanded polyglutamine protein toxicity in. 3.. Huntington's disease-like 2 mice. Neuron 70, 427-440 Cohen-Carmon, D., and Meshorer, E. (2012) Polyglutamine (polyQ) disorders:. 4.. the chromatin connection. Nucleus 3, 433-441 Shao, J., and Diamond, M. I. (2007) Polyglutamine diseases: emerging. 5.. 6.. concepts in pathogenesis and therapy. Human molecular genetics 16 Spec No. 2, R115-123 Wellington, C. L., Ellerby, L. M., Gutekunst, C. A., Rogers, D., Warby, S., Graham, R. K., Loubser, O., van Raamsdonk, J., Singaraja, R., Yang, Y. Z., Gafni, J., Bredesen, D., Hersch, S. M., Leavitt, B. R., Roy, S., Nicholson, D. W., and Hayden, M. R. (2002) Caspase cleavage of mutant huntingtin precedes neurodegeneration in Huntington's disease. J Neurosci 22, 7862-7872 Slow, E. J., Graham, R. K., Osmand, A. P., Devon, R. S., Lu, G., Deng, Y., Pearson, J., Vaid, K., Bissada, N., Wetzel, R., Leavitt, B. R., and Hayden, M. R. (2005) Absence of behavioral abnormalities and neurodegeneration in vivo despite widespread neuronal huntingtin inclusions. Proc Natl Acad Sci U S A. 7.. 102, 11402-11407 Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., and Finkbeiner, S. (2004) Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the. 8.. risk of neuronal death. Nature 431, 805-810 Todd, T. W., and Lim, J. (2013) Aggregation formation in the polyglutamine. 9.. diseases: protection at a cost? Mol Cells 36, 185-194 Kaplan, A., and Stockwell, B. R. (2012) Therapeutic approaches to preventing. 10.. cell death in Huntington disease. Prog Neurobiol 99, 262-280 DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K. O., Davies, S. W., Bates, G. P., Vonsattel, J. P., and Aronin, N. (1997) Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear. 11.. inclusions and dystrophic neurites in brain. Science 277, 1990-1993 Dunah, A. W., Jeong, H., Griffin, A., Kim, Y. M., Standaert, D. G., Hersch, S. M., Mouradian, M. M., Young, A. B., Tanese, N., and Krainc, D. (2002) Sp1 41.

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(50) 捌、圖表. Figure 1. 從一系列化合物中篩選能促進細胞形成自噬溶酶體(autolysosomes)的藥物。利用 Q79 細胞株，以 doxycycline (20 μg/mL)處理四天誘導其 79Q-EGFP 基因表現後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時。隨後使用 LysoTracker 染色並以流式細胞儀偵測螢光強度，Compound A 為正控制組。（螢光強度平均值是由程式(CellQuest Pro)，Y 軸為以 DMSO 為參考的螢光強度相對值，student’s t-test，*P < 0.05，**P < 0.01，n=3）. 48.

(51) (A). (B). Figure 2. Compound B 在不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株中都能促進細胞形成自噬溶酶體。利用 Q36、61 和 79 的細胞株，以 doxycycline 處理四天誘導其 polyQ-EGFP 基因表現後，再以 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物處理 48 小時。隨後使用 LysoTracker 染色並以流式細胞儀偵測螢光強度。(A) 隨 Compound B 的濃度增加， LysoTracker 的螢光強度有不同程度的增加。(B) 以螢光強度平均值進行統計， Compound B 能隨其濃度增加使螢光強度上升並具有顯著差異。（螢光強度平均值是由程式(CellQuest Pro)，分析 Y 軸為以 DMSO 為參考的螢光強度相對值， student’s t-test，*P < 0.05，**P < 0.01，n=3） 49.

(52) (A). (B). Figure 3. Compound B 能減少細胞中 79Q-EGFP 的堆積物。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 79Q-EGFP 基因表現後，再處理 0、 5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時。利用螢光顯微鏡觀察細胞中 polyQ-EGFP 的堆積物，Compound A 為正控制組。(A) 在螢光顯微鏡觀察中，Compound B 能隨其濃度增加使細胞中 79Q-EGFP 的堆積物減少。(scale bar: 10 μm) (B) 計算每五百個表現綠色螢光的細胞中,具有 polyQ-EGFP 的堆積物的細胞數進行統計分析。（student’s t-test，*P < 0.05，**P < 0.01，n=3） 50.

(53) (A). (B). Figure 4. 細胞自噬抑制劑能影響 Compound B 減少 79yQ-EGFP 堆積物的藥效。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 79Q-EGFP 基因表現後，加入細胞自噬抑制劑：3-MA 和 Baf A1 24 小時，再處理 20 μM 濃度的 Compound B 48 小時。(A) 在螢光顯微鏡觀察中，在 3-MA 和 Baf A1 的阻斷細胞自噬的影響下， Compound B 清除 polyQ-EGFP 堆積物的能力下降。(scale bar: 10 μm) (B) 計算每五百個表現綠色螢光的細胞中，具有 polyQ-EGFP 的堆積物的細胞數進行統計分析。（student’s t-test，*P < 0.05，*P < 0.01，n=3）. 51.

