嘉南藥理科技大學 生物科技系
碩士論文
改良式毛細管電泳與安培偵測法應用在北冬蟲夏草分析之 研究
Improved Capillary Electrophoresis-Amperometric Determination Applied with mannitol and carbohydrates in
Cordyceps militaris Analysis
指導教授：唐 自 強 博士 王 貞 雅 博士
研 究 生：劉 俊 傑
中華民國九十六年一月十日
謝誌
本論文承蒙指導教授 唐自強博士與王貞雅博士之悉心指導與教誨，唐 自強教授於撰寫期間用心批改、校閱，所花費之心力與體力更是無法形容；
兩位恩師不僅在學業上的指導，生活上的叮嚀與照顧，於待人處世之態度 與原則上亦建立極佳典範，以供學習，師恩浩蕩，銘感於心，特此卷首，
謹表最高謝意。
文稿初成，復蒙輔英科技大學應用化學系 陳美成教授、嘉南藥理科技 大學藥物科技研究所 黃秀琴教授於百忙之中撥空擔任學生的口試委員，對 論文詳加批閱，並提供寶貴之意見與指正，得使本文更加完善，於此謹致 由衷謝意。
此外，非常感謝王貞雅、林美惠、高毓瑩、王四切、方嘉德、游慧美 老師在求學時期對我的支持及鼓勵，也很感謝 N402 實驗室中清訓學長、子 涵及虹妏學妹提供實驗上多方面的協助，以及我的好友郁婷、宜辰學姊、
愛琳、谷維、維尼、佳蓉、育樟生活上的加油與打氣。
這條研究之路，走來艱辛，每位陪伴我的人都很辛苦，但有著師長的 教誨、同學的鼓勵及朋友和家人的支持，俊傑心中充滿感激。而父母與家 人提供了無慮的生活，讓我能專於研究，全力以赴，使我深深感動。僅以 獻上此論文，與之分享心中喜悅，並聊表無限感激之情。
中文摘要
毛細管電泳技術近年來被積極推廣，因為它有著快速、高分離效率及微 量分析的優點。目前中草藥的開發與應用已有明顯的發展，對於中草藥中 高含量的醣類，因有較佳的生物活性而被分析探討。本實驗沿續本實驗室 研究成果以毛細管電泳電化學偵測法(CE-ECD)為基礎，在不必添加衍生劑 的情況下，針對傳統中草藥中的醣類做分離與偵測。改進電化學偵測器之 設計，降低偵測極限。冬蟲夏草中甘露醇具有一定的藥效成份，對冬蟲夏 草有很大的影響，因此我們使用較一般長度短(20cm)，內徑為20µm的毛細 管在鹼性電解液環境下進行分離，除了能縮短分離時間外，更能有效分離 偵測出北冬蟲夏草中甘露醇的成份，另一方面也可以來確認北冬蟲夏草中 其他的醣類成份，以確保樣品本身的品質穩定。電化學偵測器之改進設計，
對北冬蟲夏草中甘露醇和其他可能並存的醣類之移動時間在850秒之內皆 可 偵 測 出 ， 除 了 可 降 低 甘 露 醇 的 偵 測 極 限 達 5.0µM ， 線 性 範 圍 為 0.0050~5.00mM，對真實樣品之測定有極大的幫助。
關鍵字:毛細管電泳、電化學偵測、北冬蟲夏草、甘露醇
Abstract
A simple, fast, reliable and reproducible method based on capillary electrophoresis with electrochemical detection (CE-ECD), for the determination of mannitols in Cordyceps militaris was described in this study. However, carbohydrates are in general difficult to separate and detect due to their lack of readily ionizable functional groups and chromophores. Precolumn derivatization is the most widely used means, and most of the methods are based on reductive amination. A copper microelectrode was used as working electrode carbohydrates can be detected directly without derivatization. Moreover, with electrochemical detection, CE–ECD offers high sensitivity and good selectivity for the determination of carbohydrates. Mannitol, glucose, and mannose can be well separated in a 20 cm length, 20µm i.d fused-silica capillary in a 0.050M NaOH with 0.15M KCl aqueous solution. With the improved capillary electrophoresis-amperometric determination in optimized condition of separation and detection, the migration time of mannitol and carbohydrates are within 850 sec determination with linear dynamic range of 5.00mM to 0.05mM and of 0.005mM limit of detection(LOD).
