本實驗是以安培偵測法的方式偵測 mannitol 及其他醣類，當工作電極 施加不同電位時，分析物的氧化電流可能會隨之不同，所以必須選擇適當 的偵測電位來偵測分析物。醣類在鹼性情況下，被銅電極催化作用，例如 glucose →gluconic acid 產生，單醣類會產生 12 個電子，雙醣類會產生 3~13
個電子，因而被偵測到(84-90)。其化學反應式為:
R-CHO+2Cu2+(aq)+5OH-(aq)→R-COO-+Cu2O(s)+3H2O(l)
在強鹼性溶液下，可與銅電極氧化反應，由不同價數銅離子狀態，產 生一連串可逆氧化反應，反應平衡方程式如下(91,92)：
2Cu+2OH- ⇌ Cu2O+H2O+2e- (1) Cu+2OH- ⇌ Cu(OH)2+2e- (2) Cu2O+6OH- + H2O ⇌ 2Cu(OH)2-4 +2e- (3) Cu2O+2OH- + H2O ⇌ 2Cu(OH) 2 +2e- (4) Cu+2OH- ⇌ CuO+H2O+2e- (5)
其中以 Cu2+離子參與反應較多，醣類被銅催化反應，產生氧化物或氫氧化 物，進而偵測到分析物電流值(85)，而且在高pH 值下，會增加電滲流的產生
(93-95)。圖 9 是冬蟲夏草中含有 mannitol 及一些可能並存的醣類之結構式；
圖 10 為緩衝液中，以 100mV/sec 的掃瞄各分析物所得到的循環伏特安培
圖。由圖10B 可以看出 mannitol 約在+0.30V 左右就有氧化電流產生，而在 +0.30V~+0.80V 之間有氧化電流產生，其他醣類也在這範圍內，所以可以在 這電位範圍內選擇最佳偵測電位，並根據莊清訓學長(96)在流體動力伏特安 培法中所偵測到醣類氧化電位+0.40V 之下有較大的氧化電流產生，因此選 擇此電位來作分析。
二、D-Mannitol 及醣類於 0.050M NaOH 添加不同 KCl 濃度對氧化電流的影 響
根據 mannitol 及其他醣類在最佳偵測電位下於 NaOH 中產生氧化電流 的情形(96)，因此本實驗在 0.050M NaOH 中添加不同 KCl 濃度對 mannitol 及其他醣類分析探討。由圖 11 可得知，當所添加的 KCl 隨著濃度逐漸增加，
所有分析物的氧化電流則逐漸減少。因此選擇在 0.050M NaOH 添加 0.15 KCl 作為北冬蟲夏草樣品中 mannitol 及其他醣類的分離。
三、改良式柱狀銅電極與傳統式盤狀銅電極效能之探討
經由圖 7 中工作電極在設計形態上的不同，因此來做偵測上的比較：
(一) D-Mannitol 偵測極限及再現性測定之比較
於表 1 的實驗條件下，圖 12 為 mannitol, galactose, glucose 和 mannose 偵測於改良式工作電極之毛細管電泳圖，各分析物之平均移動時間分別是
mannitol 約為 484 秒，galactose 約為 716 秒，glucose 約為 763 秒，而 mannose 則約為 844 秒，相較於圖 13 的傳統式工作電極下，背景雜訊約 0.002nA，
降低約 30~40 倍。由圖 14 可知，使用改良式工作電極 mannitol 之最低偵測 極限濃度可達 5.0µM，並且 s/n(signal/noise)≧2，與傳統式工作電極 mannitol 之最低偵測極限濃度達50µM 做比較(見圖 15)。以 0.50mM mannitol 之標準 溶液，在連續重複注入分析16 次(見圖 16)，所得到氧化電流訊號的再現性，
以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示為 3.49%；而傳統式工
作電極在連續重複注入分析 15 次(見圖 17)，所得到氧化電流訊號的再現 性，以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示為 4.77%。再現性 皆小於 5%，在可接受的誤差範圍內。
(二)D-Mannitol 檢量線測定之比較
D-Mannitol 之移動時間(migration time)約為 480(±7)秒，由圖 18 得知在 改良式工作電極所測得之檢量線線性範圍為0.0050mM~5.00mM，檢量線方 程式為 y = 1.00×10-6x+ 1.00×10-10 (R=0.9989，n=3)。圖 19 中，傳統式工作 電極所測得之檢量線線性範圍為 0.050mM~5.00mM，檢量線方程式為 y = 7.00×10-7x+ 9.00×10-11 (R=0.9977，n=3)。
四、北冬蟲夏草樣品中，D-Mannitol 及其他醣類的分析結果
由於北冬蟲夏草樣品本身所含的 mannitol 外，還有其他的醣類存在。
利用毛細管電泳-電化學偵測法偵測並鑑定樣品中的 mannitol 及其他醣類，
