克雷白氏肺炎桿菌CG43抗氧化逆境反應的研究 -超氧化歧化酶SodA的表現調控

國立交通大學

生物科技研究所

碩士論文

克雷白氏肺炎桿菌 CG43 抗氧化逆境反應的研究

-超氧化歧化酶 SodA 的表現調控

Study of the oxidative stress response in Klebsiella

pneumoniae CG43

- Regulation of the superoxide dismutase A expression

研究生：吳宛怡

（

Wan-Yi Wu

）

學號：9928531

指導教授：彭慧玲博士

（

Hwei-Ling Peng

）

i

Abstract

During infection, defenses against oxidative stress play an important role in

determining the bacterial virulence. Here, the antioxidative response in Klebsiella

pneumoniae CG43 was investigated. Specific gene-deletion mutants including ΔsodA,

ΔsodB, ΔsodC, ΔkatE, ΔkatG and ΔrpoS were generated and the deletion effects were analyzed. Each of the deletion had no apparent effect on the cell growth and phenotypic presentation except that ΔkatG showed faster growth and ΔsodA exerted varied colony forms. Compared to the parental strain K. pneumoniae CG43S3 or the deletion mutant ΔsodB, ΔsodC, ΔkatE and ΔrpoS, the survival analysis or the disc diffusion assay revealed that ΔsodA mutant was most sensitive to the treatment of paraquat (PQ) and ΔkatG was most sensitive to H2O2 treatment. These results

indicated that SodA and KatG likely play a major role in the oxidative stress response.

Using LacZ reporter analysis and qRT-PCR measurement, the sodA promoter activity

and mRNA level were found to be increased in the fur deletion strain but the deleting

effect was suppressed by further deleting the ryhB gene. This suggests a negative role

of Fur but a positive role of RyhB on the expression of sodA. Finally, the periplasmic

fractionation analysis indicated that although SodA and SodB carrying no N-terminal

signal peptide, they as well as SodC were found in the periplasmic fraction after PQ

ii

中文摘要

在感染的過程中，細菌的抗氧化防禦機制對於其毒性扮演著重要的角色。本 研究中，我們探討克雷白氏肺炎桿菌 CG43 的氧化逆境反應。首先，我們建構 ΔsodA、ΔsodB、ΔsodC、ΔkatE、ΔkatG 和 ΔrpoS 等突變株，並分析這些基因缺 損後對克雷白氏肺炎桿菌抗氧化逆境反應造成的影響，結果發現ΔkatG 的生長速 度變快，而 ΔsodA 菌落大小不一。利用生存率測試與紙錠分析的結果發現，相

較於 CG43S3 野生株以及 ΔsodB、ΔsodC、ΔkatE 和 ΔrpoS 突變株，ΔsodA 突變

株對 paraquat 的處理最為敏感，而 ΔkatG 則對 H2O2處理最為敏感，這些結果暗

示 SodA 或 KatG 可能是克雷白氏肺炎桿菌在抗氧化壓力主要的反應因子。接著， 我們利用 LacZ 報導系統和即時聚合酶連鎖反應來分析，發現在 fur 基因缺損的 情況下，sodA 基因啟動子的活性及 mRNA 的表現量增加，而在 fur 和 ryhB 雙基 因缺損菌株，Fur 的抑制作用消失，這些結果暗示著 Fur 是 sodA 基因表現的抑制 蛋白，而 RyhB 則會促進 sodA 基因表現。最後，藉由細胞膜間隙蛋白質的分析， 我們發現 SodA 或 SodB 雖然缺乏 N 端訊號胜肽，卻和膜間隙蛋白 SodC 一樣在 經過 paraquat 處理後會出現在細胞膜間隙。

iii

致謝

兩年的研究生生活將告一段落了，即將開啟我人生中的另一個階段，在實驗 室中有許多以前沒經歷過的人、事、物，有許多感謝的人及感恩的事，我由衷的 感到依依不捨，但也對未來充滿展望。 首先我要感謝的是我心目中最美麗最可愛最尊敬的指導老師彭慧玲老師，在 我們的實驗或是論文上遇到問題時，她總是很細心的指導，給我們很多寶貴的意 見，而在待人處事上也給我們相當多的啟發，很喜歡老師令人感到溫暖的笑容， 希望在將來老師還是會很快樂很健康喔～接著我要感謝的是林志生老師以及林 靖婷老師，百忙之中來擔任我的口試委員，謝謝你們給予我諸多寶貴的意見，另 外我還要感謝師丈張晃猷老師以及張老師實驗室的學生，謝謝你們在論文及實驗 上給我的許多建議，讓我的碩士論文可以更加的完整。 在大學沒有當過專題生的我，對於許多實驗的操作技巧及流程都是相當的不 清楚，非常謝謝對我而言就像姊姊一樣的靜柔學姊教導我許多關於實驗上的事 物，並且在我灰心、難過時給予我相當的安慰與鼓勵；也謝謝哲充學長的廣播， 讓我們在做實驗時有更多的樂趣；還有謝謝有義氣的舉豪、大熊、力成，我們度 過許多一起歡笑一起憤慨的日子，以及感謝你們在臉書上面給我的支持與鼓勵； 另外還有感謝已經畢業的崴云及品瑄，謝謝你們在我碩一的時候，給我的幫助以 及帶給我充實的生活，並且在畢業後還會時時的關心我。 另外我要謝謝實驗室外的好朋友莊鈞凱、旻容、妮妮、阿爆、美惠、勁八舞 九們，因為有你們讓我的生活更加的光彩美滿；最感謝的是我的爸爸、媽媽、妹 妹、弟弟從小到大給予我的支持與鼓勵，你們是我精神上永遠的支柱，我永遠愛 你們。我將我這兩年來努力得到的碩士學位獻給我的家人及我愛的人，謝謝你們 讓我可以一路上堅持的走過來，我相信將來一定會更加美好！ 宛怡 謹致於 交通大學生物科技研究所中華民國 101 年 6 月

iv

目錄

頁數 英文摘要……….……i 中文摘要………ii 致謝………...………iii 目錄………...……iv 表目錄………...………vi 圖目錄………...………vii 縮寫………...………..………ix ㄧ、前言 1. 克雷白氏肺炎桿菌………1 2. 氧化壓力………2 3. 氧化壓力下的調控……….2 4. 氧化壓力下的反應及抗氧化酵素……….4 5. 二級信使 Cyclic-di-GMP ………5 6. 具體目標………5 二、材料與方法 1. 菌株………7 2. 基因重組技術………7 3. 生物資訊的分析………..………7 4. 基因缺損突變株的建構………8 5. 生長曲線量測………8 6. 生物膜染色………8 7. 抗氧化酵素活性染色……...………....……...9 8. 抗氧化壓力的能力評估...………...10

v 9. 基因回補質體建構....………...……11 10. 啟動子報告質體建構………...……...11 11. β-半乳糖苷酶活性評估………...……...11 12. 即時聚合酶連鎖反應測試………...……...12 13. 抗酸能力評估………...…...……...12 14. 細胞膜間隙蛋白質的抽取…………...…...……12 15. 西方免疫墨點法分析膜間隙蛋白質...……...13 三、結果 建構 sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損突變株..…...…14 sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損的影響...14 膠染色確認基因缺損影響抗氧化酵素的活性...…14 sodA 或 katG 基因缺損對抗氧化能力的影響...15 sodA 及 katG 基因回補實驗...…...15 sodA 啟動子活性分析...…...16

