第五章 研究結果
第五節 觀察白英乙醇粗抽物 (SLE) 對人類骨肉瘤細胞
2. 利用 DAPI 染色法觀察細胞染色質濃縮情形
細胞經 ( 0、12.5、25、50、75、100 g/ml ) SLE 處理 24 小時後，
可觀察到隨著藥物濃度增加，DAPI 染劑的螢光強度提升，代表隨藥物濃 度增加，其細胞DNA 斷裂與染色質濃縮情形越嚴重。
(A)
Control 12.5 g/ml 25 g/ml
50 g/ml 75 g/ml 100 g/ml
利 用 DAPI 染 色 法 觀 察 細 胞 染 色 質 濃 縮 情 形 (chromatin condensation)
(B)
Time of incubation (h)
Control 12.5 25 50 75 100
Fluorescence intensity (%)
Time of incubation (h)
Control 12.5 25 50 75 100
Fluorescence intensity (%)
PI
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 誘導凋亡 之影響
(B)
圖5-7 U-2 OS 細胞處理 25 g/ml SLE 後培養不同時間點，(A) 利 用流式細胞儀偵測早期細胞凋亡，(B) 凋亡細胞量化圖。 ＊表示以 student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
Time of incubation (h)
Control 3 6 12 24
Apoptotic cells (%)
0 10 20 30 40 50 60
第七節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 鈣 離子釋放之影響
鈣離子在許多細胞訊息傳送中扮演傳遞者的重要角色，主要儲存於 內質網及高基氏體中，有文獻指出當內質網受到壓力時會釋放出大量鈣離 子，進而影響到粒線體膜電位，最後走向凋亡。在本實驗中U-2 OS 細胞 經25 g/ml 之 SLE 誘導，培養 1、3、6 小時後，圖 5-8 (A) 以流式細胞 儀與Fluo/3-AM 染劑偵測細胞內鈣離子濃度變化，圖 5-8 (B) 量化結果發 現鈣離子於1 小時後釋放。另以西方墨點法得知 ER stress 之標的蛋白 GRP 78、GADD153 表現量在藥物處理後 6 小時均有增加。
(A)
Control
3 h 1 h
6 h Control
3 h 1 h
6 h
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 鈣離子釋 放之影響
(B)
Time of incubation (h)
Control 1 3 6
Calcium release (fold of control)
01
Time of incubation (h)
Control 1 3 6
Calcium release (fold of control)
01
第八節 探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 的 細 胞 凋 亡 內 質 網 壓 力 路 徑 (Endoplasmic reticulum-ER stress dependent apoptotic pathway)相關蛋白之表現
利用西方墨點法觀察幫助蛋白質折疊之伴隨蛋白GRP78及反應細胞 壓力的轉錄因子GADD153及ER stress相關蛋白caspase-4、PERK。實驗結 果(圖5-9)發現，25g/ml 之 SLE 誘導GRP78、GADD153蛋白在6小時表 現量上升，而PERK在較後期的12小時開始表現，此結果說明SLE的確可 經由鈣離子的釋放導致U-2 OS細胞內產生內質網壓力。
GRP 78
探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 的細 胞 凋 亡 內 質 網 壓 力 路 徑 (Endoplasmic reticulum-ER stress dependent apoptotic pathway)相關蛋白之表現
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
0 6 12 24 (h)
1.00 2.01 1.36 1.49
1.00 1.23 1.09 1.55
1.00 0.94 0.93 0.84
1.00 1.02 1.14 1.00
1.00 0.91 0.91 0.96
GRP 78
1.00 2.01 1.36 1.49
1.00 1.23 1.09 1.55
1.00 0.94 0.93 0.84
1.00 1.02 1.14 1.00
1.00 0.91 0.91 0.96
圖5-9 以 25g/ml SLE 處理不同時間點 (0、6、12、24 h)之人類骨 肉瘤細胞 U-2 OS， 利用西方墨點法檢測 ER stress 相關蛋白 (如：
GADD153﹐GRP78﹐Caspase-4﹐ PERK) 之表現量變化。
第九節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 產 生活性氧物質 ( ROS) 能力之影響
