第四章 材料與方法
第二節 實驗方法
五、 細胞核質濃縮現象觀察
DAPI ( 4-6-diamidine-2-phenylindole ) 螢光染色
(1) 實驗原理：
DAPI ( 4-6-diamidine-2-phenylindole ) 是一種能快速進入細胞內與 DNA minor groove 上 AT 區強力結合的螢光染劑，常用於細胞凋亡的檢 測，因細胞凋亡時會有DNA 斷裂 ( DNA fragmentation ) 及染色體濃縮 ( chromosomes condensation ) 的特徵出現，故可利用顯微鏡來觀察，若細 胞凋亡越嚴重，DNA 斷裂也越嚴重，minor groove 暴露出來之 AT 區也就 越多，則可結合上更多DAPI 染劑，所觀察到的白色亮點螢光強度就會越 強。
(2) 實驗方法：
將U-2 OS 細胞 5×104 cells/well 接種於 6 well plate 中，培養 24 小時 待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，加入不同濃度( 12.5、25、50、75、
100 g/ml ) 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 處理，作用 24 小時後，去除 well 中培養基，用1X PBS 清洗細胞，再以 4 ℃之 3% Formaldehyde/ in PBS 固定，以1X PBS 清洗，加入 1 ml 之 0.1% Triton X-100/ in PBS (蓋過細 胞即可) 反應 15 分鐘後，以 1X PBS 清洗，加入 DAPI 染劑避光反應約 30 分鐘，以 1X PBS 洗去多餘染劑，最後以螢光顯微鏡 200X 物鏡拍照。
DNA 彗星拖尾試驗 (Comet assay)
58(1) 實驗原理：
單細胞電泳分析 (Single cell gel electrophoresis assay) 即是所謂的 彗星試驗，可用來分析及定量 DNA damage 的程度，是一個簡單、快速 以及敏感性高的技術。利用 DNA damage 後發生斷裂，並藉由電泳的原 理將斷裂的 DNA 拖出膜外，之後加以染色，DNA 受損越嚴重，斷裂也 就越多，拖尾越明顯；又因其外觀似彗星狀而命名之，由此可藉由拖尾的 長短，觀察DNA 的損傷程度。
(2) 實驗方法：
將 U-2 OS 細胞 1×105 cells/well 接種於 12 well plate 中，經過 24 小 時靜置培養待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，並加入不同濃度之白英 乙醇粗抽物 ( SLE ) ，培養 24 小時後，以 Trypsin 將細胞收至 15 ml 離 心管中，1500 rpm 離心五分鐘，去上清液，加入 1X PBS 約 1 ml，將細 胞transfer 至 1.5 ml eppendorf，經高速離心後去上清液，打散 pellet 加入 1X PBS 100 l (體積依細胞數多寡調整) ，放置冰上備用。 接著配製上 層膠 (0.5% LMA)與下層膠 (0.5% LMA+ 0.5% NMA)，以微波溶解並置於 55℃ 水浴鍋保溫。 將 70l 的下層膠加在載玻片上，以蓋玻片以 45 ﾟ 角慢慢蓋上以防氣泡產生，待膠凝固後去除蓋玻片，再以 10 l 的細胞 懸浮液與 60 l 的上層膠混合均勻後，加在下層膠之上，蓋玻片再以 45 ﾟ角慢慢蓋上，待膠凝固後去除蓋玻片，此時將玻片浸入以配製好的lysis buffer 中，反應 1 小時後，將玻片移至 alkaline buffer 中反應 20 分鐘。 將
電泳槽置於冰上，以alkaline buffer 為電泳緩衝液，進行電泳 30 分鐘 ( 25 V； 300 mA)。電泳結束後，將玻片移至 0.4 M Tris buffer 作用 5 分鐘，
使其pH 值回到中性，再以甲醇脫水 5 分鐘，避免水分干擾染劑作用，最 後加入40 l PI，以螢光顯微鏡進行觀察。
(3) 試劑配製：
表 4-5-1 A. Lysis buffer (需新鮮配製，pH=8~10)： 可破壞細胞膜結構，
以方便後續DNA 電泳。
組成 體積 (ml)
5 M NaCl 100 ml 1 M Tris 2 ml 0.5 M EDTA 40 ml Triton X-100 2 ml DDW 56 ml Total 200 ml
表 4-5-2 B. alkaline buffer (pH=13)： 可將 DNA 雙股螺旋解開成單股 DNA，當電泳時，即可區分出不同片段大小的 DNA。
組成 重量 (g)
NaOH 12 g EDTA 0.3724 g
DDW 將體積定量至 1000 ml