Keywords: capillary electrophoresis; electrochemical detection; Cordyceps
militaris; mannitol
目錄
謝誌……….Ⅰ 中文摘要……….Ⅱ 英文摘要……….Ⅲ 目錄……….Ⅳ 圖表目錄……….Ⅶ 縮寫表……….Ⅺ
第一章 緒論……….1
一、概述………..………....1
二、冬蟲夏草之簡介………..………...1
三、冬蟲夏草主要的有效成份...………6
四、毛細管電泳歷史背景和發展………..………9
五、毛細管電泳的分離原理…………..………..10
六、毛細管電泳樣品注入的方法………..………...15
七、毛細管電泳常用的偵測方法………..………..18
八、研究目的………..………...22
第二章 材料與方法………...23
一、儀器設備……….………...23
二、藥品及溶液之配製……….…….….25
三、北冬蟲夏草萃取與配製方法…….………..27
四、改良式柱狀銅電極之製作...29
五、改良式柱狀銅電極之前處理與再生…………..……….……..29
六、外加套管之高電壓分離裝置..………...29
七、實驗過程………...30
第三章 結果………...32
一、D-Mannitol 及醣類產生氧化電流的情形………..………….32
二、D-Mannitol 及醣類於 0.050M NaOH 添加不同 KCl 濃度對氧化電流 的影響………...………33
三、改良式柱狀銅電極與傳統式盤狀銅電極效能之探討………….…..33
四、北冬蟲夏草樣品中，D-Mannitol 及其他醣類的分析結果……...…….35
五、北冬蟲夏草樣品及配製成溶液時的儲存時間與成份含量之探討….35 六、工作電極與分離毛細管出口端外接套管的效應….………36
七、工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓的效應……….37
八、工作電極與分離毛細管出口端外接套管產生單一波峰電流的鑑定.40 第四章 討論…....…..………..………...41
一、D-Mannitol 及醣類於 0.050M NaOH 添加與不添加 KCl 的探討….41 二、改良式工作電極設計形態的影響……….41
三、北冬夏草樣品分析的探討……….42
四、工作電極與分離毛細管出口端外接套管的效應探討…….…………42 五、工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓的效應………43 第五章 結論……..……..………...44 參考文獻………...45 附表與附圖……….57
圖表目錄
表1.毛細管電泳-電化學偵測法分析醣類之實驗條件……….57
表2.碳水化合物其解離常數與分子量………..57
表 3.工作電極與分離毛細管出口端外接套管之移動時間效應……….58
表 4.工作電極與分離毛細管出口端外接套管之波峰電流效應……….58
表 5.套管施加電壓後高電壓源產生 0.030±0.002mA 電流值之移動時間效 應...59
表 6.套管施加電壓後高電壓源產生 0.030±0.002mA 電流值之波峰電流效 應……….59
表 7.套管施加電壓後高電壓源產生 0.050±0.002mA 電流值之移動時間效 應...60
表 8.套管施加電壓後高電壓源產生 0.050±0.002mA 電流值之波峰電流效 應….………....60
圖1.冬蟲夏草之子座與蟲體………..………....61
圖 2.毛細管電泳系統基本組成裝置……….61
圖 3.電泳中粒子移動情形……….………….62
圖 4.毛細管電泳中電滲流產生之模擬圖……….62
圖5.電滲流及電泳同時對不同電荷或中性粒子的影響………..63
圖 6.流體動力學與電滲流流動模式的比較……….………64
圖 7.(A)改良式柱狀銅電極設計圖 (B)傳統式盤狀銅電極設計圖….………65
圖8.毛細管電泳-電化學偵測法之外加套管及高電壓系統裝
置……….………....66
圖 9.D-Mannitol 及一些可能並存的醣類之結構式……….….67
圖 10.D-Mannitol 及一些可能並存的醣類之循環伏特安培圖...68
圖 11.D-Mannitol 及其他醣類於 0.050M NaOH 添加不同 KCl 濃度下之流體 動力式伏特安培圖………...69
圖 12.D-Mannitol, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose 偵測於改良式柱狀銅 電極之毛細管電泳圖………...70
圖 13.D-Mannitol, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose 偵測於傳統式盤狀銅 電極之毛細管電泳圖………...70