Fur 或 RyhB 對 sodA 基因表現的影響...…...16

RpoS、SoxRS、YjcC、MrkH 或 RcsB 在調控 sodA 的路徑上扮演角色………....17 rpoS、sodA、katG、yjcC 或 rcsB 基因缺損對抗酸能力的影響………17 SodA 的 N 端氨基酸序列比對...…...17 SodA、SodB 和 SodC 皆會出現在細胞膜間隙...…18 四、討論...19 五、參考文獻...24

vi

表目錄

表一：本研究所使用的菌株...36 表二：本研究所使用和建構的質體...38 表三：本研究所使用的引子...40

vii

圖目錄

圖一：建構 sodA 基因缺損突變株...42 圖二：建構 sodB 基因缺損突變株...43 圖三：建構 sodC 基因缺損突變株...44 圖四：建構 katE 基因缺損突變株...45 圖五：建構 katG 基因缺損突變株...46 圖六：建構 katG 基因缺損突變株...47 圖七：sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損株的生長曲線...48 圖八：sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損株的外表型...49 圖九：膠染色分析抗氧化酵素的活性...50

圖十：sodA、sodB、sodC、katE、katG 或 rpoS 基因缺損對抗 paraquat 能力的影 響...51 圖十一：sodA、sodB、sodC、katE、katG 或 rpoS 基因缺損對抗 H2O2能力的影 響...52 圖十二：ΔkatG 突變的回補實驗分析...53 圖十三：ΔsodA 突變的的回補實驗分析...54 圖十四：sodA 啟動子序列分析...55 圖十五：LacZ 報導系統分析 sodA 的啟動子活性...56 圖十六：Fur、RyhB 對 sodA 基因表現的影響...57

viii 圖十七：sodA、soxRS、yjcC 或 mrkH 基因缺損對抗氧化能力的影響...58 圖十八：LacZ 報導系統分析調控蛋白分子對 sodA 的影響…………..………59 圖十九：rpoS、sodA、katG、yjcC、fur 或 rcsB 基因缺損對抗酸能力的影響...60 圖二十：SodA 和 SodB 的 N 端 10 個氨基酸序列.……….………..61 圖二十一：SodA、SodB 和 SodC 在細胞膜間隙的活性分析...….62

ix

縮寫表

bp c-di-GMP CFU CPS DGC DNA EDTA ESBL Fur LB LPS g l M mM NBT ONPG OD PCR PDE PQ PVDF qRT-PCR Rcs RNA RNS ROS rpm Sod SDS-PAGE TEMED base pair

Bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate colony forming units

capsular polysaccharide di-guanylate cyclase deoxyribonucleic acid

N’N’N’N’-ethylenediaminetetraacetate

extended-spectrum β-lactamase ferric uptake regulator

Luria-Bertani lipolysaccharide microgram microliter micromolar millimolar

nitroblue tetrazolium chloride

o-nitrophynyl, β-D-galactopyranoside optical density

polymerase chain reaction phosphodiesterase

paraquat

polyvinylidene difluoride

quantitative real time polymerase chain reaction regulator of capsular synthesis

ribonucleic acid

reactive nitrogen species reactive oxygen species revolution per minute superoxide dismutase

sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis

1

一

、

前言

1. 克雷白氏肺炎桿菌 克雷白氏肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）為一革蘭氏陰性菌，歸屬腸內 菌科（Enterobacteraceae），是常見的伺機性病原，對於免疫性不良或缺乏的病人 會造成嚴重的感染。臨床上常見的病徵有：敗血症、肺炎、腦膜炎、尿道感染及 特定部位的化膿性感染，如不加以治療，會有高達 90％的致死率（14、16、42、 85、96）。在台灣，糖尿病病人肝膿瘍導致的嚴重併發症與克雷白氏肺炎桿菌有 高度的相關性（12、90）。另外，因為濫用抗生素造成抗藥性菌株的產生，包括 會製造廣效性乙內醯胺酶（Extended-spectrum β-lactamase, ESBLs）類的克雷白 氏肺炎桿菌（18），和後來對 carbapanems 類的抗生素產生抗性的菌株，簡稱為 KPC（27、36、60），以及近來報導由新德里(New Delhi)醫院分離出的 NDM-1 菌 株 ， 除 了 抗 carbapanems 外 ， 還 會 製 造 新 的 金 屬 β- 內 醯 胺 酶 （metallo-β-lactamase），使大多內醯胺類抗生素失效，造成新的危機（46、93）。 克雷白氏肺炎桿菌的致病因子包括：一、細菌表面抗原：如莢膜多 醣體 （ capsular polysaccharide, CPS ）， 可 保 護 細 菌 免 受 多 型 態 有 核 顆 粒 細 胞 （polymorphonuclear granulocyte）的吞噬及抗血清殺菌的能力，藉 CPS 多樣的構 造，將克雷白氏肺炎桿菌分成 77 種血清型，並以 K1 及 K2 血清型具有最高的毒 性（4、57、62、67、91）；脂多醣體（lipolysaccharide, LPS）除具有類似 CPS 的作用外，亦會引發宿主產生敗血性休克的免疫反應（66、84）。二、黏附因子： 細菌常藉由表面黏附蛋白與宿主細胞受器結合來達到附著的目的，如第一型與第 三型的線毛（type 1 and 3 fimbriae）以及非線毛型的黏附蛋白 CF29K 與 KPF28

（28、82）。三、細菌競爭宿主內鐵質來源的能力：即奪取鐵的系統（iron acquisition

system），主要為 siderophores，此類物質對於鐵具有極高親和力，在克雷白氏肺

炎桿菌中可分為 enterochelin 以及 aerobactin 兩種（67）。此外，克雷白氏肺炎桿 菌如何抵抗酸性逆境或過氧化逆境的分子機制，相對的較少研究報導。

2

2. 氧化壓力

細菌感染成功的關鍵，在於是否有能力可以戰勝外在環境所給予的壓力， 例如：氧化壓力（oxidative stress）。氧化壓力主要是由 reactive oxygen species （ROS）和 reactive nitrogen species（RNS）所造成，ROS 包含超氧自由基 （superoxide anion, O2•¯）、過氧化氫（hydrogen peroxide, H2O2）以及氫氧自由基

（hydroxy1 radical, OH˙），而 RNS 則包含了帶電的一氧化氮（nitric oxide radical,

NO˙）及過氧化氮（peroxynitrite, ONOO-_{）。這些 ROS 和 RNS 會對 DNA、蛋白}

質、脂質以及細胞膜造成傷害，而影響細菌的生長及繁殖（37、94）。

在感染過程中，細菌處在一個充滿氧化壓力的環境，這時氧化壓力的來源主

要來自（一）細菌本身體內的氧化壓力：例如電子傳遞鏈（electron transport chain,

ETC），在傳遞電子時，因電子跳脫傳遞鏈而與體內氧氣作用形成；（二）外在環 境：除了環境中原本就存在的氧化還原反應所造成的氧化壓力外，在感染宿主的 過程中也會出現競爭的細菌，這時競爭者也會產生 ROS 來與之競爭；（三）宿主 體內的吞噬細胞（phagocytic cells）：細菌進到宿主體內之後，受到吞噬細胞的辨 識，而將細菌吞進細胞裡，吞噬細胞裡的 NADPH oxidase 會與氧氣作用而形成 大量的超氧自由基及過氧化氫，來攻擊入侵的細菌（26、38）。 3. 氧化壓力下的調控 受到氧化壓力的攻擊時，細菌會有一連串的反應，這些反應被調控分子 （regulators）所控制。不同的調控分子藉由感應到不同的訊號，會有不一樣的調 控路徑，文獻報導上較為著名的像是：在大腸桿菌（Escherichia coli）中，O2•¯

