1.1 單胺類代謝路徑
芳香族L-胺基酸類脫羧基酵素 (Aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC) 可以催化L-DOPA 和 5-hydroxytryptophan (5-HTP)進行脫羧反應，並分別合成神經 傳導物質多巴胺 (dopamine) 及血清素 (serotonin)。
兒茶酚胺代謝路徑 (catecholamine metabolic pathway)，L-酪胺酸 (L-tyrosine) 經 由酪胺酸羥化酶催化成L-DOPA，此步驟需要四氫基喋呤 (BH4) 及氧的協助，此步 驟為多巴胺合成中的速率決定步驟。L-DOPA 再經由 AADC 酵素及輔酶 pyridoxal 5‘-phosphate (PLP) 進行脫羧作用，形成多巴胺。而在去甲基腎上腺素能細胞中，
多巴胺可被多巴胺-hydroxylase 羥化成去甲基腎上腺素；在腎上腺素能細胞中去 甲基腎上腺素被phenylethanolamine N-methyl- transferase 甲基化形成腎上腺素。
吲哚胺代謝路徑 (Indoleamine metabolic pathway)，由 L-色氨酸被色氨酸羥化 酶羥化成5-HTP，此步驟還需要四氫基喋呤 (BH4) 及氧的協助；接著 5-HTP 經由 AADC 酵素和輔酶 PLP 進行脫羧作用，合成血清素。在血清素的合成中，L-色氨 酸的可用性雖然也會影響合成速率，但其速率決定步驟為 L-色氨酸的羥化。血清 素可再經乙醯化為N- acetylserotonin，最後甲基化成褪黑激素 (melatonin)[1]。
1.2 單胺類神經傳導物質
自於黑質緻密部 (substantia nigra pars compacta) 終止於紋狀體 (corpus striatum) ，已 知在基底核的運動迴路中扮演了重要的角色，參與自主運動的策劃及執行 [2]。巴 釋放。多巴胺可以被神經元內的單胺氧化酶 (monoamine oxidase A, MAOA)、膠質 細胞 (glial cell) 和星狀膠細胞 (astrocyte) 內的 MAOA、MAOB 代謝，以控制多巴胺 在細胞內及突觸間隙的濃度。多巴胺的運送及代謝
1.3 芳香族 L-胺基酸類脫羧基酵素 (Aromatic L-amino acid decarboxylase, AADC)
AADC 酵素為一種同源二聚體 (homodimer)，由兩個含 480 個胺基酸的單體所 組成，而其單體的分子量約為54kD[4]。分析其晶體結構，每個單體包含三個功能 區塊 (domain)，其大的中心功能區塊為一個 β- sheet 及八個 α-helices；而其 C 端小 的功能區塊為一個β- sheet 及三個 α-helices；N端的功能區塊則包含兩個 α-helices[5]。
PLP 為 AADC 酵素活化所需的輔因子 (co-factor)，參與了神經傳導物質多巴胺、血 清素及去甲基腎上腺素 (nor-adrenaline)的合成及降解，因此維持神經系統最佳功能 需要充足的PLP，以確保神經傳導物質的代謝正常[6]。而芳香族 L-胺基酸類脫羧 基酵素的命名是由於Lovenberg et al (1962)發現 AADC 酵素除了可以使 L-DOPA 和 5-HTP脫羧外，亦可使所有的 L-芳香族類的胺基酸進行脫羧反應，如：L-tryptophan、
L-p-tyrosine 及 L-phenylalanine[7]。AADC 基因的蛋白質序列在各種生物體都非常 的類似，顯示其基因之重要性。AADC 基因如果被剔除時，轉殖小鼠會胎死腹中。
1.4 AADC 酵素存在位置
AADC 酵 素 在 大 腦 中 存 在 於 兒 茶 酚 胺 能 (catecholaminergic) 及 血 清 素 能 (serotonergic) 神經元[8]。屬兒茶酚胺能神經元的多巴胺能神經元 (dopaminergic neuron) 投射的位置起點從黑質緻密部 (substantia nigra pars compacta, SNc) 和中腦 腹側被蓋區 (ventral tegmental area, VTA) 終點到背側紋狀體 (caudate putuman)，形 成一基底核動作迴路，巴金森氏症的患者即是此路徑退化所導致。而在哺乳動物 的大腦中，主要的血清素能神經元細胞體存在縫核及腦幹網狀結構；縫核位在腦 幹的中線，一般分成兩群頭端及尾端，血清素會投射在基底核、海馬、丘腦、下 視丘及皮層[9]。AADC 酵素也存在中央的去甲基腎上腺素能神經元，其細胞體集 中在橋腦，許多在藍斑核 (locus coeruleus)、髓質、大部分在網狀結構。