圖 14.改良式柱狀銅電極 D-Mannitol 偵測極限之毛細管電泳圖.………..…71
圖 15.傳統式盤狀銅電極 D-Mannitol 偵測極限之毛細管電泳圖………...…71
圖 16.改良式柱狀銅電極 D-Mannitol 再現性之測定………72
圖 17.傳統式盤狀銅電極 D-Mannitol 再現性之測定………72
圖 18.改良式柱狀銅電極 D-Mannitol 之檢量線曲線圖………73
圖 19.傳統式盤狀銅電極 D-Mannitol 之檢量線曲線圖………73
圖 20.北冬蟲夏草樣品之毛細管電泳圖……….……...……74
圖 21.北冬蟲夏草樣品中添加 0.50mM mannitol 之毛細管電泳圖………...74
圖 22.北冬蟲夏草樣品中添加 0.50mM galactose 之毛細管電泳圖……..…..75
圖 23.北冬蟲夏草樣品中添加 0.50mM glucose 之毛細管電泳圖………..….75
圖 24.北冬蟲夏草樣品中添加 0.50mM mannose 之毛細管電泳圖………...76 圖 25.北冬蟲夏草樣品配製成溶液時放置時間的影響………..……..77 圖 26.北冬蟲夏草樣品在不同的天數中重新配製時放置時間的影響……....77 圖 27.北冬蟲夏草樣品放置後並於第 112 天重新配製之毛細管電泳圖..…...78 圖 28.工作電極與分離毛細管出口端外接套管的效應之毛細管電泳圖……79 圖 29.工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類移動時間之影 響………...80 圖 30.工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類波峰電流之影 響………..……….80 圖 31.工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓下，電流值
0.030±0.002mA 之毛細管電泳圖………81 圖 32.施加電壓後工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類移 動時間之影響………...82 圖 33.施加電壓後工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類波 峰電流之影響………...…82 圖 34.工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓下，電流值
0.050±0.002mA 之毛細管電泳圖………83 圖 35.施加電壓後工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類移 動時間之影響………...84 圖 36.施加電壓後工作電極伸入套管不同距離的效應對 D-Mannitol 及醣類波 峰電流之影響………...84 圖 37.D-Mannitol, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose 於工作電極伸入套管
內 3.75mm 效應之毛細管電泳圖………85 圖 38.D-Mannitol, D-Galactose, D-Glucose, D-Mannose 於工作電極伸入套管
內 5.00mm 效應之毛細管電泳圖………85
縮寫表
CE-ECD：capillary electrophoresis with electrochemical detection HPAEC：high performance anion exchange liquid chromatography PAD：pulsed amperometric detection
CGLC：capillary gas liquid chromatography CZE：capillary zone electrophoresis
EOF：electroosmotic flow WE：working electrode RE：reference electrode CE：counter electrode PE：polyethylene
第一章 緒論 一、概述
醣類是地球上有機化合物中最豐富的一環。許多化學家和生化學家對 此一大量天然的來源已有長期的研究；主要是根據醣類在生物和工業上各 方面都有著廣泛的運用。而在生物醫學上對於其營養和保健療效上亦有其 功能所在。
中草藥中含有大量的醣類等生理活性化合物，它們的淨重約佔所有植 物的 80~90%，而主要是以寡醣、單醣、雙醣、多醣和醣醇類等形式存在；
蔗糖、葡萄糖和果糖廣泛存在大部份的植物中，Han 等人在中草藥內發現 很高的醣類含量，並且具有較佳的生物活性，因此有興趣對中草藥中的醣 類進行研究(1)。而本研究主要針對冬蟲夏草中的醣類利用毛細管電泳結合電 化學方法進行分離偵測。
二、冬蟲夏草之簡介 (一)歷史記載