表 4-5-3 C. Tris buffer (0.4 M，以 HCl 調整 pH=7.5)：使 sample 恢復 中性
組成 重量 (g)
Tris 48.456 g DDW 將體積定量至 1000 ml
六、早期細胞凋亡測定
59(1) 實驗原理：
細胞凋亡早期會在細胞膜表面發生改變，其中之ㄧ為帶負電的磷脂絲 氨酸（phospholipid phosphatidylserine；PS）會從細胞膜內轉而暴露到細 胞膜外，而Annexin V 是一種 Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，它對 PS 有高度 的親合性，但PS 外翻也可能發生於壞死細胞上，因此利用 Annexin V 搭 配Propidium iodide (PI)染劑，使用流式細胞儀即可區分出凋亡細胞與壞 死細胞。
(2) 實驗方法：
將U-2 OS 細胞 1×105 cells/well 接種於 12 well plate 中，培養 24 小 時待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，每個well 加入 25 g/ml 之白英 乙醇粗抽物 ( SLE ) 處理，分別培養 3、6、12、24 小時後，以 trypsin 收 集細胞，以PBS 清洗細胞，加入 100 l PBS 轉至 FACS 管中，分別加入 5 l Annexin V-FITC 與 5 l PI，震盪均勻後置於室溫避光反應，再加入 400 l 1X binding buffer 終止反應，最後以流式細胞儀收集 10000 顆細胞 分析螢光量，再以CellQuest®軟體分析。
七、粒線體膜電位 ( Mitochondria membrane potential; Δ
m) 之 檢測
60(1) 實驗原理：
Rhodamine 123 也稱為 2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl) benzoic acid methyl ester，可以快速通過細胞膜，特異性的染在活細胞的粒線體上 的螢光染劑，即活細胞結合上的螢光量較強，反之死細胞結合上的螢光量 較弱，其螢光強度的改變可反映出細胞膜電位(mitochondrial membrane potential) 改變的情形。粒線體膜功能不良 ( mitochondrial dysfunction ) 通常伴隨早期細胞凋亡發生，而細胞粒線體膜電位的改變也因此當作早期
八、細胞內活性氧化物質 ( Reactive oxygen species, ROS ) 之檢 測
61(1) 實驗原理：
利用2’,7’-dichlorofluorescein diacetate ( H2DCF-DA ) 本身不具螢光 的特性來偵測細胞內ROS 的產生。H2DCF-DA 是一種脂溶性染劑，可以
九、細胞內一氧化氮 ( Nitric oxide, NO ) 含量之檢測
62(1) 實驗原理：
DAF-FM diacetate ( 4-amino-5-methylamino-2’,7’-difluorescein
diacetate ) 會被細胞內的乙醯脂酶 ( esterases ) 去乙醯化 ( deacetylated ) 成非螢光性的DAF-FM 進入細胞內，此時螢光強度十分微弱。當細胞內 表現Nitric oxide 時，會使 DAF-FM 變為帶有螢光性的 Benzotriazole derivative，藉由 495 nm 激發偵測散射光 515 nm 可知細胞內 Nitric oxide 表現的變化。
十、細胞內鈣離子 ( Ca
2+) 釋出的變化
63(1) 實驗原理：
細胞內鈣離子可作為細胞信號傳遞的分子，是細胞激活過程中重要的 功 能 因 子 。 若 將 鈣 離 子 螢 光 染 劑 Fluo-3/AM 通 過 乙 醯 甲 酯 ( Acetatoxymethyl Ester；AE ) 導入細胞後，Fluo-3/AM 會與鈣離子特異 性結合。這螢光染劑的結構式，一般與 EDTA 相似，可螯合鈣離子，染
並離心後，每管樣本加入500 l PBS，再 transfer 至 FACS 管中，以流式 細胞儀收集10000 顆細胞分析螢光量，最後以 CellQuest®軟體分析數據。
十一、粒線體膜氧化程度測定
64(1) 實驗原理：
(bisphosphatidyl glycerol)為一類存在於粒線體內膜的脂質，在正常情 況下能與nonyl acridine orange (NAO)結合。 NAO 能在 489 nm 的波長下 受到激發，產生在波長525 nm 可測得的螢光。藉此，當粒線體內膜受到 氧化傷害時，Cardiolipin 與 NAO 結合能力會變差，所產生的螢光量會降 低，因此藉由螢光量的改變，即可觀察粒線體膜氧化的程度。