存在時，SoxR 會與之反應後改變含有鐵硫中心 SoxR 的構型，構型改變的 SoxR 會去結合在 soxS 這段基因的啟動子（promoter）上，促使 soxS 基因表現，而 SoxS 則進一步促使 sodA（superoxide dismutase A）、sodB（superoxide dismutase B）、

fur（ferric uptake regulator）和其他目標基因的表現（19、32、61）；而當 H2O2

3

以去結合在 katG（hydroperoxidase I）、fur、ahpC（alkylhydroperoxide reductase）、

gorA（gluthione reductase）和其他目標基因的 promoter 上，促使這些基因表現（3、

6、7、35）。

另一方面，在無氧的環境下，則會有其他的調控分子來參與調控。 Fnr （fumarate nitrate reductase）是一 global regulator，主要藉由感應氧氣與一氧化氮 （NO）的有無來決定其活性，缺乏氧氣與一氧化氮時，會呈現有活性的狀態，

去結合在下游 sodA 及 sodC 的 promoter 上，調控基因表現（20、88）；而 ArcAB

雙分子系統（two component system, TCS）的調控方式以帶有激酶（kinase）活性 的 ArcB，感受到氧化壓力時，會自體磷酸化（autophosphorylation），再將磷酸 根（phosphate）傳給 ArcA，活化的 ArcA 會促進下游基因表現，文獻報導顯示：

在 E. coli 中，ArcAB 的基因缺損，會對 H2O2的抗性下降（52）。

在細菌中，除了上述的 global regulators 會去感應到壓力而促使基因表現外， 基因的表現也與 sigma（σ） factors 的調控有很大的相關性。在 E. coli 和沙門氏 菌（Salmonella spp.）中，RpoS 是一個在 stationary phase 的 sigma factor（σs

, σ38）， 負責調控許多基因的表現，幫助細菌適應不良的環境。E. coli 四千六百多個基因 中，RpoS 調控組（regulon）的基因占了 10%（2、23）。抗氧化基因 katE （hydroperoxidase ΙI）、katG 和 sodC（superoxide dismutase C）皆包含在 RpoS 調 控組裡（24）。

剔除創傷弧菌（Vibrio vulnificus）rpoS 基因，會造成 fur 的表現下降（49、

63），Fur 也是一個 global regulator，它的調控作用與亞鐵離子（Fe2+_{）濃度有關，}

Fur 與亞鐵離子結合變成有活性的狀態，有活性的 Fur 會去結合 Fur box（含 19-base pair）序列，進而抑制下游基因的表現。Fur 的調控與鐵離子的含量有關 係，而鐵離子的多寡與外在環境及氧化壓力也息息相關。文獻報導顯示：Fur 會 抑制一個反義 RNA（anti-sense RNA）ryhB 表現，進而影響基因表現或造成標的 基因的 mRNA 降解，抗氧化基因 sodB 即為受調控的基因之一（53、89、92）。

4

4. 氧化壓力下的反應及抗氧化酵素

細菌受到大量氧化壓力攻擊後，可能會造成 DNA、蛋白質、脂質以及細胞 膜的傷害，被傷害的 DNA 會由 DNA 的直接修復（direct repair）作用，來將之 恢復成正常；而間接修復（indirect repair）作用，也可藉由蛋白酶（proteases）、

脂質酶（lipases）和核酸水解酶（nucleases），來將錯誤的物質直接水解掉，避免

更進一步的傷害（26、38）。但是大量的氧化壓力所造成的傷害，使直接或間接 修復作用措手不及，所以細菌本身除了上述的修復作用外，也藉由體內眾多的調 控路徑，產生出抗氧化酵素（antioxidant enzyme），來清除掉過多的 ROS。 超氧化歧化酶（superoxide dismutase）可以將超氧自由基和氫氣轉變成過氧 化氫及氧氣（H2 + O2•¯ → H2O2 + O2），在 E. coli 中，含有 SodA、SodB 及 SodC

三種超氧化歧化酶。SodA 是以錳離子（Mn2+_{）為輔因子（cofactor）的酵素，在}

原核生物，通常存在於細胞質（cytosol）中（40），但有研究報導指出：SodA 雖

然缺乏訊號胜肽（signal peptide），卻也會出現在細菌的細胞膜間隙（periplasm）

（44）。SodB 以亞鐵離子（Fe2+_{）為輔因子的酵素，在原核生物中，通常存在於}

細胞質，文獻也指出：sodB 會受到 Fur 及 RyhB 的相互調控進而表現或是降解

（53、95）。SodC 是以銅鋅離子（Cu2+

/Zn2+）為輔因子的酵素，通常存在於原核

生物的細胞膜間隙，為 RpoS 所調控（9、25、58）。

過氧化氫酶（catalase）可以將過氧化氫轉變成氧氣及水（H2O2 + H2O2

→ O2 + 2H2O ），在 E. coli 中，含有 KatE 及 KatG。KatE 又稱為 Hydroperoxidase

II（HPΙI），為 RpoS-dependent 的酵素，通常存在於原核生物的細胞質中（51、

75）。 KatG 為 Hydroperoxidase I（HPΙ），也是存在於原核生物的細胞質中，由

OxyR 所調控，文獻報導指出：KatG 有 catalase-peroxidase 雙活性，過氧化氫酶

（peroxidase）可以將 R 氫基團及過氧化氫轉變成兩分子的水（RH2 + H2O2 → R +

2H2O）（3、39、81）。上述的酵素皆可以清除掉極具破壞性的 ROS，保護細菌免

5

5. 二級信使 Cyclic-di-GMP

Bis-（3'-5'）-cyclic dimeric GMP（c-di-GMP）為細菌體內的二級信使（second

messenger），控制細菌的各種表現，包含細菌的能動性（motility）、線毛的表現

（fimbriae expression）、生物膜的形成（biofilm formation）以及細胞週期的程序

（cell cycle processes），對於細菌的毒性扮演著重要的角色（34）。文獻報導說明：

在 E. coli 中，c-di-GMP 含量的多寡，會去改變某些基因的轉錄活性（transcription

activity），進而造成轉錄調控者（transcription regulators）的基因表現，而這些調

控者與 CPS 的合成、抗氧化反應的表現及攝取鐵的系統（iron uptake system）息 息相關（54）。

C-di-GMP 含量的多寡，由 GGDEF、EAL 及 HD-GYP domain 來決定，GGDEF domain 有雙鳥苷酸環化酶（diguanylate cyclase, DGC）的活性，可以將兩個 GTP 環 化 形 成 c-di-GMP ， 而 EAL 及 HD-GYP domain 則 含 有 磷 酸 二 酯 酶

（phosphodiesterase, PDE）的活性，會將 c-di-GMP 分解（77、78）。近來有研究

報導顯示：c-di-GMP 與 PilZ-domain 的相互作用會影響到下游基因的表現（5、 15、55、71）。屬於第三型線毛基因組的 MrkH，即是一個含有 PilZ domain 的蛋 白質，會和 c-di-GMP 相互作用，進而影響許多基因表現。 6. 具體目標 本論文將探討克雷白氏肺炎桿菌 CG43 在氧化壓力下的反應。首先，我們將 分別建構 sodA、sodB、sodC、katE、katG 和 rpoS 基因缺損突變株，再將這些基 因缺損突變株經過 paraquat（PQ）或 H2O2處理，分析在不同類型的氧化壓力攻 擊下，sodA、sodB、sodC、katE、katG 或 rpoS 的基因缺損是否影響其抗氧化的 能力。接著，我們將針對基因缺損影響最大的基因做更深入的研究，包括：建構