冬蟲夏草又名天然蟲草、冬蟲草、夏草冬蟲等。正式有冬蟲夏草的記 載，於中國從商朝開始，冬蟲夏草就被視為是滋養強壯、改善虛弱體質及 麻藥中毒的漢方藥，留傳後世。秦始皇將浸在酒中的冬蟲夏草視為是不老 長壽藥，楊貴妃拿來當成恢復青春的藥物；南宋時代寇宗奭所撰的『本草
演義』及唐慎微所編的『重修政和經史證類備用本草』中已有關於蟬花和 白殭蠶的記載。至明朝李時珍所撰『本草綱目』對蟬花和白殭蠶有更詳盡 的敘述。而至清初吳儀洛所編『本草從新』中首見“冬蟲夏草＂之名。在 趙學敏所編『本草綱目拾遺』中對冬蟲夏有更詳盡的補述謂其，“出四川 江油縣化林坪，夏為蟲冬為草，長三寸許，下趺六足，脰以上絕類蠶，羌 俗採為上藥，功與人參同＂。又如：“冬在土中身活如老蠶，有毛能動，
至夏則毛出土上，連身俱化為草，若不取至冬復化為蟲＂。而將其視為神 奇的生物，並且是高貴的藥材。其實所謂的“冬蟲夏草＂、“蟬花＂、“白 殭蠶＂等都是昆蟲寄生性真菌，近代學者將其列於冬蟲夏草屬(Cordyceps) 中。
法國人巴拉南自中國採集了冬蟲夏草標本帶回巴黎，之後又有英國人 利維將其帶回倫敦。經真菌學專家伯克利的研究才知道「冬蟲夏草」是一 種蟲草菌的子囊菌，寄生在蝙蝠蛾的幼蟲上所形成。在此之前，人們並不 知道「冬蟲」和「夏草」是兩個不同的東西。夏草是一種真菌，此真菌一 旦進入「冬蟲」體內，就將「冬蟲」體內的營養轉成「夏草」。比較「夏 草」和「香菇」的差異性，其實兩者都是真菌，只是「夏草」是葷食的，
而「香菇」是素食的，因為「夏草」是靠「冬蟲」，「香菇」是靠「朽木」
來完成世代交替(2-5)。
冬蟲夏草的藥用價值已被肯定，但限於天然產品稀少，近年來紛紛採
用人工發酵技術量產之冬蟲夏草菌絲體產品，以保健食品之形式在市場流 通。冬蟲夏草具有抗衰老、降血脂、抗動脈硬化、恢復性功能障礙及清除 自由基等多種功效已被綜合論述(6,7)。在美國亦被視為一種治療用菇蕈(8)。 中國大陸有多位學者研究，已證實人工冬蟲夏草菌絲，以小白鼠試驗各項 生理生化臨床活性與天然蟲草亦無顯著差異。腺核苷(adenosine)、蟲草素 (cordycepin)等，被認為是冬蟲夏草的可能作用成份(9)。而發酵培養液中所含 的多醣類，在免疫調節及抗腫瘤活性亦有初步的結果。
(二)生物學上的分類
冬蟲夏草屬或稱蟲草屬為典型的昆蟲寄生性真菌。小林氏分類統計蟲 草屬有兩百多種，其中又可分為菌生蟲草和蟲生蟲草。前者寄生於Claviceps 及Elaphomyces屬的子實體上，後者則寄生於昆蟲及蜘蛛體上。蟲生蟲草的 寄主包括：雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、鱗 翅目(Lepidoptera)、半翅目(Hemiptera)、異翅目(Isoptera)、直翅目 (Orthoptera)、等翅目(Homoptera)等昆蟲綱之幼蟲、蛹及成蟲及蜘蛛綱 (Arachnida)等(10)。
(三)生物形態
冬蟲夏草的形成是「夏草」侵入蝙蝠蛾的幼蟲體內，並占據其體腔，
以幼蟲的內臟為養料，滋生出無數新菌絲。菌絲交集在一起形成菌絲體，
稱為子座。在秋末冰封前，子座由蟲體頭部長出，高約一公分，然後停止
生長，在凍土中過冬；到了春天，氣溫逐漸升高，隨著雪溶，夏草的子座 逐漸長出地面，時至九月下旬子座漸漸肥大，地下「冬蟲」已被啃食殆盡 而死亡(見圖1)。
在生長初期，子座由乳頭狀子囊殼緊密鑲嵌排列而成，每個子囊殼直 徑約100 120μm，橫切面為橢圓形。成熟蟲草的子座中心則因生長拉大而 成空腔，內有疏鬆網狀菌絲，直徑約150 180μm。在子囊孢子階段，每一 子囊孢子可萌發出1 3條分生孢子梗。最後，在殭蟲內可以發現許多蟲菌 體，長約22μm，呈梭形。
(四)生物特性
冬蟲夏草是一種嗜低溫的真菌，在0℃以下停止生長，在1~4℃時生長 緩慢，15~20℃為其嗜溫，25℃以上生長受到抑制。寄主為蝙蝠蛾幼蟲，營 地下生活，在地表下10 30公分土中過冬，其中以地表下10公分的範圍分布 最多，地溫攝氏3 9℃，過冬期間不食；該菌生長極為緩慢，接種在PDA平 板上在20℃條件下，7 天左右才能從接種體上長出灰白、繼而轉變成棕黃 乃至於黑褐色的菌苔，但遲遲不擴展到培養基上，大約20天後使見接種體 逐漸變黑，且稍有膨大，其上有稀疏短淺的菌絲體，2個月後才形成直徑 6~8mm的圓形黑色菌落，並分泌黑色素滲入培養基內，3個月後菌落直徑僅 1.5cm左右，其上有稀疏平貼的菌絲體，此後在菌落中心逐漸長出稀疏的白 色菌絲叢，即冬蟲夏草菌絲體和分生孢子，經某些特殊處理或在特殊培養
基上也可以產生豐茂的白色菌絲和較多分生孢子的菌落(11)。
冬蟲夏草菌菌落堅硬，菌絲表生，無色有隔膜、分枝、平滑或具微疣。
分生孢子梗無色、單生或2~8 本簇生於無色球形細胞組成的小子座上，不 分枝至分枝，不形成包梗束。產孢細胞系瓶形小梗，無色，單點內壁產孢，
