大致根據 Neu 和 Heppel 的方法（59），依滲透壓差（Osmotic Shock）抽取 膜間隙蛋白。首先將培養隔夜之菌液，以有無 30 M PQ 處理約 40 分鐘後以 15000 rpm 離心 10 分鐘後去掉上清液，加入 1 ml osmotic shock buffer（30 mM Tris pH7.5、20% sucrose 及 10 mM EDTA）室溫處理 1 分鐘後，隨即加入 10 g/l lysozyme 20 l 室溫下處理 10 分鐘，以 15000 rpm 離心 10 分鐘後去掉上清液，
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再加入 100 l 冰的二次水或 5 mM Tris-HCl pH7.5 於冰上靜置 10 分鐘，最後以 15000 rpm 離心 10 分鐘，上清液即為細胞膜間隙的蛋白質。取適量膜間隙蛋白 萃液（約 15 g）行超氧化歧化酶活性染色。
15. 西方免疫墨點法（Western blot）分析膜間隙蛋白質
將膜間隙蛋白質等比例混合蛋白質染劑（0.0626 M Tris-HCl pH 6.8、2%
SDS、10% glycerol、0.01% bromophenol blue、及 100 mM dithiothreitol），並以 95°C 加熱 10 分鐘，取適量蛋白質（約 15 g）加入 13.5% SDS-PAGE 電泳分離 蛋白（100 V、200 mA、140 分鐘）。蛋白質經膠電泳分離後，將膠上之蛋白質電 泳 100 分鐘（140 V、400 mA）轉漬到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride, PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA）上，再以 5%的脫脂牛奶 4°C 處理隔夜，接 著加入一級抗體 anti-β lactamase 在室溫下 2 小時，再以經 5000 倍稀釋之二級抗 體 alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G（Sigma）室溫下 處理 1 小時，隨後加入呈色劑 BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）、NBT 及 alkaline phosphatase buffer（5 mM MgCl2．6H2O 和 150 mM Tris-HCl pH9.5）
避光呈色。
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三
、結果
建構 sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損突變株
為了解在克雷白氏肺炎桿菌抗氧化系統的防禦機制，我分別建構 sodA、
sodB、sodC、katE、katG 和 rpoS 基因缺損突變株。首先利用 PCR 增幅各個基因 前後約 1000 bp 的 DNA 片段，將其結合成一段後接入自殺性載體 pKAS46，分 別得到質體 pPO04、pPO08、pPO12、pPO16、pPO20 及 pPO24（表二），再以接 合作用分別將各個質體送入克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 中，藉同源序列重組互換 及抗生素的篩選而得到基因缺損的突變株，最後利用引子確認各個基因的缺損。
如圖一至圖六，ΔsodA、ΔsodB、ΔsodC、ΔkatE、ΔkatG、ΔrpoS 均可以 PCR 確 認各個缺損的片段，分別獲得同源序列重組互換機率為ΔsodA：6.6%、ΔsodB：
16.6%、ΔsodC：1.3%、ΔkatE：6.6%、ΔkatG：1%及 ΔrpoS：33%。
sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損的影響
如圖七 A，sodA、sodB、sodC、katE 或 rpoS 基因缺損後，OD600吸光值與 WT 無明顯差異，但是 ΔkatG OD600吸光值明顯比 WT 高，進一步利用塗盤數菌 落的方式確認 katG 基因缺損後，隨著生長的時間拉長，單位菌數明顯比 WT 多 許多（圖七 B），顯示 katG 基因缺損後生長速度變快；進一步分析各個基因缺損 株外觀，如圖八 A，sodA 基因缺損後菌落變成大小不均一；katG 基因缺損後，
菌液經離心後明顯形成沉澱（圖八 B），而 sodB、sodC、katE 或 rpoS 的基因缺 損不造成細菌外觀上明顯的差異；測試各個基因缺損株的生物膜形成，發現各個 基因缺損也不影響其生物膜的形成能力（圖八 C）。
膠染色確認基因缺損影響抗氧化酵素的活性