本實驗以 25 g/ml SLE 處理不同時間點 (1、3、6、12、24、48 h) 之 人類骨肉瘤細胞 U-2 OS，以流式細胞儀偵測 H2DCF-DA 螢光量，進一步 觀察 ROS 在細胞內的表現量。由實驗得知 H2DCF-DA 螢光量之 peak 經 過SLE 處理後並無明顯改變。
(A)
Control
1 h
24 h 3 h
12 h 6 h
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 產生活性 氧物質 ( ROS) 能力之影響
(B)
Time of incubation (h)
Control 1 3 6 12 24
Percentage of ROS products (%)
0 2 4 6 8 10 12 14
圖5-10 U-2 OS 細胞經 25 g/ml 之 SLE 誘導，培養 1、3、6、12、
24 小時後，(A) 以流式細胞儀偵測 H2DCF-DA 螢光量，(B) 螢光量經量 化後發現ROS 表現並無差異。 ＊表示以 student’s t-test 進行分析各實驗 組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
第十節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 細 胞抗氧化相關蛋白之影響
利用西方墨點法觀察抗氧化蛋白表現變化。實驗結果(圖5-11)發現，
經 25g/ml 之 SLE 誘導後，細胞質中的 SOD 和 Catalase 表現量並無 明顯變化，此結果與流式細胞儀偵測ROS (圖5-10)之結果相符。
Catalase
Cu/Zn-SOD
-actin
0 6 12 24 (h)
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
1.00 1.3 1.08 0.6
1.00 0.78 0.72 0.61
1.00 1.01 0.96 0.99
圖5-11 以 25g/ml SLE 處理不同時間點 (0、6、12、24 h)之人類 骨肉瘤細胞 U-2 OS， 利用西方墨點法檢測抗氧化相關蛋白 (如：
Catalase、Cu/Zn-SOD) 之表現量變化。
第十一節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 產生一氧化氮(Nitric oxide, NO) 能力之影響
以 25 g/ml 之 SLE 作用不同時間點後，利用 DAF-FM 偵測細胞內一 氧化氮含量，結果顯示一氧化氮於1 小時即有表現，至 24 小時達最大值。
(C)
Control
6 h 1 h
3 h 12 h
24 h
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 產生一氧 化氮(Nitric oxide, NO) 能力之影響
(D)
Time of incubation (h)
Control 1 3 6 12 24
Percentage of Nitric oxide expression (%)
0 5 10 15 20 25 30
* * * *
*
圖5-12 U-2 OS 細胞經 25 g/ml 之 SLE 誘導，培養 1、3、6、12、
24 小時後，(A) 以流式細胞儀偵測 DAF-FM 螢光量， (B) 經量化後發現 NO 表現量由 1 小時開始上升。 ＊表示以 student’s t-test 進行分析各實驗 組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
第十二節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 粒線體之影響
U-2 OS 細胞經過 25 g/ml 之 SLE 作用不同時間點後，以 Rhodamine 123 觀察粒線體膜電位 ( MMP；Δm ) 變化。以流式細胞儀偵測可知，
於SLE 誘導後 24 小時，Rhodamine 123 螢光量 peak 往左移，代表粒線體 膜電位於24 小時開始下降。
(A)
Control
48 h 1 h
3 h
24 h 6 h
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 粒線體之 影響
(B)
Time of incubation (h)
Control 6 12 24 48
Time of incubation (h)
Control 6 12 24 48
第十三節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 粒線體膜氧化之影響
當粒線體內膜受到氧化傷害時，粒線體內膜之 Cardiolipin 與 NAO 染 劑結合能力會變差，所產生的螢光量會降低，因此藉由螢光量的改變，即 可觀察粒線體膜氧化的程度。實驗結果得知，經SLE 誘導後和控制組相 比，氧化程度有增加的現象。
(A)
24 h 48 h
3 h
6 h
1 h
Control
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 粒線體膜 氧化之影響