AADC 酵素除了存在單胺能神經元外，亦表現在非單胺能神經元，稱為 D-細
AADC 缺乏症 (AADC deficiency) 首次被確認是在 1990 年，一對同卵雙胞胎患 有不明原因的神經系統疾病，有張力低下、發展遲緩、間歇性轉眼危象及舞蹈症 的肢體動作，對其進行腦脊髓液 (CSF) 檢查而發現，其生物胺 (biogenic amines)及 其代謝產物的濃度有減少的現象，但其腦脊髓液、血漿及尿液中L-DOPA 和 3-O-methyldopa 的濃度卻上升，另外其血漿中亦有大量 AADC 酵素活性降低的現 象 [12]。
AADC缺乏症患者在出生 6個月時即出現運動障礙 (movement disorder) 的症狀，
大多數患者會經歷一早期發病的嚴重漸進式腦病變並合併有肌肉張力不全的過程，
肌肉張力低下 (extreme hypotonia) 及轉眼危象 (oculogyric crises) 是 AADC 缺乏症最 常見的症狀 [13]，此外常見的症狀有發展遲緩(developmental delay)、動作徐緩、舞
蹈手足徐動 (choreoathetosis)、肌張力障礙、肢體張力亢進、失眠、煩躁、易怒 (compound heterozygous)，人類的 AADC 基因由 15 個 exon 及 14 個 intron 組成，位 在第七對染色體的短臂p12.1-p12.3 上，共編碼了 480 個胺基酸。其變異點橫跨了 很低（患者：<1-5 pmol/min/mL, 正常：36-129pmol/min/mL）。另外也可透過 AADC 基因的分子檢測找出致病的突變點。此罕見疾病也於已納入臺灣臺大醫院的新生 劑 (MAO inhibitors) ，如：parnate (tranylcypromine)；多巴胺促進劑，如：溴隱亭 (bromocriptine) 或 pergolid；及 PLP 的前驅物維生素 B6 (pyridoxine)治療，前述的
藥物可以改善某方面的工作記憶。
目前 AADC 缺乏症的治療通常是給予治療巴金森氏症的藥物，然而在存活的 病人中僅有 19%對此種治療方法有反應，且通常也只有緩解一種症狀，藥物治療 對很多 AADC 缺乏症的患者僅有些微或毫無改善，因此許多患者在童年早期時就 會死亡[13]。以多巴胺促進劑治療 AADC 缺乏症，是以直接刺激多巴胺接受器的 方式，進而取代多巴胺的神經物質傳遞。而給予 MAO 抑制劑則可防止 AADC 缺 乏症的患者有限的多巴胺及血清素被分解。此外維生素B6 為 AADC 酵素的輔酶，
以此治療還有部分殘餘AADC 酵素活性的患者身上可能會有效（下圖 B）。
在多巴胺能及血清素能神經元中，負回饋機制控制了 AADC 酵素的活性，也 控制了單胺類的代謝；所以在 AADC 缺乏症主要的兩種藥物治療中，給予多巴胺 促進劑及單胺氧化酵素抑制劑，可觀察到 AADC 酵素活性降低。然而在有正常 AADC 酵素活性的動物身上所發現 AADC 酵素的調控和患者 AADC 酵素活性的關 係尚未明瞭是否有關， 因為原本患者的 AADC 酵素活性就已經很低[16]。
1.8 巴金森氏症的基因治療
與 AADC 缺乏症有類似嚴重運動障礙的巴金森氏症，其藥物治療常以口服 L-DOPA 來改善症狀，但隨著時間越久神經退化更加嚴重，越來越多的神經細胞壞 死，此時服用再多的 L-DOPA 也無法改善症狀，甚至會有藥物的副作用出現。而 隨著近年遺傳工程技術的發展快速，以及我們對於疾病的逐漸認知，開始有人嘗
試將類病毒作為一個載體，將外來的基因送入特定的細胞內，藉此替換缺失或功 能異常的基因，以期能達到治療或延緩病程的效果，並改善患者的缺陷及生活品 質。
這種基因治療法在1990 年進行第一次的人體測試，目前在治療巴金森氏症上 已有良好的成效。巴金森氏症的基因治療，是透過將 AADC 基因送入腦部，希望 可提高 AADC 酵素的活性，再配合口服適量的 L-DOPA，以增加多巴胺的生成，