(2) 實驗方法：
將 U-2 OS 細胞 1×105 cells/well 接種於 12 well plate 中，經過 24 小時 靜置培養待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，每個 well 加入 25 g/ml 之白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 處理，分別培養 1、3、6、24、48 小時後，先 用顯微鏡觀察細胞情形，再將well 中培養基抽至離心管，以 1X PBS 清洗 細胞一次，細胞再以trypsin 處理，置於 37 ℃細胞培養箱中反應 3 分鐘後，
加入培養基中和trypsin 作用，將所有液體裝到離心管中，以 1500 rpm 離 心5 分鐘，離心後將上清液丟棄，以 1X PBS 清洗細胞，再次以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，將細胞完全打散後，每管分別加入 500 l 之 NAO 染劑 (需另準備一管 blank 不加藥也不加染劑，只加入 1ml PBS )，
37 ℃水浴並避光 30 分鐘，30 分鐘後將樣本取出，並以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒掉上清液，加入PBS 清洗細胞並離心 2 次後，每管樣本加入 500
l PBS，再 transfer 至 FACS 管中，以流式細胞儀收集 10000 顆細胞分析 螢光量，最後以CellQuest®軟體分析數據。
十二、Caspase-8, -9 活性分析
59(1) 實驗原理：
利 用 Caspase-8 substrate (PhiphiLux-L1D2) 、 Caspase-9 substrate (PhiphiLux-M1D2) 來 檢 測 凋 亡 細 胞 相 關 蛋 白 caspase-8, -9 之 產 生 ， PhiphiLux kit 基 質 是 種 含 有 螢 光 物 質 胺 基 酸 序 列 ( amino acid sequence )，而活化之 caspase-8, -9 可以裂解胺基酸序列之特定位置，使得 含有螢光物質釋放出來，再經由流式細胞儀 ( Flow Cytometry ) FL-1 detector 偵測後，CellQuest®分析、統計後可得知若螢光產量越多則產生 caspase-8, -9 活性亦越多。
(2) 實驗方法：
將U-2 OS 細胞 1×105 cells/well 接種於 12 well plate 中，經過 24 小時 靜置培養待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，每個 well 加入 25 g/ml 之白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 處理後，培養 6、12、24、48 小時，收細胞，
取10 M substrate (for caspase-8, -9 )，每管加入 25 l，之後置於 37 ℃水 浴並避光 60 分鐘，60 分鐘後將樣本取出，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，倒 掉上清液，加入 PBS 清洗細胞並離心後，每管樣本加入 500 l Flow Cytometer Buffer，再 transfer 至 FACS 管中，以流式細胞儀進行 caspase-8, -9 活性分析，peak 往右代表 caspase-8, -9 活性增加
十三、西方墨點法 ( Western Blotting )
65(1) 實驗原理：
藉由抗體抗原反應來觀察蛋白質的變化。藉由特定抗體對特定胺基酸 序列具專一性，當抗體與蛋白質抗原結合後，再以帶有 Horseradish peroxidase ( HRP ) 的二級抗體與一級抗體結合。經給予 Enhanced chemiluminescence ( ECL ) 呈色後，藉由感光底片接收冷光，而底片經顯 影與定影後，觀察曝光區塊程度即可知道蛋白質表現量的變化。
(2) 實驗方法：
A. 細胞蛋白質之萃取 ( Protein extraction )：
將U-2 OS 細胞 1×106 cells/dish 接種於 10 cm2 dish 中，經過 24 小時 靜置培養待細胞貼附，加藥前更換新鮮培養基，每個dish 加入 25 g/ml 之白英乙醇粗抽物( SLE ) 處理後，培養 6、12、24、48 小時，收細胞，