LacZ-報導系統（reporter system）、利用即時聚合酶連鎖反應（quantitativeReal time

PCR, qRT-PCR）探討是否受到過氧化逆境相關的調控分子所調控；同時，針對 特定目標基因產物分析其生物活性，如在細胞的位置與其生化活性的相關性。

6

另外探討一些與過氧化逆境相關的調控分子在抗氧化或抗酸作用的調控角

色：包括（1）SoxRS；（2）YjcC 蛋白，其 N 端帶有 CSS motif，歸屬 EAL domain

蛋白家族，其 C 端含有功能性的 EAL domain，可以分解 c-di-GMP，造成 c-di-GMP

量的下降；（3）Rcs（regulator of capsular synthesis）系統屬於雙分子系統，最早

被發現參與大腸桿菌莢膜多醣體生合成的調控（31）。我們實驗室研究發現 RcsB

調控蛋白與克雷白氏肺炎桿菌抗酸的能力相關（1），細菌的抗氧化及抗酸作用息

息相關，當 E. coli 處在酸環境時，會促使過氧化氫酶（catalase）大量產生（76）； 而乳酸球菌（Lactococcus lactis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在 酸的環境中，則會促使 sodA 基因表現，將 sodA 基因移除會使二者在酸環境下的

存活率大大下降（74）；（4）含有 PilZ domain 的 MrkH 蛋白質，可結合 c-di-GMP

進而調控下游基因表現；（5）PecSM 系統，屬於 MarR family，PecS 會與具有迴

文序列之 pecO 結合進而抑制下游基因表現，有研究顯示 MarR family 裡的成員 與抗氧化作用有關，膿桿菌（Agrobacterium tumenfaciens）PecS 會與尿酸鹽（Uric acid）結合，產生構型改變而無法與 pecO 結合，使原本被抑制的基因可以表現

（69、70）；而在伊文氏桿菌（Erwinia）中，PecM 可以將 PecS 所調控的抗氧化

7

二

、

材料與方法

1. 菌株 本研究的克雷白氏肺炎桿菌 CG43 為長庚紀念醫院林口分院的臨床分離 株，而 CG43S3 是由實驗室學姐篩選獲得具有鏈黴素（streptomycin）抗性的突 變株（13、47）；另外，CG43S3ΔryhB、CG43S3ΔfurΔryhB 由中國醫藥大學林靖 婷教授實驗室提供。本實驗上所使用的菌株及質體詳列於表一及表二。所有菌株 於已加入適量抗生素的 Luria-Bertani（LB）培養液或培養基，經震盪培養於 37°C； 使用的抗生素及濃度分別為：鏈黴素 500 g/ml、氨比西林（ampicillin）100 g/ml、 卡那黴素（kanamycin）25 g/ml、四環黴素（tetracycline）12.5 g/ml 及氯黴素 （chloramphenicol）35 g/ml。 2. 基因重組技術 基因重組實驗參考標準流程（73）。PCR 所使用的引子（primer）由生工公

司（MDBio, Inc, Taiwan）合成並詳列於表三；而 PCR 使用的酵素為 Blend Taq DNA

polymerase（TOYOBO, Japan）及 Taq DNA polymerase（MDBio）；PCR 產物及

DNA 片段則使用 Gel/PCR DNA Fragments Extraction Kit（Geneaid, Taiwan）抽取。 質體 DNA 使用 High-Speed Plasmid Mini Kit（Geneaid）抽取；RNA 使用 RNeasy Mini Kit（QIAGEN）抽取；限制酵素及 DNA 修飾酵素分別由 New England Biolab （Beverly, MA）或 MBI Fermentas（Hanover, MD）購置，且依照供應商建議的 方式使用。

3. 生物資訊的分析

相關基因的比較分析是利用 NCBI 網站或 Vector NTI 軟體；啟動子的預測以 Softberry（http://linux1.softberry.com/all.htm）或 Bioinformatics @ MolGen ppp （http://bioinformatics.biol.rug.nl ） 分析； 預 測 RNA 雜 交區域 構 型 序列經由

8 RNAhybrid（http://bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de）軟體分析。 4. 基因缺損突變株的建構 首先利用 PCR 增幅目標基因的上下約 1000 bp 的 DNA，將前後兩片段結合 後接入自殺性載體 pKAS46（80），再將此重組質體以電穿孔（electroporation） 送入 E. coli S17-1 λpir，以接合作用（conjugation）將此質體送入 CG43S3 中，並 以含有 kanamycin 及 ampicillin 的 M9 固態培養基篩選經由同源互換作用而插入 染色體的 transconjugants。接著，隨機挑選幾顆單一 transconjugant 菌落於 LB 培 養液 37°C 隔夜培養後，先以 PCR 確認該質體插入染色體中，再取 75 l 菌液於 含有 streptomycin 的 LB 培養液 37°C 培養 8 小時後，系列稀釋至 10-6 _{倍，取 100} l 的菌液均勻的塗抹在含有 streptomycin 的 LB 固態培養基上培養隔夜，最後以 滅菌牙籤隨機挑選至少 50 顆單一菌落，分別劃開於含 streptomycin、含 kanamycin 和 ampicillin 的 LB 固態培養基上，挑選出具 streptomycin 抗性但對 kanamycin 及 ampicillin 敏感的菌落，最後再利用 PCR 檢查，並以挑選出的總菌落數及成功剔 除基因的菌落數算出重組互換成功的機率。

5. 生長曲線量測

細菌在 LB 培養液中培養隔夜後，以 200 倍稀釋至 LB 培養液中，再置於 37°C 培養，每隔 2 小時即測量其在波長 600 nm 下的吸光值；或以菌落形成單位（colony

forming units, CFU）標示：即每隔 2 小時取 100 l 菌液經適當系列稀釋後，均勻

塗抹在 LB 固態培養基上，37°C 隔夜培養後數菌落數；每次獨立實驗以三重覆數 據換算出平均值及標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中較具代表性的一次。

6. 生物膜染色

細菌在 LB 培養液中培養隔夜後，以 200 倍稀釋至 4 ml LB 培養液中，再於 37°C 靜置培養 24 小時，小心去除菌液後以一次水清洗兩次，再加入 4 ml 1％結

9

晶紫，以每分鐘 60 轉（revolution per minute, rpm）震盪處理五十分鐘後，再以 一次水清洗 3 次。 7. 抗氧化酵素活性染色 超氧化歧化酶活性 根據 Beauchamp 和 Fridovich 的方法（8），取 200 l 隔夜培養菌液加入 LB 培養液於 37°C 培養至 OD600約 0.6~0.8 左右，將菌液以 15000 rpm 離心 5 分鐘後 去掉上清液，再以 1 ml 0.85% saline 清洗細菌並離心去上清液，再加入 300 l pH7.0 10 mM potassium phosphate，在冰上以超音波震盪（sonication）打破菌體 至菌液澄清，最後以 Bradford 法（10）定量蛋白質後，取適量萃液（約 30 g 的

蛋白質）加入 13.5% native polyacryamide gel 以電泳分離蛋白（先以 80 V、200 mA 分離 40 分鐘，再以 150 V、200 mA 分離 160 分鐘）。經膠電泳分離後以一次水 清洗膠片，再加入 40 ml pH7.0 10 mM potassium phosphate 含 0.08 g nitroblue

tetrazolium chloride（NBT），在室溫下震盪避光清洗 20 分鐘，接著換成 40 ml pH7.0

10 mM potassium phosphate 含 0.4 g riboflavin 及 336 l TEMED 混合以日光燈 （110 V, 60 Hz, 0.3 A）照光呈色 20 分鐘，最後用一次水震盪清洗數次。 過氧化氫酶活性 本測試根據 Clare 的方法修訂（17），首先，取 200 l 隔夜培養之菌液於 LB 培養液中，37°C 培養至 OD600約 0.6~0.8 左右，將菌液以 15000 rpm 離心 5 分鐘 後去掉上清液，再以 1 ml 0.85% saline 清洗細菌，經離心去上清液後加入 300 l pH7.0 10 mM potassium phosphate，在冰上以超音波震盪打破菌體至菌液澄清， 最後以 Bradford 法定量後，取適量萃液（約 30 g 蛋白質）加入 10.8% native polyacryamide gel 以電泳分離蛋白（先以 80 V、200 mA 分離 40 分鐘，再以 150 V、200 mA 分離 160 分鐘）。經膠電泳分離後，先以一次水清洗膠片，接著用含