(54) (A). (B). Figure 5. Compound B 能減少細胞中不同長度的 polyQ-EGFP 堆積物。 Q36、Q61 和 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 polyQ-EGFP 基因表現後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時後抽取蛋白質。(A)西方轉漬法分析，Compound B 能隨其濃度增加使細胞中不同長度的 polyQ-EGFP 不可溶堆積物減少。(B) Dot Blot 結果，Compound B 能隨其濃度增加使細胞中 79Q-EGFP 不可溶堆積物減少。(量化值為 Multi Gauge V2.1 分析結果，以 DMSO 作相對值). 52.

(55) Figure 6. Compound B 能促進細胞進行細胞自噬。 Q36、Q61 和 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 polyQ-EGFP 基因表現後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時後，抽取蛋白質進行西方轉漬法分析。Compound B 能隨其濃度增加使 p62 蛋白量下降，Beclin 1 蛋白量上升，LC3-Ⅱ轉換率(LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ)增加。(量化值為 Multi Gauge V2.1 分析結果，以 DMSO 作相對值). 53.

(56) Figure 7. Compound B 促進細胞進行細胞自噬去清除 79Q-EGFP 不可溶堆積物的能力會受細胞自噬抑制劑 3-MA 的影響而減弱。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 79Q-EGFP 基因表現後，加入細胞自噬抑制劑：3-MA 24 小時，再處理 0 或 20 μM 濃度的 Compound B 48 小時後，抽取蛋白質進行西方轉漬法分析。在 3-MA 處理抑制細胞自噬後，細胞自噬相關蛋白 Beclin 1 表現量下降，LC3-Ⅱ轉換率(LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ，加入 Compound B 有輕微上升的現象。而 Compound B 清除 polyQ-EGFP 不可溶堆積物的能力也受影響。(量化值為 Multi Gauge V2.1 分析結果，以 DMSO 作相對值). 54.

(57) Figure 8. Compound B 能誘導細胞形成自噬體。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 79Q-EGFP 基因表現後，再處理 0、 5、10 和 20 μM 不同濃度的 Compound B 48 小時。利用 Hoechst 33342 染劑標記細胞核和免疫螢光標記自噬體相關蛋白 LC3 後，在共枙焦顯微鏡下觀察。隨 Compound B 的濃度增加，觀察到自噬體相關蛋白 LC3 聚集形成自噬體的程度增加。(scale bar: 25 μm). 55.

(58) Figure 9. Compound B 能誘導細胞中自噬體與溶酶體融合。神經瘤母細胞株 SK-N-SH 轉染 GFP-LC3 質體後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的 Compound B 48 小時。利用 LysoTracker 染劑標記溶酶體後，在共枙焦顯微鏡下觀察。隨 Compound B 的濃度增加，觀察到自噬體相關蛋白 LC3 聚集形成自噬體並與溶酶體融合形成自噬溶酶體，共定位形成黃色小點。(scale bar: 5 μm). 56.

(59) Figure 10. 在不同長度 polyQ-EGFP 的細胞株中，處理不同濃度的 Compound B 都不會影響細胞存活。 Q36、61和79的細胞株以doxycycline處理四天誘導其polyQ-EGFP基因表現後，再處理0、5、10和20 μM不同濃度的藥物48小時後，收集細胞並利用PI染劑染色，利用流式細胞儀偵測PI染劑的螢光訊號並分群，得到細胞存活率。Compound B 在不同濃度中都不會影響三株細胞的存活率。. 57.

(60) (A). (B). Figure 11. Compound B 能減少細胞質和細胞核中 polyQ-EGFP 的堆積物。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 polyQ-EGFP 基因表現後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時。(A)利用螢光顯微鏡觀察細胞中 polyQ-EGFP 的堆積物的分佈。(scale bar: 10 μm) (B)計算每五百個表現綠色螢光的細胞中，具有 polyQ-EGFP 的堆積物的細胞數並區分堆積物的位置進行統計分析。（student’s t-test，*P < 0.05，**P < 0.05，n=3） 58.

(61) Figure 12. Compound B 能減少細胞中不同長度的 polyQ-EGFP 堆積物。 Q79 的細胞株以 doxycycline 處理四天誘導其 polyQ-EGFP 基因表現後，再處理 0、5、10 和 20 μM 不同濃度的藥物 48 小時後，分離細胞質和細胞核抽取蛋白質進行西方轉漬法分析。Compound B 能隨其濃度增加使細胞質以及細胞核中不同長度的 79Q-EGFP 不可溶堆積物減少。Histone H1 和 GADPH 分別為細胞核與細胞質的控制組。(量化值為 Multi Gauge V2.1 分析結果，以 DMSO 作相對值). 59.

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