平滑或具微疣，針形或鑽形，分生孢子無色、無隔膜、平滑、腎形或長橢 圓形，大多2~6個一群，為一檸檬型黏膜所包圍；該菌對營養要求並不 嚴格，在多種人工培養基上都能生長發育(12)。
蟲草產地平均溫度為攝氏0.2 8℃，地表平均溫度攝氏4 9℃，年降雨量 556.7 651.3公分，年日照2076.6 2541.2小時，年積雪46 86公尺。蟲草產量 在五至十月占75 93％，與蟲草菌、寄主、氣溫、陽光等因素密切相關：蟲 草產地主要分布在西藏、四川、青海、雲南、甘肅、貴州一帶等3,500 5,000 公尺的高山區，且海拔越高，密度越大，質量越好。
(五)冬蟲夏草之化學組成
冬蟲夏草的化學組成分析，含水量10.84%，粗脂肪8.4%，粗蛋白 25.32%，粗纖維18.53%，碳水化合物28.90%，灰份4.10%(13)。除了上述主 要成份外，冬蟲夏草還有一些微量成份，包括豐富的維生素B12，含量0.25 μg/100g，也有D-甘露醇、麥角固醇、硬脂酸、軟脂酸、油酸、β-亞油酸、
二十烷、膽固醇軟脂酸酯、麥角固醇過氧化物、蕈糖、抗壞血酸、硫胺基 酸、蟲草多醣及多種胺基酸與無機元素(鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、銅、錳、鋅、
硒、鈦、鉻、磷等)(14)。
三、冬蟲夏草主要的有效成份
冬蟲夏草目前已知的有效成份可分為：
(一)多醣體(polysaccharides)成份
對冬蟲夏草藥理功效而言，其多醣體是一重要角色，其組成主要由半 乳糖和 D-甘露糖所構成，分配比例為 1:1。分析冬蟲夏草菌液，測得多醣含 量為甘露糖 48.65%、半乳糖 22.13%及葡萄糖 5.04%(15)。目前已證實的功效 為經熱水和鹼溶液來萃取冬蟲夏草非水溶性多醣體，其主要成份為半乳 醣、葡萄糖和甘露糖。可降低正常鼠的血糖濃度(16)，可改變腫瘤細胞膜通 透性，降低葡萄糖進入細胞內，進而降低異化細胞增生速率(17)。且含有具 免疫功能之 1-3-β-D-多醣。在老鼠的實驗中證實可降低老鼠血液中膽固醇 及三酸甘油酯含量的能力(18)，治療 B 型肝炎及抗腫瘤與免疫調節作用等功 效(19)。
(二)腺核苷(adenosine)
核苷類物質中，腺核苷、尿嘧啶及鳥糞嘌呤為冬蟲夏草有效成份之一。
尤其以腺核苷(adenosine)具有明顯的藥理作用。它是一種心律不整的藥物，
主要在於降低心臟傳導速度，為心臟血管明顯用藥，具有心肌代謝復活及 冠狀動脈擴張作用和治療突發性心室心搏過速，並且具有鎮靜、降溫、鎮
痛、抗缺氧、降低膽固醇等藥理活性(20)。1988 年徐文豪等人(21)最初由西藏 產的冬蟲夏草子實體中鑑定出腺核苷的結構得到次黃嘌呤核苷酸、腺嘌 呤，再自蟲體中得到微量次黃嘌呤核苷酸、鳥糞嘌呤、腺嘌呤和腺核苷類 等物質。由 Furuya 等人以蟲草及 Isaria 屬進行培養，經 HPLC 測定結果，
發現全部菌絲體均含腺核苷成份，冬蟲夏草的腺核苷含重達 0.63mg/g(22)。 分析冬蟲夏草子實體中，發現含高量腺核苷為 2.47mg/g(23)。腺核苷含量數 值亦可作為冬蟲夏草菌絲體之品質指標。
(三)蟲草素(cordycepin)
1950年Cunningham於蛹蟲草(Cordyceps militaris)之發酵製備物中發現 具有成分3’-deoxyadenosine之核苷類抗代謝物(Cordycepin)之抗生素，將之 稱作蟲草素。蟲草素具有多種生物活性功能，具有抗病毒活性，因其能抑 制細胞中mRNA後轉譯作用，是嘌呤再生合成之迴饋抑制劑(24)；腫瘤細胞 不論於活體內或活體外，其細胞抑制性均大於細胞毒性，人體腫瘤細胞之 抗增殖效應與蟲草素之吸收有直接的關係，於癌症之化學療法上具有應用 潛力(25)。一般認為冬蟲夏草的藥理作用可能是綜合的(26)，其中蟲草素可能 具有主要作用，對衡量冬蟲夏草藥理作用及評價人工培養菌絲的質量上是 必須的。但蟲草素在蟲草藥材中含量不高，在西藏產冬蟲夏草中測出含量 佔3.09%(27)。
(四)甘露醇(D-mannitol or Cordycepic acid)
D-甘露醇是蟲草的主要藥效成分之一，自 1957 年 Chatterjee 等首次將 它從蟲草中分離出來，誤以為結構是 1,3,4,5-四羥基環己烷酸，被稱之為蟲 草酸(28)。後來經 Sprecher 等人再次鑑定，確認蟲草酸的真實結構為甘露醇
(29)。甘露醇分佈於乾燥的柿子、昆布表面上的白粉中，具有溶於水、不溶
於酒精等特性，甜度為蔗糖的 60~70%。冬蟲夏草含有高含量之甘露醇，在 四川生產之冬蟲夏草、廣東生產之蔗蛾蟲草及西藏冬蟲夏草中甘露醇的含 量分別為 11.41%、6.05%及 8.4%(30)。在藥理功能上，甘露醇具有擴張心臟 及腦血管的功能，有助於改善動脈硬化症狀(31)，也是本研究的重要分析成 分。
雖然存在同一樣品中的醣類，其分子量通常相當接近，要將它們分離、