10

有 10 l 1M H2O2之 100 ml 二次水在室溫下震盪避光清洗 10 分鐘，再換成 50 ml

含有 2% ferric chloride 及 1 g potassium ferriccyanide 二次水混合並以日光燈（110 V, 60 Hz, 0.3 A）照光呈色 20 分鐘，最後以一次水震盪清洗數次。 8. 抗氧化壓力的能力評估 生存率測試 細菌在 LB 培養液 37°C 隔夜培養後，以 20 倍稀釋至 LB 液培養至 OD600約 0.6~0.8 左右，取 1 ml 菌液至微量離心管以 15000 rpm 離心 5 分鐘後去掉上清液， 再加入 1 ml 濃度為 10 mM 的 H2O2或 3 mM 的 PQ，培養 40 分鐘後，取出 100 l 菌液系列稀釋至 10-6 _{倍後均勻塗抹在 LB 固態培養基上於 37°C 隔夜培養後數菌} 落數。存活率是根據實驗組每 1 ml 所存活的菌數與未加入 10 mM 的 H2O2或 3 mM 的 PQ 的控制組每 1 ml 的菌數比值；每次獨立實驗以三重覆數據換算出平均值及 標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中較具代表性的一次。

紙錠分析（Disc diffusion assay）

細菌在 LB 培養液 37°C 隔夜培養後，稀釋 20 倍至 LB 液中培養至 OD600約 0.3~0.4 左右，接著用無菌棉花棒沾取菌液均勻塗抹在 M9 培養基上，接著以無 菌鑷子將紙錠置入培養基中央，再吸取 5 l 10 mM PQ 或 50 mM H2O2至紙錠上 於 37°C 正置培養隔夜。 氧化壓力下的生長測試 培養隔夜後的細菌以 200 倍稀釋至 LB 培養液中，加入不同濃度的 PQ（100、 300 或 600 M）或 H2O2（1、2 或 4 mM）後再置於 37°C 培養，每隔 2 小時測量 在波長 600 nm 的吸光值，所呈現的實驗數據為實驗組的 OD600與未加入 H2O2 或 PQ 的控制組 OD600 比值；每次獨立實驗以三重覆數據換算出平均值及標準 差，呈現的數據為三次獨立實驗中較具代表性的一次。

11 9. 基因回補質體建構 利用 PCR 增幅目標基因殖入 yT&A 載體中，經由次選殖至 pRK415（41） 廣寄主載體後以電穿孔送入 E. coli S17-1 λpir，再以接合作用轉入 CG43S3 中， 將菌液均勻塗抹在含 tetracycline 的 M9 固態培養基，37°C 培養隔夜後以滅菌牙 籤隨機挑選至少 25 顆單一菌落，分別劃於含 streptomycin、tetracycline 的 LB 固 態培養基上，最後，挑選同時具 streptomycin 及 tetracycline 抗性的菌落，以 PCR 驗證預期基因片段大小。 10. 啟動子報告質體建構 將預測的啟動子片段或截短片段以 PCR 增幅後，接入 yT&A 選殖載體中， 再轉殖至啟動子報導質體 pLacZ15（50）中，使啟動子片段與 lacZ 報導基因黏 合，再藉由β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）活性評估報告啟動子的活性。 11. β-半乳糖苷酶活性評估 大致根據 Miller 方法（56），將隔夜培養之菌液以 100 倍稀釋於 LB 培養液 中，待菌液 OD600約 0.6~0.8 左右，未加或加入稀釋後濃度為 30 M 的 PQ 培養 40 分鐘，取 100 l 的待測菌液加入含有 900 l Z buffer（60 mM Na2HPO4、40 mM

NaH2PO4、10 mM KCl、1 mM MgSO4及50 mM β-mercaptoethanol）、17 l 0.1%

SDS 及 35 l 三氯甲烷（chloroform）混合液中，並於 30°C 水浴槽靜置 10 分鐘，

隨即加入 200 l 的 4 mg/ml o-nitrophynyl, β-D-galactopyranoside（ONPG）混合均

勻靜置於 30°C 水浴槽，並開始計時至混合液變成黃色，再加入 500 l 1 M Na2CO3

終止反應後測量波長 420 nm 下的吸光值；每次獨立實驗以三重覆數據換算出平 均值及標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中較具代表性的一次。

12

12. 即時聚合酶連鎖反應測試

將培養隔夜之菌液以 100 倍稀釋分別培養於 LB 培養液、含 50 M ferric ion

和 50 M ascorbic acid 的 LB 培養液、含 200 M dipyridyl 之 LB 培養液中，待菌

液 OD600約 0.6~0.8 左右，將菌液以 13200 rpm 離心 5 分鐘後去掉上清液，再以

RNeasy Mini Kit 抽取全菌 RNA。接著將所抽出之 RNA 利用 AMV Reverse Transcriptase 及 random primer pDN 反轉錄成 cDNA 後，加入 SYBR Green PCR Master Mix 及待測基因之引子，隨即利用 PRISM 7000 HT platform（Applied Biosystems, USA）的 SDS 2.1 software 執行即時聚合酶連鎖反應。

13. 抗酸能力評估 細菌在 LB 培養液 37°C 隔夜培養後，以 20 倍稀釋至 LB 培養液中，培養至 OD600約 0.6~0.8 左右，取 1 ml 菌液，以每分鐘 15000 rpm 離心 5 分鐘後去掉上 清液，加入 1 ml pH 4.4 的 LB 培養液適應 1 小時，最後移至 pH 3.0 的 M9 培養 液中，培養 45 分鐘後，即取出 100 l 的菌液系列稀釋至 10-6倍，並均勻的塗抹 在 LB 固態培養基上，37°C 隔夜培養後數菌落數；存活率是以在 M9 培養液中培 養 45 分鐘後，每 1 ml 存活的菌數和培養 0 小時每 1 ml 菌數的比值；每次獨立 實驗以三重覆數據換算出平均值及標準差，呈現的數據為三次獨立實驗中較具代 表性的一次。 14. 細胞膜間隙蛋白質的抽取

大致根據 Neu 和 Heppel 的方法（59），依滲透壓差（Osmotic Shock）抽取

膜間隙蛋白。首先將培養隔夜之菌液，以有無 30 M PQ 處理約 40 分鐘後以 15000

rpm 離心 10 分鐘後去掉上清液，加入 1 ml osmotic shock buffer（30 mM Tris

pH7.5、20% sucrose 及 10 mM EDTA）室溫處理 1 分鐘後，隨即加入 10 g/l

13 再加入 100 l 冰的二次水或 5 mM Tris-HCl pH7.5 於冰上靜置 10 分鐘，最後以 15000 rpm 離心 10 分鐘，上清液即為細胞膜間隙的蛋白質。取適量膜間隙蛋白 萃液（約 15 g）行超氧化歧化酶活性染色。 15. 西方免疫墨點法（Western blot）分析膜間隙蛋白質 將膜間隙蛋白質等比例混合蛋白質染劑（0.0626 M Tris-HCl pH 6.8、2% SDS、10% glycerol、0.01% bromophenol blue、及 100 mM dithiothreitol），並以

95°C 加熱 10 分鐘，取適量蛋白質（約 15 g）加入 13.5% SDS-PAGE 電泳分離

蛋白（100 V、200 mA、140 分鐘）。蛋白質經膠電泳分離後，將膠上之蛋白質電

泳 100 分鐘（140 V、400 mA）轉漬到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene difluoride, PVDF; Millipore, Billerica, MA, USA）上，再以 5%的脫脂牛奶 4°C 處理隔夜，接 著加入一級抗體 anti-β lactamase 在室溫下 2 小時，再以經 5000 倍稀釋之二級抗 體 alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G（Sigma）室溫下