為了量測個別抗氧化酵素基因的剔除後，克雷白氏肺炎桿菌中抗氧化酵素活 性的變化，利用超音波震盪打破菌體後，以電泳方式將總蛋白於 polyacryamide
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膠上展開後分析膠上超氧化歧化酶及過氧化氫酶活性。如圖九 A，sodA 及 sodB 基因缺損其相對轉譯的酵素活性消失；而 sodC 基因缺損其膠染色結果與 WT、
katE 及 katG 基因缺損突變株沒有明顯差異；如圖九 B，katE 或 katG 的基因缺損，
其相對轉譯的酵素活性消失。
sodA 或 katG 基因缺損對抗氧化能力的影響
確認各個基因缺損影響抗氧化酵素的活性後，以 3 mM PQ 來測試各個基因 缺損突變株的抗氧化能力的變化，如圖十 A，rpoS 或 sodA 基因缺損株存活率明 顯比其他突變菌株的存活率較低；而以 10 mM PQ 紙錠測試，sodA 基因缺損株 的生長抑制圈也明顯比其它菌株的大出許多（圖十 B）；最後，再將各個菌株培 養於含不同濃度 PQ 的 LB 培養液中，如圖十 C，sodA 基因缺損株，無論是在含 100、300 或 600 M PQ 的 LB 培養，其生長狀況都比其他菌株差許多，而 rpoS 或 sodC 基因缺損株在 600 M PQ 培養液培養下也有明顯影響。
如圖十一 A，以 10 mM H2O2添加於 LB 培養液中，katG 基因缺損株的存活 率明顯的比其他菌株較低，而 rpoS、sodA 或 katE 基因缺損株的生存率也稍低；
以含有 50 mM H2O2紙錠處理，katG 基因缺損株的抑制圈比其它菌株明顯大許多
（圖十一 B），而 sodA 基因缺損株的抑菌圈，比 WT 稍微大些；如圖十一 C，將 各菌株培養在含有不同濃度的 H2O2 LB 中，katG 基因缺損株，在 1、2 或 4 mM H2O2
培養液的生長狀況都比其他菌株差許多，rpoS 基因缺損株則是在 2 或 4 mM H2O2
培養液培養下有明顯差異，而ΔsodA、ΔsodB、ΔsodC 或 ΔkatE 在 4 mM H2O2培 養液培養下也有明顯差異。
sodA 及 katG 基因回補實驗
如圖十二 A，disc diffusion assay 顯示利用 pRK415 載體回補 katG 基因至 katG 基因缺損株後使抑菌圈縮小許多；而膠電泳染色結果也發現回補 katE 或 katG 基 因後在膠上可染色定位 KatE 或 KatG 的活性（圖十二 B）。如圖十三 A，利用
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pRK415 載體回補 sodA 基因至 sodA 基因缺損株後，發現菌落的大小不一會回復 到與 WT 相同的大小均一，確認了 sodA 基因缺損株菌落大小不一是因 sodA 基因 剔除造成；而 disc diffusion assay 也顯示回補 sodA 基因使抑菌圈小許多（圖十三 B）；最後，膠電泳染色結果也發現回補 sodA 或 sodB 基因後在膠上可染色定位 SodA 或 SodB 的活性（圖十三 C）。
sodA 啟動子活性分析
接著以 Softberry 分析 sodA 基因上游非轉譯區的序列（圖十四 A），發現 ArcA binding box，而以目測分析發現 pecO-like sequence 及 Fur binding box，再進一步 以 RNAhybrid 分析找到 small RNA RyhB 與 sodA 啟動子的 binding sequence（圖 十四 B），並可預測其結合的構型（圖十四 C）。
進一步以此分析結果為依據建構了含三種不同長度 sodA putative promoter
PsodA1、PsodA2、PsodA3分別與 LacZ 報導系統結合的質體，如圖十五 A，PsodA2少了
RNAhybrid 軟體預測的 RyhB 結合序列，而 PsodA3只包含 Fur binding box。Fur 曾 被證明會調控 sodA 的表現（33、83）；而在膿桿菌中證實 PecS 會與具有迴文序 列之 pecO 結合進而抑制下游基因表現（69、70）。進一步測試 sodA 啟動子活性，
結果如圖十五 B，無論在有無 PQ 的處理下，相較於 PsodA1，PsodA2活性增加了十 至二十倍；sodA 啟動子活性在 Δfur 或 ΔfurΔryhB 中明顯大於其他菌株，但 ΔfurΔryhB 在 PsodA1下的活性明顯比Δfur 還低，且在 ΔryhB 中活性也是較低，而
在 PsodA2或 PsodA3則無此現象；另外在 pecS 基因缺損情況下無經過 PQ 的處理，
PsodA1或 PsodA2活性有稍低的現象。
Fur 或 RyhB 對 sodA 基因表現的影響
