結果 - 中國醫藥大學機構典藏 China Medical University Repository, Taiwan:Item 310903500/52142

(一) CA 在 6-OHDA 處理下對 SH-SY5Y 神經細胞之其細胞存活率之影響

由 MTT 方法結果所示(圖一)，SH-SY5Y 細胞以 100 μM 6-OHDA 單獨處理 18 小時顯著地降低 38.3%細胞存活率，而在有 1 μM CA 預處理 8 小時下，則能提高 23.4%細胞存活率(p<0.05)，而 CA 的單獨處理則不會影響細胞存活率。

(二) CA 在 6-OHDA 處理下對 SH-SY5Y 神經細胞凋亡相關蛋白質之影響

由 westerb blot 結果發現單獨以 6-OHDA 處理顯著地降低 Bcl-2/Bax 的比例(圖 二)，而在有 CA 預處理的組別則能顯著地提高 Bcl-2/Bax 的比例；而在 caspase 與 PARP 蛋白質部分，6-OHDA 會增加 cleaved caspase 3 和 cleaved PARP 的蛋白表現，

並降低 caspase 3 和 PARP 的蛋白表現(圖三)，以 CA 處理則能顯著地減少 caspase 3 和 PARP 的裂解比例(p<0.05)。由以上結果可知 CA 有抗凋亡的功能。

(三) CA 在 6-OHDA 處理下對 SH-SY5Y 神經細胞抗氧化酵素相關蛋白質之影響 PD 的發展與氧化壓力有關(Chen et al., 2012)，我們也進一步探討 CA 是否能透過增加抗氧化酵素而保護 6-OHDA 所誘導的細胞損傷。結果如圖四所示，SH-SY5Y 神經細胞單獨處理 6-OHDA 會降低 GCLC、GCLM、GPx、GSR 和 SOD 的蛋白質表現，CA 預處理則能顯著地回復 GCLC、GCLM、GPx、GSR 和 SOD 的蛋白質表現，

與 6-OHDA 組別相比較，分別增加為 1.3、0.9、0.7、0.3 和 0.7 倍，因此我們也認為 CA 也可能透過誘發抗氧化酵素達到神經保護效果。

(四) CA 在 6-OHDA 處理下對 SH-SY5Y 神經細胞蛋白酶體活性的影響

氧化壓力會導致蛋白質的錯誤折疊，降低蛋白酶體活性(Pickering and Davies, 2012)，因此我們將探討 6-OHDA 的處理是否會影響蛋白酶體活性，結果如圖五所示，以 6-OHDA 處理 12、18 和 24 h，會使細胞的蛋白酶體活性降低，其中以 18 和 24 h 最明顯(圖五 A)。而在 CA 是否具有改善 6-OHDA 降低的蛋白酶體活性，我們則發現細胞以 CA 預處理 8 小時能顯著地回復 19.2%的蛋白酶體活性(圖五 B)。因此，我們認為 CA 可能透過提高蛋白酶體活性去改善由 6-OHDA 所引起的神經傷害。

(五) 不同 CA 時間點對 SH-SY5Y 神經細胞 PINK1 和 parkin 蛋白質之影響 蛋白質的突變也與 PD 的進展有關，其中 parkin 蛋白所扮演的角色是泛素蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system)中的連接酶 E3(ubiquitin protein ligase E3)，主要辨識錯誤摺疊的蛋白質，再將其送至蛋白酶體進行降解(Trempe and Fon, 2013)。

有文獻指出 PINK1 會活化 parkin 進而調控神經保護作用(Sha et al., 2010)，因此我們也將探討 CA 是否能夠透過 parkin 達到神經保護功效。由 westerb blot 結果(圖六)發現在 CA 處理 0.5 h 至 12 h 皆能誘發 PINK1 的蛋白質表現，其中以 3 小時最強，

而 parkin 蛋白則在 0.5 和 1 小時會顯著地誘發 (p<0.05)，在 12 小時則與控制組無顯 著差異。因此由以上結果可得知 CA 的處理之下能誘導粒線體保護相關蛋白 parkin 和 PINK1 的蛋白質表現。