(B)
圖5-14 25 g/ml SLE 對 U-2 OS 細胞粒線體膜氧化程度之影響。(A) 藉由流式細胞儀分析NAO 螢光量，依螢光量判斷粒線體膜氧化程度。 (B) NAO 螢光量化統計圖。 ＊表示以 student’s t-test 進行分析各實驗組與控 制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。
Time of incubation (h)
Control 1 3 6 24 48
NAO fluorescence (% of control)
0 20 40 60 80 100 120
*
*
*
*
第十四節 探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 細胞凋亡粒線體路徑 (Mitochrondria-dependent apoptotic
pathway)相關蛋白之影響
以西方墨點法觀察粒線體路徑相關蛋白，發現 anti-apoptosis 蛋白 Bcl-2、 Bcl-XL均被抑制，促進了死亡接受體蛋白Fas、TRAIL 表現量以 及cytochrome c、Bax、Endo G 及 Caspase-3 等蛋白的表現量。
Bcl-2
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
32 kDa TRAIL
Fas 45 kDa
Bid 22 kDa
1.00 2.69 3.29 3.95
1.00 1.00 1.05 1.41
1.00 1.74 1.54 2.28
1.00 0.97 1.27 1.77
1.00 1.07 1.03 0.61
1.00 0.77 0.47 0.45
1.00 1.01 0.97 0/94
Pro- apoptotic
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
32 kDa TRAIL
Fas 45 kDa
Bid 22 kDa
1.00 2.69 3.29 3.95
1.00 1.00 1.05 1.41
1.00 1.74 1.54 2.28
1.00 0.97 1.27 1.77
1.00 1.07 1.03 0.61
1.00 0.77 0.47 0.45
1.00 1.01 0.97 0/94
Bcl-2
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
0 6 12 24 (h)
Incubation time of SLE (25 g/ml) With U-2 OS cells
32 kDa TRAIL
Fas 45 kDa
Bid 22 kDa
1.00 2.69 3.29 3.95
1.00 1.00 1.05 1.41
1.00 1.74 1.54 2.28
1.00 0.97 1.27 1.77
1.00 1.07 1.03 0.61
1.00 0.77 0.47 0.45
1.00 1.01 0.97 0/94
Pro- apoptotic protein
Anti- apoptotic protein
30 kDa
亡粒線體路徑 (Mitochrondria-dependent apoptotic pathway)相關 蛋白之影響
Cleaved Caspase-3 Full length Endo G
Mature Endo G
Caspase-3
-actin Cytochrome c
0 6 12 24 (h) Incubation time of SLE (25 g/ml)
With U-2 OS cells
1.00 1.39 1.11 0.87
1.00 1.09 0.82 0.98
1.45 1.23
1.25 1.00
1.00 1.13 1.19 0.87
1.00 1.20 0.94 1.22
1.00 0.94 0.92 0.92
Smac/DIABLO 25 kDa
1.00 1.21 1.35 1.90
30 kDa Full length Endo G
Mature Endo G
Caspase-3
-actin Cytochrome c
0 6 12 24 (h) Incubation time of SLE (25 g/ml)
With U-2 OS cells 0 6 12 24 (h) Incubation time of SLE (25 g/ml)
With U-2 OS cells
1.00 1.39 1.11 0.87
1.00 1.09 0.82 0.98
1.45 1.23
1.25 1.00
1.00 1.13 1.19 0.87
1.00 1.20 0.94 1.22
1.00 0.94 0.92 0.92
Smac/DIABLO 25 kDa
1.00 1.21 1.35 1.90
圖5-15 以25g/ml SLE處理不同時間點 (0、6、12、24 h) 之人類骨 肉瘤細胞 U-2 OS，利用西方墨點法檢測粒線體路徑相關蛋白 (如：外在 路徑Fas、TRAIL，以及Bcl-2、Bax、Bcl-XL、cytochrome c、AIF、Endo G、
caspase-3) 之表現量變化。