偵測並不容易(32)。而醣類本身並無UV/visible吸收波長，所以在分離前，必 需要進行衍生化前處理。其過程不但費時，選擇性和靈敏度也都不佳(33,34)。 許多學者以高效能陰離子交換層析(high performance anion exchange liquid chromatography, HPAEC)結合脈波安培偵測(pulsed amperometric detection, PAD)法來提升醣類的偵測靈敏度(35)。但在HPAEC-PAD方法中，HPAEC管 柱平衡時間相當長，且效能明顯受到碳酸根影響，在強鹼條件下，移動相 必須儘可能脫氣以排除CO2。PAD法當更換電極或是移動相後，偵測器更需 重新做最佳化調整，因而降低系統再現性，造成HPAEC-PAD方法在例行性 或大量分析上的困難。高解析力的毛細管氣液相層析(capillary gas liquid
chromatography, CGLC)也用於分析醣醇類與醣類(36)。然而受限於醣醇類與 醣類等的低揮發性，樣品必需經過矽化處理成高揮發性的衍生物方適於 CGLC 分析，同樣的衍生化既費時又不易掌握，且其衍生物極易為溼氣所 破壞，因此限制了CGLC的應用。
四、毛細管電泳歷史背景和發展(37-44)
簡單的說，電泳是將混合的分析物置於電解質溶液中，在直流電場的 影響下，帶有不同電荷及不同質量大小(即charge-to-size ratio不同)的物質會 有不同的遷移速率，藉此使物質之間達成分離。在1937年首先將電泳作為 一種分析的工具，是瑞典化學家Tiselius，當時他利用電泳分析技術進行血 清中白蛋白、α球蛋白、β球蛋白，和γ球蛋白分離的研究，並且成功將人體 中血清蛋白分離，由於他對電泳分離技術上的研究和貢獻，所以在1948年 獲頒諾貝爾化學獎。
傳統膠電泳在分離過程當中，因施加高電壓使得電流通過介質產生焦 耳熱，造成解析度降低，所以在1967年Hjerten提出利用窄口徑分離管柱(直 徑3mm石英管)做電泳分析，使用狹窄內俓的管柱，在高電場情況下進行自 由溶液的毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)，可降低焦耳 熱的效應。到了1974年，Virtanen使用小內徑派熱克斯玻璃(Pyrex)管柱，而 管柱內徑介於200 500µm，應用電位偵測法(potentiometric detection method)
定量分析鹼金屬離子(alkali cations)，考慮到毛細管區帶(capillary zone)中縱 向擴散(longitudinal diffusion)、散佈性因素(dispersive factors)，和不規則的 電位梯度(uneven potential gradient)的影響，並且討論電滲流對分析物的分離 情形。為了減少對流擴散問題，在1979年，Mikkers利用內徑為200µm的鐵 氟龍(Teflon)管柱，進行自由區帶電泳分析，並應用UV吸收(254 nm)，在短
時間內(少於10分鐘)可以同時解析無機和有機的陰離子，接下來1981年 Jorgenson和Lukacs首先利用內徑小於100µm，並以熔融態成型的二氧化矽 材質毛細管(fused-silica capillary)作為分離管柱，所應用的電壓高達30 kV，
並以螢光做偵測，可提供高效率的電泳分離，進行胺基酸和胜肽分離時，
分離效率超過4×105理論板數。此外也對毛細管電泳的理論概念，指出電滲 流在測定離子遷移情形扮演重要的角色，電滲流會影響解析度和分析時 間，開啟了毛細管電泳的發展。
毛細管電泳的優點，可使用不同分離模式，提供不同選擇性。對偵測 的分析物用量很低，即可偵測。毛細管和試劑(running buffer)使用量的消耗
很少，設備簡單及分離快速，使得近年來毛細管分析方法用的相當廣泛，
例如在藥物分析、食品分析、環境檢測、生化醫學等，都有不錯的成效。
五、毛細管電泳的分離原理(45-53)
毛細管電泳分離的進行是使用內徑2 300µm的毛細管，在毛細管內充滿
電解質溶液，兩端分別插入裝有電解質溶液的容器內；由高電壓電源供應 器(high voltage power supply)在毛細管兩端提供相當高的電壓(~30 kV)以進 行電泳分離。樣品由毛細管一端(注入端)注入後，藉由高壓電場的作用，分 析物會往另一端(出口端)移動而分離，並在出口端以偵測器(detector)監測樣 品分離的結果。毛細管電泳分離構造相當簡單(見圖2)；藉由不同粒子所帶 電荷大小、質量、形狀、電荷密度及與介質溶液的作用不同，產生不同的 移動速度，使不同的帶電荷粒子得以分離。 而帶電荷粒子在毛細管中的移
動主要是由電泳(electrophoresis)及電滲流(electroosmotic flow)兩效應所造 成。現就此二效應簡述如下：
(一)電泳(electrophoresis)
在毛細管兩端施加一電壓後，溶液中帶電荷的粒子因受到電場的作用 力使帶正電荷粒子往負極移動，帶負電荷粒子往正極移動，而中性粒子