由圖 20 可看到分析樣品之毛細管電泳圖，為了確定冬蟲夏草樣品中之 mannitol 及其他所含的醣類，因此在分析樣品中分別加入醣類標準品，藉由 所加入的單一標準品造成樣品單一波峰電流的增加來確定分析樣品中特定 醣類的存在。將樣品添加 0.50mM mannitol，當樣品中 mannitol 波峰電流從 原來的 0.38nA 增加至 1.47nA，確定樣品中 mannitol 的存在(見圖 21)。圖 22 中，添加 0.50mM galactose 時，分析樣品之電泳圖中有獨立的單一波峰 電流產生，更可區分其他醣類；另外，圖23 中添加 0.50mM glucose 時，樣 品中所含 glucose 的波峰電流從原來的 0.08nA 增加至 0.36nA，但也影響到 鄰近的分析物的波峰電流大小及移動時間，其中以 glucose 的移動時間縮短 約 50 秒，及其後 mannose 的波峰電流也增加約 0.28nA。最後添加 0.50mM mannose 時，樣品中所含 mannose 的波峰電流從原來的 0.14nA 增加至 0.38nA，也縮短樣品中 glucose 和 mannose 的移動時間各約 100 秒較為明顯 (見圖 24)。
五、北冬蟲夏草樣品及配製成溶液時的儲存時間與成份含量之探討
分別在不同的天數中，以同一樣品進行分析，對於北冬蟲夏草樣品及
以添加 0.15M KCl 的 0.05M NaOH 稀釋成溶液時的儲存時間比較，而儲存 的條件於 4℃冷藏保存，當樣品稀釋成溶液時，mannitol 的濃度為 0.34mM，
mannose 的濃度為 0.24mM，glucose 的濃度為 0.16mM。由圖 25 可得知 mannitol 和其他醣類的濃度分別於稀釋後第 2 天濃度開始降低，於第 6 天後 mannitol 降低至 47%，mannose 降低至 40%，其中以 glucose 降低至 8%為 最多。另外再將樣品分別於不同天重新配製並稀釋，樣品在第 18 天和第 23 天時mannitol 及其他醣類濃度降低，再經由第 112 天的測量，可發現 mannose 降低至 25%，mannose 降低至 18%，其中以 glucose 降低至 8%為最多(見圖 26)。圖 27 為樣品於第 112 天測量之毛細管電泳圖，其中以 mannitol 的波峰 電流為 0.21nA 尚可觀察出。
六、工作電極與分離毛細管出口端外接套管的效應
毛細管在外接套管的情形下有助於和工作電極對齊，因此對工作電極 與分離毛細管出口端外接套管在不同的距離下所產生的影響作探討。首先 將分離毛細管伸出套管外約 2.50mm，與工作電極分析 mannitol 及其他醣類 (見圖 28)。圖 29~30 為工作電極與分離毛細管出口端外接套管時各波峰電 流的變化及移動時間之影響關係，當工作電極剛好位於套管出口端時，可 知所有分析物的移動時間皆為縮短，其中 mannitol 縮短約 33 秒(約 7%)、
galactose 縮短約 83 秒(約 12%)、glucose 縮短約 102 秒(約 14%)，mannose
則縮短約 129 秒(約 16%)；分析物的波峰電流也分別降低，mannitol 降低約 0.24nA(約 30%)、galactose 降低約 0.14nA(約 28%)、glucose 降低約 0.10nA(約 50%)，mannose 則降低約 0.08nA(約 27%)。而將工作電極伸入套管約 1.25mm 時可觀察出，分析物的波峰電流降至最低，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 0.14nA、galactose 約 0.08nA、glucose 約 0.03nA，mannose 則約 0.10nA，分析物的移動時間也更加縮短，其中 mannitol 縮短約 60 秒(約 12%)、galactose 縮短約 151 秒(約 22%)、glucose 縮短約 192 秒(約 26%)，
mannose 則縮短約 256 秒(約 32%)。當工作電極伸入套管約 2.50mm 時，分 析物的波峰幾乎完全消失。分別將工作電極伸入套管約 3.75mm 和 5.00mm 時皆產生單一波峰電流約 375 秒及 396 秒。而各分析物的波峰電流若依照 未接套管時 mannitol 及其他醣類的比例計算，在 3.75mm 時分別為 mannitol 約 1.06nA、galactose 約 0.75nA、glucose 約 0.33nA，mannose 則約 0.44nA。
而在 5.00mm 時，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 2.12nA、galactose 約 1.43nA、glucose 約 0.64nA，mannose 則約 0.83nA(見表 3~4)。