第十五節 利用流式細胞儀探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類 骨肉瘤細胞 U-2 OS 之 Caspase-8. -9 活性之影響
本 實 驗 主 要 利 用 流 式 細 胞 儀 偵 測 CaspaLux kit 來 偵 測 細 胞 內 caspase-8, -9 活性之變化，peak 往右移動代表螢光量增加，意即 caspase-8, -9 活性增加。由實驗結果得知，U-2 OS 細胞經過 25 g/ml 之 SLE 處理 6 小時之後，caspase-8, -9 的螢光強度明顯增加，我們可以由此推測 SLE 所 造成的細胞凋亡可能是經由內在及外在路徑。
(A)
48 h 24 h
6 h
12 h
Control
利用流式細胞儀探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細 胞 U-2 OS 之 Caspase-8. -9 活性之影響
(B)
Time of incubation (h)
Control 6 12 24 48
Caspase-8 activity (%)
0 5 10 15 20 25 30
*
*
* *
圖 5-16 25 g/ml 之 SLE 作用於 U-2 OS 細胞不同時間點，以 CaspaLux 螢光染劑分析細胞內 caspase-8 活性的變化。(A) 以流式細胞儀 分析細胞內caspase-8 活性分析圖以及 (B) caspase-8 活性量化統計圖。＊
表示以student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p
＜0.05。
利用流式細胞儀探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細
student’s t-test 進行分析各實驗組與控制組之間存在之顯著差異，p＜0.05。Ti m e o f i nc ubati o n (h)
第十六節 利用免疫螢光染色法探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對 人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 細胞蛋白轉位 ( translocation) 表現
PI Merge
AIF-FITC
Control
24 h
圖 5-18 利用共軛焦顯微鏡觀察 U-2 OS 細胞經 25 g/ml 之 SLE 處 理後，AIF 從粒線體釋放至細胞質，再轉位至細胞核中。一級抗體為 AIF，
二級抗體標定FITC 綠色螢光，細胞核染 PI。
利用免疫螢光染色法探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉 瘤細胞 U-2 OS 細胞蛋白轉位 ( translocation) 表現
Endo G-FITC PI Merge
Control
24 h
圖 5-19 利用共軛焦顯微鏡觀察 U-2 OS 細胞經 25 g/ml 之 SLE 處理 後，Endo G 從粒線體釋放至細胞質，再轉位至細胞核中。一級抗體為 Endo G，二級抗體標定 FITC 綠色螢光，細胞核染 PI。
利用免疫螢光染色法探討白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉 瘤細胞 U-2 OS 細胞蛋白轉位 ( translocation) 表現
GADD153-FITC PI Merge
24 h Control
圖 5-20 利用共軛焦顯微鏡觀察 U-2 OS 細胞經 25 g/ml 之 SLE 處 理後， GADD153 蛋白表現量增加，並且轉位至細胞核中。一級抗體為 GADD153，二級抗體標定 FITC 綠色螢光，細胞核染 PI。
第十七節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 細胞轉移 (Migration)的影響
本實驗以Wound Healing assay 觀察細胞經低濃度 (12.5 g/ml ) 與 IC50 濃度 25 g/ml 之白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 誘導後，對 U-2 OS 細胞移 動能力之影響。 使用低濃度藥物主要是為了排除濃度太高導致細胞死 亡，而非轉移的疑慮。實驗結果發現，在濃度12.5 及 25 g/ml 時 SLE 均 可抑制U-2 OS 細胞移動的能力。
白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS 細胞轉移 (Migration)的影響
Control 12.5 g/ml 25 g/ml
6 h 0 h
12 h
24 h
圖 5-21 U-2 OS 細胞經 12.5 及 25 g/ml SLE 誘導後，以 Wound Healing assay 可觀察到控制組細胞有向外爬行的現象，而實驗組則明顯爬 行能力受到抑制。
第十八節 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 對人類骨肉瘤細胞 U-2 OS MMP-2 及 MMP-9 之影響