(六) 不同 6-OHDA 時間點對 SH-SY5Y 神經細胞 PINK1 和 parkin 蛋白質之影響 由圖七結果發現，以 6-OHDA 處理會隨時間顯著地降低 parkin 和 PINK1 的蛋白質表現，而以 24 小時降低 parkin 的蛋白質表現為最顯著。

(七) CA 對 SH-SY5Y 神經細胞 PINK1 和 parkin 蛋白質之影響

進一步我們將探討 CA 是否能夠改善 6-OHDA 所降低的 parkin 及 PINK1 的蛋白質表現降低，如圖八結果所示，SH-SY5Y 細胞單獨處理 6-OHDA 顯著地降低 parkin 及 PINK1 的蛋白質表現，而在有 CA 預處理的組別則能顯著地提高 parkin 及 PINK1 的蛋白質表現(p<0.05)。因此我們認為 CA 能夠回復 6-OHDA 所降低的 parkin 及 PINK1 蛋白質，而增加細胞保護機制。

(八) CA 對 SH-SY5Y 神經細胞 p65 蛋白質之影響

Parkin 的神經保護作用也可能透過 IκB kinase (IKK)/NF-κB 的路徑，而增加下游促存活基因的表現(Henn et al., 2007)，因此將進一步探討 CA 在 6-OHDA 處理下，

是否也影響 NF-κB 的蛋白質表現。由圖九結果顯示 SH-SY5Y 神經細胞單獨處理 6-OHDA 會顯著地降低 p65 的蛋白質表現，而 CA 預處理則能顯著地回復 p65 的蛋白質表現，單獨的 CA 處理則不影響 p65 蛋白表現。

(九) CA 透過 parkin 達到神經保護功效

為了進一步確認 CA 是否藉由調節 parkin 而有神經保護之功效，我們利用 parkin siRNA 來觀察 CA 對 6-OHDA 引起 SH-SY5Y 神經細胞凋亡蛋白的影響，首先，將細胞以 parkin siRNA 進行轉殖 24 h 後，再以 CA 預處理 8 小時，之後再與 6-OHDA 共處理 18 小時，結果由圖十所示，在 si-control 的組別，6-OHDA 會顯著地增加 caspase 3 和 PARP 裂解及降低 parkin 的蛋白質表現，預處理 CA 則會減少 caspase 3 和 PARP 裂解及增加 parkin 的蛋白質表現，但經 parkin siRNA 轉殖後，CA 的降低

作用便會消失，因此，CA 可能透過 parkin 蛋白而減少 6-OHDA 引起的神經細胞凋亡，以達到神經保護效果。

(十) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠運動量之影響

接下來我們則以動物實驗來觀察 CA 對於右側紋狀體注射 6-OHDA 誘發 PD 模

式大鼠其活動量的影響，運動測量時間共為 15 分鐘，結果發現 6-OHDA 損傷組(L) 的大鼠活動時間和活動距離顯著低於假手術組(圖十一)，而在預處理 CA 的組別 (CA+L)與損傷組(L)組相比則能增加大鼠活動時間和活動距離，分別為 27%和 33%。

(十一) CA 在 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠對於 apomorphine 誘發對側旋轉的影響 由圖十二結果顯示，與假手術組比較， 6-OHDA 損傷組(L)的大鼠明顯地增加由 apomorphine 引起的對側旋轉圈數和旋轉時間，而有 CA 預處理(CA+L)的大鼠，則 能顯著降低大鼠旋轉圈數和旋轉時間(p<0.05)。

(十二) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠腦部黑質 GSH 含量和脂質過氧化物之影響 在 6-OHDA 誘發 PD 的模式中，我們發現單獨注射 6-OHDA 的組別(L)其 GSH 的含量顯著地減少，而在有 CA 預處理的組別(CA+L)則能顯著增加 GSH 的含量 (p<0.05) (圖十三)。而在腦部脂質過氧化物方面，結果則發現 6-OHDA 的大鼠(L)顯 著地增加黑質脂質過氧化物，而在有 CA 預處理的大鼠(CA+L)則能降低腦部黑質脂 質過氧化程度(p<0.05) (圖十四)，顯示大鼠給予 CA 能改善由 6-OHDA 所引起的氧化 壓力。