且降低L-DOPA 的使用劑量。此研究在活體 (in vivo) 實驗中已經證實，利用 AAV 為載體將 AADC 基因送入巴金森氏症猴 (MPTP monkey) 紋狀體中的殼核並服用 L-DOPA，可觀察到長期有效的改善症狀[17]。
AAV 載體是動物實驗中最常使用的載體，安全性非常高，許多神經性疾病都 是以 AAV-2 病毒作為載體進行基因治療，因為神經細胞不分裂，治療安全性高。
而AAV- hAADC 的安全性及效力也已經由人類的巴金森氏症治療得到證實[18]，
透過立體定位手術（腦部手術），利用電腦定位決定要到達的腦部位置（殼核），
儀器組裝好後會自動將長針送入設定好的位置注射病毒載體。再以正子掃描 (Positron Emission Tomography, PET) 追蹤殼核 AADC 酵素的活性，可以觀察到 6-[18F]fluoro-L-m-tyrosine (FMT, a tracer for AADC)的活性增加了 56%，且持續了 96 週[19]。雖然在巴金森氏症患者 PET 分析顯示，AAV2-hAADC 在基因治療上有助 於功能恢復，可能與殼核紋狀體內生性多巴胺的功能池重建有關，但如何能維持 這種持續長時間效應的機制，目前還沒有完全瞭解。
而在初代培養紋狀體神經細胞的實驗中 (in vitro) 可發現，當細胞暴露在高濃 同巴金森氏症，以AAV2為病毒載體將 AADC基因送入患者的大腦殼核 (putamen)，
其成果也於2012 年在 Science Translational Medicine 上發表，手術後患者的電腦斷 層造影 (computered tomography, CT) 及磁振造影 (Magnetic resonance imaging, MRI) 皆顯示無明顯出血跡象，四名患者也在一周內出院。在基因治療六個月後，所有 患者的體重皆增加，以 PET 追蹤其中三名患者殼核 6-[18F] fluorodopa (FDOPA)的 吸收量分別增加為86%、45%及 52%，從 PET 影像可看到治療前及治療六個月後 吸收量的明顯改變（如下圖）。而進行患者的腦脊髓液 (CSF) 分析可看到多巴胺的 代謝產物HVA (homovanillic acid)及血清素的代謝產物 HIAA (5-hydroxyindoleacetic acid) 的濃度皆增加，但 L-DOPA 及 3-O-methyldopa 的濃度仍然升高（如下表）。在 治療前這些患者都有運動障礙 (dyskinesias)，且幾乎沒有自主運動，但在治療幾個 月後患者的運動功能皆有改善，一名患者甚至能夠站立，另外三名患者亦能在沒 有支撐的情況下坐直，其他症狀包括情緒及轉眼危象也有所改善。經過嬰兒綜合 發展測驗 (CDIIT) 和運動量表的評估分數都有明顯的上升，也證實了其動作及認知 功能的改善[21]。
Hwu, W.L., et al. Sci Transl Med, 2012. 4(134): p. 134ra61.
1.10 研究假說
AADC 缺乏症的基因治療是將基因送入紋狀體殼核的位置（多巴胺投射的突 觸後神經元, postsynaptic neuron）；而位於紋狀體的中型棘神經元應無法將異位性 合成的多巴胺儲存在囊泡中，是如何能改善此突觸後神經元 (postsynaptic neuron)
的活性，其細胞機轉目前還不清楚。因此本論文將透過轉染 AADC 基因到非多巴 胺能的神經細胞如神經母細胞瘤 (N2a) 或紋狀體的中型棘神經元 (medium spiny neurons)後，分別收集細胞及其細胞培養液與 L-DOPA 做反應，再以高效能液相層 析儀 (HPLC) 分析 AADC 酵素的活性，以探討其細胞機制。
我們假設在收集的培養液與L-DOPA 反應後，若從中可以測得 AADC 酵素活 性，則可以證明細胞在被轉入 AADC 基因後，生成的 AADC 酵素可以被釋放出來，
因此可與胞外的L-DOPA 反應生成多巴胺（圖一，藍色箭頭），進而維持長時間效 應。反之，如果我們無法從其培養液中測得AADC 酵素活性，表示 AADC 酵素不 會被釋放到細胞外；而其反應路徑可推測為AADC 會被儲存在細胞內，而 L-DOPA 將進入細胞與之反應合成多巴胺，再釋放到細胞外（如圖一，咖啡色箭頭）。如果 細胞內的AADC 酵素真的可以釋放到細胞外，我們也希望探討其釋放之機轉。