圖六顯示的AADC 酵素活性分析結果中，AADC—transfected N2a 的細胞培養 液（圖六A, n=8）及細胞（圖六 B, n=8）中皆可測得 AADC 活性，分別為 0.264±0.05 nmol/min/ml 及 3.12±0.53 nmol/min/mg ，顯示無論是在細胞外或細胞內皆有 AADC 酵素存在，而在細胞內測得 AADC 的活性與先前免疫染色實驗中細胞轉染後有 AADC 表現的結果符合。
圖六 C 結果顯示，以方法一 (med/cell)計算 AADC 的釋放比值時，細胞外的
AADC 活性佔細胞內總 AADC 活性的 34±9% （n=8）。而 mock – transfection N2a
乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase, LDH) 在細胞內含量很多，為一種很穩定的 細胞質酶，正常情況下不能通過細胞膜，但當細胞受損或死亡時即會釋放到細胞 外，所以細胞死亡數會和細胞培養液中 LDH 的活性成正比。測量 LDH 的活性可 分析細胞膜的完整性或細胞的裂解，以評估細胞受損率。為了確認在 AADC 活性 分析中培養液測得的 AADC 活性是由細胞釋放，而非細胞死亡造成的，所以再分 別對AADC-transfected N2a 細胞及 mock-transfected N2a 細胞進行 LDH 釋放分析以 評估細胞受損率。（培養細胞所用的培養溶液其LDH 活性並未被測得）
圖六D 結果顯示，以方法一 (med/ cell) 計算 AADC-transfected 的 N2a 細胞受 損率為14±2% (n=8)，和對照組 (mock-transfection) 15±2% (n=8)兩者間並無顯著差 異 (p=0.289, by T.TEST)。 圖 七 B 結 果 顯 示 ， 以 方 法 二 (med/total) 計 算 AADC-transfected 的 N2a 細胞受損率為 13±1% (n=8)，和對照組 (mock-transfection) 12±2% (n=8) 亦無顯著差異 (p=0.286, by T.Test)。
3.1.4 AADC 酵素活性與細胞受損率的關係
前述的 LDH 活性分析實驗中為了確認在 AADC 活性分析中培養液測得的 AADC 活性是由細胞釋放，而非細胞死亡造成的，所以對 AADC-transfected N2a 細 胞進行細胞受損率分析。結果顯示無論是否有轉染 AADC 基因至細胞，其細胞死 亡率皆無差異。但在細胞免疫染色實驗中顯示未轉染 AADC 基因的 N2a 細胞並沒 有AADC 酵素活性，這結果也在 AADC 酵素活性分析實驗中再次印證，我們無法 以兩者去比較培養液所測得的 AADC 酵素活性是否來自細胞裂解所釋出。因此我
們針對轉染 AADC 基因的細胞進行細胞內外測得之 AADC 酵素活性與其細胞受損 者無顯著差異 (p=0.88)。圖九 B 以方法一 (med/cell) 計算 AADC-transfected 的 N2a 細 胞受損率分別為52±10% （未處理）和 63±4% （經 BFA 處理），經 BFA 處理的細
經處理的細胞釋放出細胞外的 AADC 活性兩者間並未有統計上的顯著差異，因此 我們認為BFA 並沒有如預期的去抑制 AADC 蛋白的分泌，可能是因為 AADC 蛋白 並非依循傳統的蛋白分泌路徑釋放出細胞外。
3.1.6 轉染顯性失活的 Rab11 探討 AADC 釋放機制
Rab 11 在神經元中可以調節神經傳導物質的釋放，將蛋白質從回收的核內體 運送到細胞膜，因此本實驗將Rab11 顯性失活的突變體 (dominant-negative Rab11, DN-Rab11) 和 AADC 基因一同轉染至 N2a 細胞內，藉此探討 AADC 酵素的釋放機 轉。實驗中將 N2a 細胞單獨轉染 AADC 基因或同時轉染 AADC 及 DN-Rab11 (AADC-DNRab11)基因，在轉染 24 小時後更換為無牛血清之培養液繼續培養至隔 夜，分別收集其細胞及培養液進行AADC 活性分析，以 HPLC 分析的 AADC 活性。
實驗結果在細胞培養液的AADC 活性分別為 0.3 nmol/min/ml （單獨轉染 AADC 基 因）或0.31±0.09 nmol/min/ml (轉染 AADC-DNRab11 基因) 兩組間亦無顯著差異(未 附圖表， p=0.978, n=3, by T.TEST)。在細胞內的 AADC 活性分別為 3.44±0.71 nmol/min/mg（僅轉染 AADC 基因）及 4.19±0.51 nmol/min/mg（轉染 AADC- DNRab11 基因），兩組間無顯著差異（未附圖表，p=0.212, n=3, by T.TEST）；