七、工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓的效應
藉由毛細管在外接套管中和工作電極對齊下，並在套管另一端施加另 一電壓(見圖 7)，使電壓經由套管產生電滲流反應，來評估毛細管在雙重電 壓下的分離情形。當未對套管施加電壓時，高電壓源產生 0.016~0.018mA
電流值，因此依照套管施加電壓後所產生的電流值大小分成：
(一)套管施加電壓後高電壓源產生 0.030±0.002mA 電流值之分析
首先將分離毛細管伸出套管外約2.50mm，且在不對套管施加電壓下，
進行 mannitol 及其他醣類的分析(見圖 31)，之後則開始依照工作電極伸入 套管的距離，並施加電壓，來做比較。圖 32~33 為工作電極與分離毛細管 出口端外接套管於施加電壓後高壓電源產生 0.030±0.002mA 電流值對各波 峰電流的變化及移動時間之影響關係。最初也在相同位置對套管施加電 壓，此時所有分析物移動時間皆縮短約 10~20 秒左右(約 3~4%)，其中 mannose 則 縮 短 約 52 秒 ( 約 8%) ； 分 析 物 的 波 峰 電 流 也 分 別 降 低 約 0.06~0.02nA(約 18~8%)。當工作電極剛好位於套管出口端時，所有分析物
的移動時間皆為縮短，其中 mannitol 縮短約 23 秒(約 5%)、galactose 縮短約 40 秒(約 7%)、glucose 縮短約 36 秒(約 6%)，mannose 則縮短約 62 秒(約 10%)；
分析物的波峰電流也分別降低約0.08~0.04nA(約 27~16%)更為稍稍下降。再 將工作電極伸入套管約 1.25 和 2.50mm 時，所有分析物的波峰電流幾乎完 全消失，當工作電極伸入套管約 3.75mm 和 5.00mm 時也產生單一波峰電 流，移動時間約 450 秒及 470 秒。各分析物的波峰電流若依照未接套管和 未施加電壓時 mannitol 及其他醣類的比例計算，在 3.75mm 時分別為 mannitol 約 0.80nA、galactose 約 0.41nA、glucose 約 0.25nA，mannose 則約 0.32nA。而在 5.00mm 時，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 0.64nA、
galactose 約 0.32nA、glucose 約 0.20nA，mannose 則約 0.25nA(見表 5~6)。
相較於未加電壓下，施加電壓時所有的分析物其波峰電流逐漸下降，而移 動時間減少將近約 120 秒。
(二)套管施加電壓後高壓電源產生 0.050±0.002mA 電流值之分析
同樣將分離毛細管伸出套管外約2.50mm，且在不對套管施加電壓下，
來進行 mannitol 及其他醣類的分析(見圖 34)，之後則開始依照工作電極伸 入套管的距離，並施加電壓，來做比較。圖 35~36 為工作電極與分離毛細 管出口端外接套管於施加電壓後高壓電源產生 0.050±0.002mA 電流值對各 波峰電流的變化及移動時間之影響關係。最初也在相同位置對套管施加電 壓，此時分析物的波峰電流也開始降低，其中 mannitol 降低約 0.72nA(約 44%)、galactose 降低約 0.09nA(約 17%)、glucose 降低約 0.09nA(約 33%)，
mannose 則降低約 0.12nA(約 27%)；所有分析物的移動時間皆開始縮短，
mannitol 縮短約 2 秒左右(約 0.4%)差異不大，其他如 galactose 縮短約 15 秒 (約 2%)、glucose 縮短約 11 秒(約 2%)，mannose 則縮短約 18 秒(約 2%)。當 工作電極剛好位於套管出口端時，各分析物的波峰電流也分別降低，
mannitol 降低約 0.83nA(約 50%)、galactose 降低約 0.18nA(約 33%)、glucose 降低約 0.18nA(約 67%)，mannose 則降低約 0.22nA(約 48%)；分析物的移動 時間皆更為縮短，mannitol 縮短約 5 秒(約 2%)、galactose 縮短約 33 秒(約 5%)、glucose 縮短約 35 秒(約 5%)，mannose 則縮短約 60 秒(約 8%)。之後，
同樣將工作電極伸入套管約 1.25mm、0.25mm、3.75mm 和 5.00mm 時，則 沒有任何波峰電流產生(見表 7~8)。
八、工作電極與分離毛細管出口端外接套管產生單一波峰電流的鑑定 分別將 mannitol 及三種醣類直接以工作電極伸入套管約 3.75mm 處偵 測，此時每種分析物皆有單一波峰電流產生，同樣的在 5.00mm 處時，每種 分析物也皆有單一波峰電流產生，因此可確定實驗中產生的單一波峰電流 包含了 mannitol 及三種醣類存在(見圖 37~38)。
第四章 討論
第四章 討論