並以PBS 清洗，離心後，加入 1 ml PBS，將其 transfer 至 1.5 ml 微量離 心管中，離心後將PBS 吸乾，再加入 200 l Lysis buffer ( PRO-PREP for Cell ) 將細胞震盪混合均勻後，置於 -20 ℃ overnight，之後離心 (13000 rpm，10 分鐘) 取其上清液，亦即 lysis buffer 與細胞蛋白混合之液體，之 後進行蛋白質定量的動作。
B. 蛋白質濃度測定：
先製作蛋白質標準品檢量線，以 Bradford 定量法，使用胎牛血清白 蛋白 ( Bovine serum albumin；BSA ) 當作蛋白質標準品，配置不同濃度 之蛋白質標準品後，利用酵素免疫分析儀 ( ELISA reader ) 在 O.D. 595
nm 條件下測量其吸光值做檢量線 ( standard curve ) 分析，求出趨勢線方 程式及R2值。步驟：將Bradford 染劑 5X 稀釋，混合均勻備用，取 20 l 配置好之蛋白標準品BSA 加 980 l Bradford 染劑混合均勻，置於 96 well plate 中，每 well 加入 100 l，三重覆，靜置 5 分鐘後以 O.D. 595 nm 測 量吸光值，求其平均值，以O.D. value (Y) 對蛋白濃度 g/ml (X)，求出 趨勢線方程式 y=ax+b，R2值要趨近於0.99。
表 4-13-1 BSA 標準曲線之配製
BSA 濃度 (mg/ml) 5 mg/ml BSA DDW (l)
1 200 800 0.5 100 900
0.25 50 950 0.125 25 975 0.0625 12.5 987.5 0 0 1000
C. 樣品蛋白質定量：
取18 l DDW 加上 2 l sample protein (以 DDW 將蛋白 5 倍稀釋) 與 980 l 的 1X Bradford dye 混合均勻後，同蛋白質標準品一起測定吸光 值，所得之吸光值平均，帶入 y 值 (y=ax+b) ，求出該 sample 的蛋白質 濃度 x=(y-b)/ a (g/ml )。
D. SDS-PAGE 分析 TG-SDS buffer )，接著將萃取出的蛋白依定量後的體積與 5X protein loading dye 混合，並以 100 ℃加熱 10 分鐘使蛋白變性，10 分鐘後，依序 將標示標準分子量的Marker 及各 sample 注入孔槽中，通以電壓 80 volts，
待樣品通過stacking gel 後，電壓調為 110 volts，進行電泳，當追蹤染料 bromophenol blue 達到底端時，即可停止電泳。
Ⅱ. 轉漬步驟：先將 PVDF membrane，以甲醇濕潤約 5 分鐘，再浸 入轉印緩衝液 ( transfer buffer ) 中，接著將濾紙先浸泡在 transfer buffer 中，將轉漬夾打開後，黑色面朝下，將海綿墊片先以transfer buffer 潤濕 並鋪在黑夾上，再將3M 濾紙鋪上，接下來裁剪下層膠 ( Separation gel ) 中所要轉漬的區域後，將SDS-PAGE gel 小心的擺放於 3M 濾紙上，可在 濾紙上加入多量的transfer buffer，在鋪上 gel 時勿產生任何氣泡，再依序 放上PVDF membrane，同樣避免氣泡產生，及 3M 濾紙，最後再放上一片
PBST 中 )進行 Blocking 步驟，以室溫 1 小時為條件進行。取出 PVDF membrane 後以 0.1% PBST 清洗 10 分鐘共 3 次。倒掉清洗液，加入一級 抗體 (以 2% FBS/ in PBST 配製，稀釋倍數依不同抗體有所不同 )，4 ℃ 隔夜進行搖盪。隔天取出，回收一級抗體，以0.1% PBST 清洗轉印膜 10 分鐘共3 次。加入 8 ml 稀釋 5000-10000 倍的 anti IgG ( HRP ) horseradish peroxidase conjugated antibody 二級抗體 (以 2% FBS/ in PBST 配製)，於 室溫下搖盪進行1 小時，最後取出轉印膜後以 0.1% PBST 清洗 10 分鐘共
PBST 中 )進行 Blocking 步驟，以室溫 1 小時為條件進行。取出 PVDF membrane 後以 0.1% PBST 清洗 10 分鐘共 3 次。倒掉清洗液，加入一級 抗體 (以 2% FBS/ in PBST 配製，稀釋倍數依不同抗體有所不同 )，4 ℃ 隔夜進行搖盪。隔天取出，回收一級抗體，以0.1% PBST 清洗轉印膜 10 分鐘共3 次。加入 8 ml 稀釋 5000-10000 倍的 anti IgG ( HRP ) horseradish peroxidase conjugated antibody 二級抗體 (以 2% FBS/ in PBST 配製)，於 室溫下搖盪進行1 小時，最後取出轉印膜後以 0.1% PBST 清洗 10 分鐘共