處理 1 小時，隨後加入呈色劑 BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate）、NBT

及 alkaline phosphatase buffer（5 mM MgCl2．6H2O 和 150 mM Tris-HCl pH9.5）

14

三

、

結果

建構 sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損突變株 為了解在克雷白氏肺炎桿菌抗氧化系統的防禦機制，我分別建構 sodA、 sodB、sodC、katE、katG 和 rpoS 基因缺損突變株。首先利用 PCR 增幅各個基因 前後約 1000 bp 的 DNA 片段，將其結合成一段後接入自殺性載體 pKAS46，分 別得到質體 pPO04、pPO08、pPO12、pPO16、pPO20 及 pPO24（表二），再以接 合作用分別將各個質體送入克雷白氏肺炎桿菌 CG43S3 中，藉同源序列重組互換 及抗生素的篩選而得到基因缺損的突變株，最後利用引子確認各個基因的缺損。 如圖一至圖六，ΔsodA、ΔsodB、ΔsodC、ΔkatE、ΔkatG、ΔrpoS 均可以 PCR 確 認各個缺損的片段，分別獲得同源序列重組互換機率為ΔsodA：6.6%、ΔsodB： 16.6%、ΔsodC：1.3%、ΔkatE：6.6%、ΔkatG：1%及 ΔrpoS：33%。 sodA、sodB、sodC、katE、katG 及 rpoS 基因缺損的影響

如圖七 A，sodA、sodB、sodC、katE 或 rpoS 基因缺損後，OD600吸光值與

WT 無明顯差異，但是 ΔkatG OD600吸光值明顯比 WT 高，進一步利用塗盤數菌 落的方式確認 katG 基因缺損後，隨著生長的時間拉長，單位菌數明顯比 WT 多 許多（圖七 B），顯示 katG 基因缺損後生長速度變快；進一步分析各個基因缺損 株外觀，如圖八 A，sodA 基因缺損後菌落變成大小不均一；katG 基因缺損後， 菌液經離心後明顯形成沉澱（圖八 B），而 sodB、sodC、katE 或 rpoS 的基因缺 損不造成細菌外觀上明顯的差異；測試各個基因缺損株的生物膜形成，發現各個 基因缺損也不影響其生物膜的形成能力（圖八 C）。 膠染色確認基因缺損影響抗氧化酵素的活性 為了量測個別抗氧化酵素基因的剔除後，克雷白氏肺炎桿菌中抗氧化酵素活 性的變化，利用超音波震盪打破菌體後，以電泳方式將總蛋白於 polyacryamide

15

膠上展開後分析膠上超氧化歧化酶及過氧化氫酶活性。如圖九 A，sodA 及 sodB 基因缺損其相對轉譯的酵素活性消失；而 sodC 基因缺損其膠染色結果與 WT、

katE 及 katG 基因缺損突變株沒有明顯差異；如圖九 B，katE 或 katG 的基因缺損，

其相對轉譯的酵素活性消失。 sodA 或 katG 基因缺損對抗氧化能力的影響 確認各個基因缺損影響抗氧化酵素的活性後，以 3 mM PQ 來測試各個基因 缺損突變株的抗氧化能力的變化，如圖十 A，rpoS 或 sodA 基因缺損株存活率明 顯比其他突變菌株的存活率較低；而以 10 mM PQ 紙錠測試，sodA 基因缺損株 的生長抑制圈也明顯比其它菌株的大出許多（圖十 B）；最後，再將各個菌株培 養於含不同濃度 PQ 的 LB 培養液中，如圖十 C，sodA 基因缺損株，無論是在含 100、300 或 600 M PQ 的 LB 培養，其生長狀況都比其他菌株差許多，而 rpoS 或 sodC 基因缺損株在 600 M PQ 培養液培養下也有明顯影響。 如圖十一 A，以 10 mM H2O2添加於 LB 培養液中，katG 基因缺損株的存活 率明顯的比其他菌株較低，而 rpoS、sodA 或 katE 基因缺損株的生存率也稍低； 以含有 50 mM H2O2紙錠處理，katG 基因缺損株的抑制圈比其它菌株明顯大許多 （圖十一 B），而 sodA 基因缺損株的抑菌圈，比 WT 稍微大些；如圖十一 C，將 各菌株培養在含有不同濃度的 H2O2 LB 中，katG 基因缺損株，在 1、2 或 4 mM H2O2 培養液的生長狀況都比其他菌株差許多，rpoS 基因缺損株則是在 2 或 4 mM H2O2 培養液培養下有明顯差異，而ΔsodA、ΔsodB、ΔsodC 或 ΔkatE 在 4 mM H2O2培 養液培養下也有明顯差異。 sodA 及 katG 基因回補實驗

如圖十二 A，disc diffusion assay 顯示利用 pRK415 載體回補 katG 基因至 katG 基因缺損株後使抑菌圈縮小許多；而膠電泳染色結果也發現回補 katE 或 katG 基 因後在膠上可染色定位 KatE 或 KatG 的活性（圖十二 B）。如圖十三 A，利用

16

pRK415 載體回補 sodA 基因至 sodA 基因缺損株後，發現菌落的大小不一會回復 到與 WT 相同的大小均一，確認了 sodA 基因缺損株菌落大小不一是因 sodA 基因 剔除造成；而 disc diffusion assay 也顯示回補 sodA 基因使抑菌圈小許多（圖十三

B）；最後，膠電泳染色結果也發現回補 sodA 或 sodB 基因後在膠上可染色定位

SodA 或 SodB 的活性（圖十三 C）。

sodA 啟動子活性分析

接著以 Softberry 分析 sodA 基因上游非轉譯區的序列（圖十四 A），發現 ArcA

binding box，而以目測分析發現 pecO-like sequence 及 Fur binding box，再進一步 以 RNAhybrid 分析找到 small RNA RyhB 與 sodA 啟動子的 binding sequence（圖 十四 B），並可預測其結合的構型（圖十四 C）。

進一步以此分析結果為依據建構了含三種不同長度 sodA putative promoter PsodA1、PsodA2、PsodA3分別與 LacZ 報導系統結合的質體，如圖十五 A，PsodA2少了

RNAhybrid 軟體預測的 RyhB 結合序列，而 PsodA3只包含 Fur binding box。Fur 曾

被證明會調控 sodA 的表現（33、83）；而在膿桿菌中證實 PecS 會與具有迴文序

列之 pecO 結合進而抑制下游基因表現（69、70）。進一步測試 sodA 啟動子活性，

結果如圖十五 B，無論在有無 PQ 的處理下，相較於 PsodA1，PsodA2活性增加了十

至二十倍；sodA 啟動子活性在 Δfur 或 ΔfurΔryhB 中明顯大於其他菌株，但

ΔfurΔryhB 在 PsodA1下的活性明顯比Δfur 還低，且在 ΔryhB 中活性也是較低，而

在 PsodA2或 PsodA3則無此現象；另外在 pecS 基因缺損情況下無經過 PQ 的處理，

PsodA1或 PsodA2活性有稍低的現象。

Fur 或 RyhB 對 sodA 基因表現的影響

接著利用即時聚合酶連鎖反應來測試 Fur 或 RyhB 對於 sodA 的基因表現是 否有影響，結果如圖十六，當 fur 基因剔除後，sodA 表現量明顯增加，將 WT 培 養於富含亞鐵離子的 LB 培養液後，sodA 表現量明顯下降，而將 WT 培養於含亞