(十三) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠腦部紋狀體抗氧化酵素相關蛋白之影響 根據之前細胞實驗的結果顯示，6-OHDA 的處理會降低抗氧化酵素相關蛋白質的表現，若有 CA 的預處理則能回復抗氧化酵素的降低，也因此在動物模式之下，

也以 westerb blot 方法檢測 CA 對由 6-OHDA 誘導 PD 模式大鼠腦部紋狀體中抗氧化酵素的蛋白質表現。其結果發現到單獨注射 6-OHDA (L)顯著地降低 GCLC、

GCLM、GSR 和 SOD 的蛋白質表現(圖十五)，而在有 CA 預處理的組別(CA+L)則能 顯著地增加 GCLC、GCLM、GSR 和 SOD 的蛋白質表現(p<0.05)。

(十四) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠腦部紋狀體凋亡蛋白質之影響

由圖十六發現動物實驗結果與細胞實驗相類似，6-OHDA 損傷組(L)比假手術組相顯著地降低 Bcl-2/Bax 的比例，而在有 CA 預處理的組別(CA+L)則能顯著地提高 Bcl-2/Bax 的比例；而在 caspase 與 PARP 蛋白質部分，6-OHDA 損傷組(L)的大鼠會增加 cleaved caspase 3 和 cleaved PARP 的蛋白表現，並降低 caspase 3 和 PARP 的蛋白表現(圖十七)，處理 CA 的組別(CA+L)則能顯著地減少 caspase 3 和 PARP 的裂解 比例(p<0.05)。由以上結果可知，CA 無論在體內或體外實驗皆具有抗凋亡的作用。

(十五) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠腦部紋狀體 TH 蛋白質之影響

TH 是合成多巴胺的限制酵素(Ren et al., 2013)，我們以 Western blot 方法檢測 CA 在 6-OHDA 誘導 PD 模式大鼠腦部紋狀體中 TH 蛋白質的表現。其結果發現單獨注射 6-OHDA (L)顯著地降低 TH 的蛋白質表現，而在有 CA 預處理的組別(CA+L) 則能顯著地增加 95 %的 TH 蛋白質表現(p<0.05) (圖十八)，由此可看出 CA 有改善腦 部 TH 的功能。

(十六) CA 對 6-OHDA 誘發 PD 模式大鼠腦部紋狀體 PINK1 及 parkin 的蛋白質之 影響

在 6-OHDA 誘發 PD 的模式中，我們發現單獨注射 6-OHDA 的大鼠(L)顯著地降低腦部紋狀體的 PINK1 和 parkin 的蛋白質表現(圖十九)，而在有 CA 預處理的組別 (CA+L)則能回復 PINK1 和 parkin 的蛋白質表現(p<0.05)，由此可得知 CA 在體內或 體外皆能誘發 PINK1 和 parkin 等神經保護相關蛋白質的表現。

CA — — ＋＋ 6-OHDA

Figure 1. Protective effect of carnosic acid (CA) against 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-induced toxicity in SH-SY5Y cells. Cell viability was measured by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim bromide (MTT) assay. Cells were pretreated with 0.1% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The level in control cells was regarded as 100

%. Values are expressed as the means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

— ＋＋ —

Bcl-2 →

Bax →

β-actin →

Figure 2. Effect of carnosic acid (CA) on the protein expression of Bcl-2 and Bax in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells. Cells were pretreated with 0.1

% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The protein was determined by Western blotting. Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are

means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

6-OHDA — ＋＋ —

— — ＋＋

caspase-3 →

cleaved caspase 3 →

Figure 3. Effect of carnosic acid (CA) on the protein expression of caspase 3 and PARP in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells. Cells were pretreated with 0.1% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The protein was determined by Western blotting.

Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are cleaved caspase 3/caspase 3/actin and cleaved PARP/PARP/actin.

Values are means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

cleaved caspase 3 →

cleaved PARP →

PARP →

β-actin → CA 6-OHDA

— — ＋＋

— ＋＋ —

(1.0±0.0)^a(3.9±0.8)^b(0.5±0.4)^a(0.4±0.3)^a

(1.0±0.0)^a(3.2±0.8)^b(1.1±0.1)^a(1.0±0.2)^a

Figure 4. Effect of carnosic acid (CA) on the protein expression of GCLC, GCLM, GPx, GSR, and SOD in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells. Cells were pretreated with 0.1% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The proteins we determined by Western blotting. Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1.