癌細胞轉移時需要基質金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinases)來分 解細胞間質 (ECM)，利用 MMP-2、MMP-9 會分解 gelatin 的特性，進行 gelatin zymography 試驗，活性強所分解的 gelatin 就會較多，依 SDS-PAGE 上被分解的白色區塊，來判斷MMPs 的活性強弱。細胞經以 25、50 g/ml 白英乙醇粗抽物 ( SLE ) 誘導後，可明顯看到 MMP-9 與 MMP-2 的活性 均被抑制。
圖 5-22 U-2 OS 細胞經 25 及 50 g/ml SLE 誘導後，以 gelatin zymography 可觀察到 MMP-9 與 MMP-2 的活性均被抑制。
第六章 結果討論
癌細胞BEL-7402、人類胃癌細胞 SGC-790169、人類黑色素瘤A375-S2 細 胞、人類子宮頸癌HeLa 細胞19及人類胃癌SGC-7901 細胞 22均有細胞毒 性的情形產生；另外在動物模式中，隨著白英濃度的增加，小鼠肉瘤癌 S 180 細胞及小鼠肝癌 H22 細胞生長速率的抑制，均呈現藥物劑量依存性 (dose-dependent)69。也有研究將白英製成膠狀，注入大鼠皮下長達90 天，
由大鼠的血液生化指數及病理切片結果顯示，白英對大鼠的皮膚細胞並無
許多癌細胞株具有細胞毒性，但是卻無針對人類骨肉瘤U-2 OS 細胞做過 相關研究，故本實驗的目的為探討白英乙醇粗抽物，是否有抑制U-2 OS 細胞增生和轉移的能力。
本 實 驗 利 用 白 英 50% 乙 醇 粗 抽 物 ﹝ Solanum Lyratum ethanol extraction (SLE)﹞作為實驗藥物，處理人類骨肉瘤 U-2 OS 細胞 12、24 小 時後，以流式細胞儀觀察其存活率 (圖 5-2)，結果發現劑量範圍從 12.5、 repair)和細胞週期停滯 (Cell cycle arrest) ，若受損情形無法修復，則會走 向細胞凋亡 (Apoptosis)。 因此我們利用 DAPI staining 及 Comet assay 等 實驗來觀察DNA damage 情形。當 DNA 斷裂時會結合上較多 DAPI 染劑，
IC 50濃度 25 g/ml 處理下，U-2 OS 細胞的 G0/G1 phase 和 sub G1 所 停滯。在過去文獻中所提及，p53 為 tumor suppressor protein，當 DNA 受 損或者加入有細胞毒性的藥物時p53 會被活化，停止細胞週期的進行，來
修復 DNA，若其受損過度嚴重，無法修復時，會使細胞進行細胞凋亡反
應。而當p53 活化時，p21 亦被活化，p21 進而抑制 G0/G1 phase 的相關 蛋白，使細胞停滯79。因此我們利用西方墨點法檢測調控細胞週期G0/G1 phase 的蛋白質，例如 Cyclin E、Cdk6、p21、chk2 等相關蛋白。結果顯 示 (圖 5-4)，白英乙醇粗抽物在短時間就會使 p21 及 Chk2 被活化，而在 內的Phosphotidyl Serine (PS) 會外翻至膜外，而利用 Annexin V 染劑對 PS 有高度親和性的特性，搭配 PI 染劑只能染死細胞的特性，就能夠辨別 細胞死亡的方式80。由實驗量化的結果顯示 (圖 5-7 (B))，25 g/ml 的白 英乙醇粗抽物隨著時間增加 ( 3、6、12、24 小時) ，早期凋亡細胞的比
例也越來越高，但晚期細胞死亡的比例相對的也增加了(圖 5-7 (A))，這可 能是白英粗抽物對癌細胞有直接毒殺效果所造成。
鈣離子釋出也是細胞凋亡的指標之一81-83。內質網最主要的功能為幫 助蛋白質摺疊成穩定的結構和分泌蛋白質。當內質網受到破壞後，會有大 量折疊錯誤的蛋白質聚集或鈣離子通透失衡，會產生所謂的內質網壓力 (ER stress)。正常情況下，內質網上的跨膜蛋白 (如：IRE1α、PERK、ATF6α) 會與幫助蛋白折疊的伴隨蛋白(Chaperone) ，如：GRP78 (glucose-regulated protein 78)結合，ER stress產生時使得GRP78無法正確折疊蛋白，這些錯 誤折疊的蛋白會競爭性的與GRP78結合，而解離掉IRE1α、PERK。另外 GADD153 (growth arrest and DNA damage inducible gene 153)是一種轉錄 因子，當內質網受到壓力時會使GADD153表現增加，走向細胞凋亡路徑， 小時皆明顯的釋放，而鈣離子路徑相關蛋白 (圖5-9) GRP78、GADD153 及caspase-4在6小時表現量皆有上升，而PERK在較後期的12小時開始表
指出，ROS並不是唯一造成細胞凋亡的因子，而是經由其他的路徑，像是 caspase-3-dependent pathway使細胞走向凋亡。
細胞凋亡主要可分為三條路徑。其一，經由 caspase-8 調控 caspase-3 走向細胞凋亡的外在路徑；第二， 經由粒線體一連串反應活化 caspase-3 走向細胞凋亡的內在路徑 (又稱為粒線體路徑)；第三，及內質網路徑。
其中粒線體路徑再細分又可分為，caspase 相關路徑：主要受到 Bcl-2 fa
其中粒線體路徑再細分又可分為，caspase 相關路徑：主要受到 Bcl-2 fa