17

鐵離子螯合劑 dipyridyl 的缺鐵 LB 培養液後，sodA 表現量明顯上升；另外，將

fur 及 ryhB 雙基因剔除後，sodA 表現量比 fur 單一基因剔除後明顯降低許多，而

利用載體攜帶 ryhB 基因至各菌株後，sodA 表現量有明顯的上升。 RpoS、SoxRS、YjcC、MrkH 或 RcsB 在調控 sodA 的路徑上扮演角色 為了解過氧化逆境相關的調控分子 soxRS、yjcC、mrkH 或 fur 在氧化壓力下 的重要性，測試各個基因缺損株的抗氧化能力的結果如圖十七 A，在 3 mM PQ 處理下，ΔsoxRS、ΔyjcC 或 ΔmrkH 存活率都比野生株低，而 Δfur 卻無明顯影響； 由（B）、（C）圖可知將 soxRS、yjcC 或 mrkH 基因剔除後，在含 10 mM PQ 紙錠 LB 培養基上，ΔsoxRS、ΔyjcC 或 ΔmrkH 的抑菌圈比野生株的抑菌圈要大。另外 為了探究與過氧化逆境相關的調控分子 rpoS、soxRS、yjcC、mrkH、rcsB 基因缺 損突變株是否會參與 sodA 的表現調控，將利用 LacZ 報導系統來做測試，結果 如圖十八：在 rpoS、soxRS、yjcC、mrkH 或 rcsB 基因缺損情況下，PsodA1的活性 有降低的現象。 rpoS、sodA、katG、yjcC 或 rcsB 基因缺損對抗酸能力的影響 許多文獻報導顯示，細菌體內的抗氧化與抗酸機制息息相關（11、74、76）， 所以，我們也將測試與過氧化逆境相關的調控分子及抗氧化酵素基因缺損突變株 的抗酸能力，結果如圖十九：當各個基因缺損突變株在 pH 3.0 的 M9 培養液培 養後，rpoS、sodA、katG、yjcC 或 rcsB 基因缺損後的存活率明顯下降，而 fur 基 因缺損後則相反。 SodA 的 N 端氨基酸序列比對 最近報導，根瘤菌及大腸桿菌 SodA 缺乏訊號胜肽，仍可靠 N 端 10 個氨基 酸以 SecA-dependent 方式，將 SodA 由細胞質送到細胞膜間隙（44）。我們利用 VectorNTI 軟體比較發現克雷白氏肺炎桿菌 SodA、SodB 與大腸桿菌及根瘤菌

18

SodAN 端 10 個氨基酸相似度很高（圖二十 A），暗示著克雷白氏肺炎桿菌 SodA

或 SodB 可藉 SecA-dependent 方式分泌至細胞膜間隙；同時比較 SodC 發現

SodA、SodB 與含有訊號胜肽的 SodC N 端氨基酸差異度極大（圖二十 B）。

SodA、SodB 和 SodC 皆會出現在細胞膜間隙

將不同的菌株分別有無經過 30 M PQ 處理後，再利用滲透壓差（59）抽取

細胞膜間隙蛋白，接著以 13.5% native polyacryamide gel 以電泳分離蛋白，並行 膠染色分析超氧化歧化酶活性。結果如圖二十一，在 LB 液培養下，WT 的 SodA 及 SodB 的酵素活性皆有出現在膜間隙，sodA 及 sodB 基因缺損株在膜間隙的相 對酵素活性消失，而 SodA 及 SodB 的酵素活性可在 sodC 基因缺損株中發現；經

過 30 M PQ 處理後，膜間隙的 SodC 酵素活性在 sodA 基因缺損的情況下明顯表

現，在膠上的位置與 SodA 相近。此實驗在菌株培養至 stationary phase 或 log phase

（OD600約 0.6~0.8）時結果相同。我們同時利用西方免疫墨點法來針對細胞膜間

隙的標記β lactamase 進行呈色分析，結果可以看到膜間隙蛋白的 anti-β lactamase

19

四

、

討論

地球上由氧、氮所造成的氧化壓力環境處處可見，細菌除了環境的氧化壓力 外，還有體內形成的氧化壓力，感染宿主時也會面臨相當大的超氧自由基的攻擊 （26、38），為了適應環境而生存，細菌對抗氧化壓力的防禦機制因而相當重要。 在有氧環境中，研究較透徹的是 SoxRS 及 OxyR 抗氧化機制的調控系統（7、 61），而在無氧情況下，以 Fnr 及 ArcAB 為主要調控系統（20、52），當這些調 控分子在感受到氧化壓力的威脅時，即促使抗氧化酵素的產生。克雷白氏肺炎桿 菌中，主要的抗氧化酵素為超氧化歧化酶 SodA、SodB 及 SodC、過氧化氫酶 KatE 及 KatG，這些抗氧化酵素在大腸桿菌裡已有許多相關研究，而在克雷白氏肺炎 桿菌則相對較少。本研究發現 katG 基因剔除後，生長速度明顯變快且菌體較容 易被離心沉澱、菌落黏性明顯的降低，由此推測 katG 基因缺損可能降低其莢膜 生成量，細菌因不用耗費能量去生合成莢膜而使生長速度變快；而 sodA 基因剔 除後，菌落型態變成大小不一，這些改變可能為一相位變化（phase variation）。 已知，細菌在惡劣環境或處於較不好的狀況時，可藉由相位變化改變本身的型態 而存活（87）。因此，我們推測 sodA 或 katG 基因剔除使菌株對抗氧化壓力的能 力降低而累積 ROS，ΔsodA 或 ΔkatG 突變株為了生存而改變其外膜或莢膜組成 以避免 ROS 攻擊。

RpoS 是一 stationary phase 的 sigma factor，負責調控許多基因的表現，其中 也包含了抗氧化酵素的調控（2、23、24）。克雷白氏肺炎桿菌 CG43 的 rpoS 基

因被剔除後，在 PQ 或 H2O2處理下的生存率明顯降低；除ΔrpoS 外，sodA 和 katG

基因的缺損對於克雷白氏肺炎桿菌的抗氧化能力有較大的影響，另外我們利用不

同濃度的 PQ 或 H2O2來測試各個基因缺損後的生長情形，結果可以看到 ΔsodA

在 100M PQ 或 ΔkatG 在 1 mM H2O2處理下，生長明顯受到影響，而當 PQ 濃

度提升至 300M 或 600M 後，ΔrpoS 和 ΔsodC 生長情形也明顯較差；當 H2O2

20

ΔsodB 和 ΔkatE 生長也受到明顯影響，以上實驗結果暗示著：雖然我們利用不同 的抗氧化能力測試方法及回補實驗均確認克雷白氏肺炎桿菌主要以超氧化歧化

酶 SodA 來對抗 O2•¯、過氧化氫酶 KatG 對抗 H2O2，但 RpoS、SodB、SodC 或

KatE 可能在不同環境或不同濃度的氧化攻擊下扮演著重要角色，藉由不同的抗

氧化酵素間的相互合作，消滅各種氧化威脅才可存活下來。

大腸桿菌 sodA 基因為 SoxRS 及 Fur 所調控（19、33、83），而我們分析 sodA

基因啟動子序列，發現 ArcA binding box、pecO-like sequence、Fur binding box 及 small RNA RyhB 的 binding sequence。我們依啟動子分析的結果建構了三種含 不同長度的 sodA putative promoter PsodA1、PsodA2、PsodA3的 LacZ 報導質體，活性