因不受電場影響，滯留在原處不動，此現象稱之為電泳(見圖3)。其相關公
式如下
υep ＝ Z e
6 π η r
＝µep E………...(a) υep:粒子的電泳移動速度(migration velocity) Z:電荷數
e:電子電量
η:電解質的黏滯係數 r:粒子半徑
µep:電泳移動率(electrophoretic mobility) E:電場強度
E = V/L………..………...(b) V:分離電壓
L:毛細管長度
由式(a)可知影響電泳遷移速度的因素包括：粒子之電荷量，電解質溶液之
黏滯度，粒子半徑，電場強度等四項。其中與待測物性質有關的是粒子之 電荷量與粒子半徑，而粒子半徑又與待測物之形狀及質量有關。
(二)電滲流(electroosmotic flow, EOF)
由於毛細管的材質大多由fused silica所構成，在其表面帶有silanol group (Si-O-H)，此silanol group在水溶液中的性質像是一中等強酸(medium strong acid)
Si-O-H ⇌ Si-O- + H+………..…...(c)
其解離常數pKSiOH <2(49)。因此，當毛細管內充滿 pH >3之電解質溶液時，
其毛細管內壁會因H+的解離而帶負電荷。此時毛細管內壁的負電荷所吸引 緩衝溶液中的正電荷離子的現象，將導致電雙層(Electric double layer)的產
生；其中最接近管壁的部分，是形成帶正電荷而無法移動的陽離子層，稱 之為Stern layer。在Stern layer的外面，則是夾雜著正負電荷且會移動的擴散 層(diffuse layer)，在此層中，正電荷數目遠多於負電荷。在固定不動的陽離 子層和可移動的擴散層之間的介面，稱之為slipping plane，在此slipping plane 上的電位，則稱為Zeta potential (ζ)
ζ = δ e / ε...(d)
δ:電雙層厚度(thickness of the diffuse double layer)或 德拜離子直徑(Debye ionic radius)
Debye ionic radius 是δ = (3×107) (Z) (C12)
Z:共價電子數 C:緩衝溶液濃度 e:單位面積電荷數
ε:緩衝液溶液的介電常數
當在毛細管兩端施加高壓電場後，slipping plane以外擴散層中的陽離子 會受電場作用而往負極移動，陽離子移動的同時會拖曳其周圍的水分子一 起往負極移動，此種流動快速地蔓延整個溶液，而造成整個溶液往負極流 動，此現象便稱之為電滲流(見圖4)。其相關公式如下：
ε ζ
υeo＝ E
η
...(e)
＝µeo E
υeo:電滲流的流速
µeo:電滲流移動率(electroosmotic mobility)
由式(e)得知，電滲流的流速正比於電場強度，但增加電場強度也會增加毛 細管內的電流，因此產生較大的焦耳熱，使得毛細管內溶液的平均溫度升 高，而導致電解質溶液的黏度改變，並影響電滲流的流速。因此，當電場 強度改變時，電滲流的流速並非呈線性的增加或減小。由以上可知，造成 毛細管分離的力量，包括電泳加上電滲流。
(三)粒子的淨流速
粒子於毛細管電泳中的淨流速υtot，等於電泳移動速度(式a)與電滲流流 速(式e)之和：
υtot = υep + υeo
= (µep + µeo) E……….(f)
一般而言，除了小離子(如 F-、Cl-、OH-等)以外，電滲流流速大都大於離子 的電泳移動速度，故此二流速相加成後，大多數的粒子都會被電滲流帶向 負極(見圖5)。又因帶正電荷的粒子其電泳的方向與電滲流同向，所以往負 極遷移的速度最快；而帶負電荷的粒子，則因其電泳的方向與電滲流相反，
所以往負極遷移的速度最慢；中性粒子因不帶電荷，其遷移速度便等於電 滲流的流速，可藉由中性粒子作為電滲流的指標以計算電滲流的移動率(50)：
µeo = υeo / E = Lt Ld / tneu V………(g) Lt:毛細管的全長
Ld:毛細管自注入端至偵測端的距離
tneu:中性粒子從注入端至偵測端的遷移時間 V:分離電壓
毛細管電泳的分離效率非常高，其主要原因是電滲流，在毛細管內的 流動不是一般壓力驅動所造成的流體動力學流動，而是電滲流(見圖6)。若 不將焦耳熱對分離造成的不利影響考慮在內，則在毛細管電泳系統中，幾 乎只有"擴散"這一項因素會造成波峰的變寬。
六、毛細管電泳樣品注入的方法(43,46,54,55)
毛細管電泳常用的樣品注入方法有下列三種：
(一)電壓注入法(Electromigration Injection)
將毛細管注入端的電解液溶液槽換成樣品槽，施加固定電位分離電壓 一段時間(數秒)，樣品因electroosmotic flow作用而注入到毛細管內，注入到 毛細管的樣品帶(sample zone)長度L為
L = (υep + υeo)ti