One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

GCLC→

GCLM→

6-OHDA — ＋＋ —

— — ＋＋

(1.0±0.0)^b (0.3±0.0)^a(1.6±0.4)^bc(2.0±0.4)^c

(1.0±0.0)^b (0.5±0.1)^a(1.4±0.1)^b(1.4±0.3)^c

GPx→

GSR→

SOD→

β-actin →

(1.0±0.0)^b(0.4±0.1)^a(1.1±0.3)^b(1.0±0.3)^b

(1.0±0.0)^c(0.5±0.1)^a(0.8±0.1)^b(1.0±0.1)^b

(1.0±0.0)^b(0.4±0.1)^a(1.1±0.1)^b(1.1±0.2)^b

CA 6-OHDA

— — ＋＋

— 12 18 24 . 6-OHDA (h)

Figure 5. Effect of carnosic acid (CA) on proteasome activity in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells. Cells were cultured with 0.3% dimethylsulfoxide alone or 100 μM 6-OHDA for 12, 18, and 24 h. (B) Cells were pretreated with 0.1%

dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The level of proteasome activity in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

— ＋＋ — B

Figure 6. Carnosic acid (CA) induced the protein expression of PINK1 and parkin in SH-SY5Y cells. Cells were incubated with 1 μM CA for 0.5, 1, 3, and 12 h. The protein expression of PINK1 and parkin were determined by Western blot assay.

Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

parkin →

β-actin →

— 0.5 1 3 12 (h) CA PINK1 →

(1.0±0.0)^a(3.2±0.4)^b(3.8±0.3)^b(3.9±0.9)^b(4.3±1.4)^b

(1.0±0.0)^a (3.5±0.5)^c (3.1±0.3)^bc (2.6±0.2)^b(1.4±0.3)^a

parkin →

— 3 12 24

β-actin →

6-OHDA (h)

Figure 7. 6-OHDA decrease the protein expression of PINK1 and parkin.

Cells were incubated with 100 μM 6-OHDA for 3, 12, and 24 h.

Values are mean±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly,p＜0.05.

PINK1 →

(1.0±0.0)^d (0.6±0.0)^c (0.3±0.1)^b (0.1±0.0)^a

(1.0±0.0)^c (0.9±0.2)^cb (0.6±0.2)^ab (0.2±0.1)^a

— — ＋＋ 6-OHDA — ＋＋ — PINK1 →

parkin →

β-actin →

Figure 8. Effect of carnosic acid (CA) on the protein expression of PINK1 and parkin in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells.

Cells were pretreated with 0.1% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The protein was determined by Western blotting. Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

(1.0±0.0)^b (0.6±0.1)^a (1.0±0.2)^b (1.0±0.2)^b

(1.0±0.0)^b (0.4±0.1)^a(0.9±0.1)^b (0.9±0.1)^b

p65→

Lamin B1 → CA 6-OHDA

— — ＋＋

— ＋＋ —

Figure 9. Effect of carnosic acid (CA) on the protein expression of p65 in 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-stimulated SH-SY5Y cells. Cells were pretreated with 0.1% dimethylsulfoxide alone (－) or with CA 1 μM for 8 h and then with 100 μM 6-OHDA for an additional 18 h. The p65 protein was

determined by Western blotting. Changes in protein expression were measured by densitometry. The level in control cells was regarded as 1. One representative immunoblot out of three independent experiments is shown. Values are

means±SD of three independent experiments. Groups not sharing a common letter differ significantly, p < 0.05.

(1.0±0.0)^bc (0.6±0.1)a (1.0±0.1)^b (1.1±0.0)^c

cleaved caspase 3 → cleaved caspase 3 →

caspase 3 →

β-actin →

Figure 10. Carnosic acid (CA)-inhibited the activation of caspase 3, and PARP were reversed by parkin-siRNA in SH-SY5Y cells. Cells were transfected with parkin-siRNA

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