分析結果顯示無論在有無 PQ 的處理下，Fur 會抑制 sodA 基因表現、RyhB 則促

進 sodA 表現，另外當 ΔpecS 未以 PQ 處理的情況下，PsodA1和 PsodA2活性比起 WT

有稍低的情形，顯示 PecS 在一般正常情況下可能會影響 sodA 的表現，但並不是 很主要的調控者。

進一步以 qRT-PCR 確認 Fur 與 RyhB 對 sodA 基因的調控關係。在鐵離子濃 度充足情況下，ryhB 會被 fur 抑制（89），只有在 fur 基因缺損時 ryhB 基因始有

表現；比較 Δfur 及 ΔfurΔryhB 突變株，可發現在 fur 基因缺損下，sodA 基因的

表現量明顯上升，而在ΔfurΔryhB 突變株中，sodA 的表現比起 Δfur 則明顯下降；

大量表現 ryhB 基因後也可以觀察到 sodA 基因的表現明顯上升。Fur 的調控作用

與亞鐵離子（Fe2+_{）濃度有關，Fur 與亞鐵離子結合後的活性複合體才會結合 Fur}

box 序列，進而抑制下游基因的表現（89）。所以，將 CG43S3 培養在富含亞鐵

離子的環境下，Fur 活性上升而 sodA 基因表現量下降；當環境缺乏亞鐵離子時，

sodA 基因表現量則上升。綜合 LacZ 報導系統及 qRT-PCR 的結果顯示：Fur 經由 sodA 啟動子上 Fur box 扮演 repressor 角色（圖二十二黑色路徑）；sodA 啟動子上

的 RyhB binding sequence 的二級結構會抑制 sodA 基因表現，而 RyhB 結合這段

序列打開二級結構後間接促使 sodA 基因表現（圖二十二藍色路徑）。此外，文獻

21

mRNA 上，促使 sodB mRNA 降解，抑制 sodB 的表現（53、95）（圖二十二紅色

路徑）。

大腸桿菌 sodA 由 SoxRS 所調控（19），而在 PQ 的處理下，ΔsoxRS、ΔyjcC、

ΔmrkH 的生存率測試或紙錠分析均顯示抗氧化能力降低，而 Δfur 則無明顯改變， 由 LacZ 報導系統的結果可以看到，在 ΔrpoS、ΔsoxRS、ΔyjcC、ΔmrkH 或 ΔrcsB 下的 sodA 啟動子活性，與 WT 比較起來有降低的情形，此暗示著 RpoS、SoxRS、 YjcC、MrkH 或 RcsB 可能在調控 sodA 的路徑上扮演角色。 許多文獻報導說明細菌的抗氧化與抗酸機制息息相關，在乳酸球菌和金黃色 葡萄球菌中，SodA 已被證明與抗酸能力有關（74），而在大腸桿菌裡的過氧化氫 酶，也被證實與抗酸能力相關（76）；CG43S3 抗酸能力測試發現 rcsB 基因剔除 後，其抗酸的能力明顯下降，rcsB 參與莢膜多醣體生合成的調控，與克雷白氏肺 炎桿菌的抗酸能力相關（1、31），我們利用 LacZ 報導系統的結果可以看到 rcsB 基因缺損後，sodA 啟動子活性降低，顯示 RcsB 可能會調控 sodA 的表現，除了 ΔrcsB 外，與抗氧化逆境相關的 rpoS、sodA、katG 或 yjcC 基因剔除後，其抗酸 的能力也明顯下降，這些結果暗示著：克雷白氏肺炎桿菌裡的抗氧化及抗酸機制 也有相當的關聯性。另一方面，將 rcsB 基因剔除後，其莢膜生成量降低，且抗 酸的能力明顯下降，katG 基因剔除後，與此結果相似，而將 fur 基因剔除後，莢 膜的生成量大增，且其抗酸的能力變強；克雷白氏肺炎桿菌的莢膜為重要的致病 因子（4、57、62、67、91），實驗結果暗示著克雷白氏肺炎桿菌的抗酸能力與其 莢膜的生合成量有關聯，但其作用機制還不清楚。 在大腸桿菌及根瘤菌中，不含訊號胜肽的 SodA 可靠 N 端 10 個氨基酸以 SecA-dependent 方式，將 SodA 由細胞質送到細胞膜間隙（44）。而一樣缺乏訊 號胜肽的 SodB，也被認為會出現在大腸桿菌的膜間隙（79）。我們發現克雷白氏

肺炎桿菌的 SodA 及 SodB 與大腸桿菌及根瘤菌的 SodA 有相似的 N 端序列，也 發現 SodA、SodB 和 SodC 皆會出現在細胞膜間隙，此結果暗示著克雷白氏肺炎 桿菌 SodA 或 SodB 也藉 N 端 10 個氨基酸以 SecA-dependent 方式送至膜間隙；

22

另外，我們也發現 SodC 須先經 30 M PQ 處理後，才能明顯觀察到其酵素活性，

此結果暗示著在一般生長情況下 SodA 及 SodB 會出現在細胞質及膜間隙中，而

當環境中 O2•¯增加時，sodC 才表現而被送至細胞膜間隙中。

SodC 為在 stationary phase 才會有表現的蛋白，且在無氧的狀況下被 Fnr 所

抑制（29、30、43）。但是，我們將菌株培養在有氧的情況至 stationary phase 時，

未以 PQ 處理看不到 SodC 表現（圖二十一），而當菌株培養至 log phase（OD600

約 0.6~0.8）再經 PQ 處理後，即可以膠染色方式在 ΔsodA 下看到 SodC 表現，這 些結果暗示著在克雷白氏肺炎桿菌超氧化歧化酶 SodC 的表現是必須有氧化壓力

（O2•¯）才會被誘導表現。沙門氏菌有 SodCI 及 SodCII，其 sodC 基因的表現也

由 O2•¯誘導，但 SodCI 扮演較重要的角色，並會促使過氧化氫酶表現（45、86）。 克雷白氏肺炎桿菌 sodC 基因缺損後，利用酵素活性染色分析可以看到，在 巴拉刈的攻擊下膜間隙 SodA 的表現明顯比 SodB 增加，且實驗室利用轉錄體 （transcriptome）分析結果也顯示當 CG43S3 經過 PQ 處理後，sodA 基因的表現 約為原本的 4.3 倍，代表大量外來的 O2•¯也會促使 sodA 基因表現上升。相對於 大腸桿菌 sodA 只在有氧的環境且受到體內的 O2•¯誘導而表現（19、22），我們的 結果顯示克雷白氏肺炎桿菌 SodA 不僅僅負責消滅細菌體內的 O2•¯，也參與了對 抗外來的 O2•¯，而 SodC 只負責細胞膜間隙的部分。

有文獻報導 sodB 是有氧及無氧環境下的 houeskeeping 基因（48），會受 Fur

促進及 RyhB 的抑制（53、95），由 PQ 測試結果發現將 sodB 基因剔除後，對細 菌抗氧化壓力的存活率影響不大，且對抗酸能力也無明顯影響，這結果與大腸桿 菌 SodB 相同（11），但這些實驗均在有氧環境下測試，因在無氧環境下 SodA 及 SodC 皆不表現（20、22、30），所以，我們相信 SodB 在無氧環境下扮演重要的 抗氧化壓力角色。 細菌體內的調控路徑複雜，在不同的環境、不同的生長階段或面臨不同的刺 激，其所負責的調控分子或是感應的路徑可能不一樣，經由不同分子之間的交互 作用而促使產生特定的蛋白質來對抗氧化壓力。而從我們的實驗結果知道：克雷

23

白氏肺炎桿菌超氧化歧化酶 SodA 在對抗 O2•¯中扮演重要的角色，sodA 基因的表

現可被 Fur 抑制或被 small RNA RyhB 促進，且與環境中鐵離子濃度息息相關， small RNA 通常扮演負向調控角色，但近來也有文獻報導其正向調控的機制 （68、72），本研究的結果就是個例子，但其調控方式必須再更深入研究。

24

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