圖十 A 以方法一 (med/cell) 計算釋放到細胞外的 AADC 活性占細胞內總 AADC 活性的百分比分別為 38±10%（僅轉染 AADC 基因）和 29±8% (轉染 AADC-DNRab11 基因)，因其組內差異太大，兩組間仍無顯著差異(p=0.25, by T.TEST)。圖十 B 以方法一 (med/cell) 計算 AADC-transfected 的 N2a 細胞受損率分 別為 16% （僅轉染 AADC 基因）和 18±4% (轉染 AADC-DNRab11 基因)，經轉染 AADC-DNRab11 基因的細胞受損率雖有小幅增加但亦無顯著差異 (p=0.38, by T.TEST)。圖十 C 以方法二 (med/totoal) 計算釋放到細胞外的 AADC 活性占細胞內 總 AADC 活性的百分比分別為 27±5% （僅轉染 AADC 基因）和 22±5% （轉染 AADC-DNRab11 基因），兩者仍無顯著差異 (p=0.25, by T.TEST)。圖十 D 以方法二 (med/total) 計算 AADC-transfected 的 N2a 細胞受損率分別為 13% (僅轉染 AADC 基 因)和 15±3% (轉染 AADC-DNRab11 基因)，兩者細胞受損率亦無顯著差異 (p=0.38, by T.TEST)。
以 上 數 據 結 果 顯 示 在 細 胞 受 損 率 沒 有 顯 著 差 異 的 情 況 下 ， 經 轉 染
AADC-DNRab11 基因與僅轉染 AADC 基因的細胞釋放出細胞外的 AADC 活性比相 且被表現，並在AADC-transfected 的 N2a 細胞培養液中可測得顯著的 AADC 活性，
顯示在 AADC 基因被轉入非多巴胺能神經細胞（N2a 細胞）後，生成的 AADC 可 以被分泌出來，與胞外的 L-DOPA 反應進而生成多巴胺。我們接著嘗試於體外培 養小鼠胚胎的中型棘神經細胞，以探討基因治療中位在紋狀體的非多巴胺能神經 細胞是否也如AADC-transfected 的 N2a 細胞可將 AADC 釋放到突觸間隙，且於細 胞外合成多巴胺。 培養液（非Glia-conditioned growth media, GCM）培養細胞時，大多細胞無法貼附
（圖十一A）；而以 GCM 培養七天後的中型棘神經細胞存活率明顯增加，且形態 也較完整（如圖十一 D），此時便可進行後續的免疫染色及轉染 AADC 基因後的 AADC 活性分析。
在培養中型棘神經細胞七天後固定細胞，首先進行 NeuN 及 DARPP-32 的抗
體—抗原免疫染色反應。本實驗以N2a 細胞作為 NeuN 抗體的陽性對照組 (positive control)，圖十一 B 可見其細胞免疫反應 NeuN 呈陽性（紅色螢光）；而初代培養的 中型棘神經細胞呈NeuN 陽性反應的占 50%以上（圖十一 E），顯示初代培養的細 胞有一半以上為神經細胞。DARPP-32 抗體的陽性對照組為小鼠大腦 caudate putamen (CP) 切片呈綠色螢光陽性反應（圖十一 C），而初代培養的中型棘神經細 胞呈陽性反應的僅有1~2% (圖十一 F, 綠色螢光)。
3.2.2 轉染 AADC 及 AADC 活性分析的結果
我們將 AADC 基因轉染至培養中的中型棘神經細胞（培養第七天），於轉染48 小時後固定細胞，並進行AADC 抗體免疫染色，圖十二 A 顯示轉染效率不到 1% (圖 十二B 為以 Hoechst 染細胞核)。同時我們將轉染 AADC 後的細胞分別收集培養液 及細胞進行AADC 活性分析，結果皆無法被 HPLC 測得。
3.3 多巴胺能神經細胞之實驗
培養野生型小鼠的多巴胺能神經元，並進行細胞免疫染色。先以 NeuN 抗體確 認培養的細胞為神經細胞，圖十三 A 為以 N2a 細胞作為 NeuN 抗體反應的陽性對 照組（化學免疫染色），圖十三 B 為培養的初代神經細胞其 NeuN 抗體反應呈陽性 的細胞占五成（化學免疫染色）。圖十三D 為一個 TH 抗體反應呈陽性（紅色螢光）
的培養細胞，陽性比率小於一成，顯示僅有少數為多巴胺能神經細胞。圖十三 C 為培養初代神經細胞之GFAP 抗體反應呈陽性的亦佔五成（紅色螢光），結果顯示 仍有多數細胞為星形膠質細胞。