接著利用即時聚合酶連鎖反應來測試 Fur 或 RyhB 對於 sodA 的基因表現是 否有影響，結果如圖十六，當 fur 基因剔除後，sodA 表現量明顯增加，將 WT 培 養於富含亞鐵離子的 LB 培養液後，sodA 表現量明顯下降，而將 WT 培養於含亞
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鐵離子螯合劑 dipyridyl 的缺鐵 LB 培養液後，sodA 表現量明顯上升；另外，將 fur 及 ryhB 雙基因剔除後，sodA 表現量比 fur 單一基因剔除後明顯降低許多，而 利用載體攜帶 ryhB 基因至各菌株後，sodA 表現量有明顯的上升。
RpoS、SoxRS、YjcC、MrkH 或 RcsB 在調控 sodA 的路徑上扮演角色
為了解過氧化逆境相關的調控分子 soxRS、yjcC、mrkH 或 fur 在氧化壓力下 的重要性，測試各個基因缺損株的抗氧化能力的結果如圖十七 A，在 3 mM PQ 處理下，ΔsoxRS、ΔyjcC 或 ΔmrkH 存活率都比野生株低，而 Δfur 卻無明顯影響；
由（B）、（C）圖可知將 soxRS、yjcC 或 mrkH 基因剔除後，在含 10 mM PQ 紙錠 LB 培養基上，ΔsoxRS、ΔyjcC 或 ΔmrkH 的抑菌圈比野生株的抑菌圈要大。另外 為了探究與過氧化逆境相關的調控分子 rpoS、soxRS、yjcC、mrkH、rcsB 基因缺 損突變株是否會參與 sodA 的表現調控，將利用 LacZ 報導系統來做測試，結果 如圖十八：在 rpoS、soxRS、yjcC、mrkH 或 rcsB 基因缺損情況下，PsodA1的活性 有降低的現象。
rpoS、sodA、katG、yjcC 或 rcsB 基因缺損對抗酸能力的影響
許多文獻報導顯示，細菌體內的抗氧化與抗酸機制息息相關（11、74、76），
所以，我們也將測試與過氧化逆境相關的調控分子及抗氧化酵素基因缺損突變株 的抗酸能力，結果如圖十九：當各個基因缺損突變株在 pH 3.0 的 M9 培養液培 養後，rpoS、sodA、katG、yjcC 或 rcsB 基因缺損後的存活率明顯下降，而 fur 基 因缺損後則相反。
SodA 的 N 端氨基酸序列比對
最近報導，根瘤菌及大腸桿菌 SodA 缺乏訊號胜肽，仍可靠 N 端 10 個氨基 酸以 SecA-dependent 方式，將 SodA 由細胞質送到細胞膜間隙（44）。我們利用 VectorNTI 軟體比較發現克雷白氏肺炎桿菌 SodA、SodB 與大腸桿菌及根瘤菌
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SodAN 端 10 個氨基酸相似度很高（圖二十 A），暗示著克雷白氏肺炎桿菌 SodA 或 SodB 可藉 SecA-dependent 方式分泌至細胞膜間隙；同時比較 SodC 發現 SodA、SodB 與含有訊號胜肽的 SodC N 端氨基酸差異度極大（圖二十 B）。
SodA、SodB 和 SodC 皆會出現在細胞膜間隙
將不同的菌株分別有無經過 30 M PQ 處理後，再利用滲透壓差（59）抽取 細胞膜間隙蛋白，接著以 13.5% native polyacryamide gel 以電泳分離蛋白，並行 膠染色分析超氧化歧化酶活性。結果如圖二十一，在 LB 液培養下，WT 的 SodA 及 SodB 的酵素活性皆有出現在膜間隙，sodA 及 sodB 基因缺損株在膜間隙的相 對酵素活性消失，而 SodA 及 SodB 的酵素活性可在 sodC 基因缺損株中發現；經 過 30 M PQ 處理後，膜間隙的 SodC 酵素活性在 sodA 基因缺損的情況下明顯表 現，在膠上的位置與 SodA 相近。此實驗在菌株培養至 stationary phase 或 log phase
（OD600約 0.6~0.8）時結果相同。我們同時利用西方免疫墨點法來針對細胞膜間 隙的標記β lactamase 進行呈色分析，結果可以看到膜間隙蛋白的 anti-β lactamase 呈色比全蛋白明顯許多，證明所萃取出之蛋白為細胞膜間隙蛋白質。
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四
、討論
地球上由氧、氮所造成的氧化壓力環境處處可見，細菌除了環境的氧化壓力 外，還有體內形成的氧化壓力，感染宿主時也會面臨相當大的超氧自由基的攻擊
（26、38），為了適應環境而生存，細菌對抗氧化壓力的防禦機制因而相當重要。
在有氧環境中，研究較透徹的是 SoxRS 及 OxyR 抗氧化機制的調控系統（7、
61），而在無氧情況下，以 Fnr 及 ArcAB 為主要調控系統（20、52），當這些調
61），而在無氧情況下，以 Fnr 及 ArcAB 為主要調控系統（20、52），當這些調