= (µep +µeo)E ti………(h) ti::樣品注入時間
而樣品注入毛細管的體積 V 為
V = π r2 L
=π r2 (µep + µeo)E ti………..(i) 因此注入毛細管的樣品量 W 可由下式表示
W =V C
=π r2 (µep + µeo)E ti Ci………..(j) Ci:樣品濃度
由以上可知，樣品的注入體積與電滲流移動率(electroosmotic mobility)有 關。優點:當施加電壓時，可藉著離子移動現象與電滲流效應等兩種現象的 加成效應，促使樣品進入毛細管，易操作。缺點:在不同的分析物，注入時 間雖然相同，但其實注入量並不相同，是受分析物離子的影響，但與標準 溶液注入之比例一致，在定量上不致於造成太大誤差，也是本實驗所使用 的方法。
(二)重力注入法(Gravity Flow Injection)
將毛細管的注入端連同樣品槽移至與出口端相當高度差為△h 的位 置，樣品便因重力差而注入毛細管，經過一段時間ti後，樣品的注入體積 q 為
ρ g π r4 △h ti q ＝
8 η L
….……….………..(k)
ρ
:樣品溶液之密度 g:重力加速度之常數 而樣品的注入量 W 為W = q C
ρ g π r4△h ti C
＝
8 η L ……….(l)
利用此方法注入樣品時，注入的體積與電泳移動率無關，對於不同分析物 的電泳移動率，其注入體積皆相同。
(三)壓力注入法(Pressurized Injection)
利用氣體(N2)施加一定壓力於密閉樣品槽中，藉此方式使樣品流入毛細 管中，此方法樣品注入量 W 為
W = q C
△p g π r4 ti C
＝
8 η L ……….(m) △p:毛細管兩端之壓力差
由以上可知，此方法注入樣品時，注入的體積與電泳移動率無關。優點:分 析物注入體積皆相同。缺點:緩衝液黏稠性，會影響是否易流入毛細管，操 作不易，設備較繁雜。
七、毛細管電泳常用的偵測方法
毛細管電泳所使用的分離管柱之內徑皆相當小，因此只能注入非常 少之樣品量(pL~nL)來進行分析，目前已經發展了各種技術已提高毛細管 電泳分離法的偵測極限，所以偵測方法要選擇適當且靈敏度高，一般常 被應用在毛細管電泳的偵測器有下列四種:
(一)紫外光/可見光吸收偵測法(UV/VIS Absorption Detection)
紫外光/可見光吸收偵測法是毛細管電泳中最常使用的偵測法(56-59)，且 已有商業化的儀器及輔助元件，在毛細管電泳分析法使用的線上偵測方 法，只需要將熔矽毛細管外層包覆的聚亞胺去除一小段，使該段毛細管的 熔矽材質裸露，即可作為偵測視窗。入射光便由此透過管壁而照射在通過 毛細管內的樣品溶液上，然後在管壁的另一端偵測其吸收度，此偵測法可 以避免如離線偵測方式在偵測介面上所產生的間隙體積以及帶加寬的效 應 。 由 於 毛 細 管 的 內 徑 即 是 樣 品 的 光 徑 長 ， 因 此 受 毛 細 管 微 小 內 徑 (25~100µm)的限制，使得此偵測方法的靈敏度不是很理想。若樣品不具有 發色團(chromophore)，則必須先以具有吸光團的衍生劑將樣品衍生化後，
再以UV/VIS 偵測器偵測；或者在緩衝溶液中加入具有吸光團的物質，以間 接偵測法偵測之(60,61)；因操作簡單、分析樣品很廣泛，所以使用上相當普遍。
(二)螢光偵測法(Fluorescence Detection)
螢光偵測法和紫外光/可見光吸收偵測法兩者在偵測槽的設計上很類
似，但螢光偵測的偵測器是放置在與激發光源成90度角的方向來偵測放射 螢光，而與紫外光/可見光吸收偵測法的偵測器是放置在與光源成180度角的 方向來偵測不同。因此在螢光偵測中，分析物放射出的螢光訊號強度正比 於激發光源的強度，偵測所得之訊號不會受激發雜訊的干擾，使得螢光偵 測法的偵測靈敏度很高，通常比紫外光/可見光吸收偵測法高10~1000倍(62)。 由於一般的物質並不具有螢光發色團(fluorophore)，所以須先將樣品衍生化 後才能予以偵測(63-65)；或者利用間接偵測法偵測之(66)。目前大都使用雷射
光(67-69)當做激發光源，以提高偵測靈敏度。至今，以雷射做為激發光源的
螢光偵測法是毛細管電泳中最靈敏的偵測方法之一。
(三)質譜偵測法(Mass Spectrometric Detection)
質譜儀是目前分析技術中能夠提供有關分析物之質量及判定其結構等 化學訊息的偵測器。因毛細管電泳的流量非常小，所以能方便且容易的將 毛細管電泳系統與質譜儀透過特殊的界面設計連接，而將樣品注入游離介 面中，最常使用的方法是電噴灑(Electrospary)游離法(70,71)，其次是快速原子 撞擊(Fast Atom Bombardment，FAB)游離法(72,73)。由於電噴灑游離法可使分
子量大的分析物攜帶多重電荷，使得質譜儀能夠鑑定較複雜的生化分子 (proteins、peptides...等)，但儀器昂貴、分離條件受限制。還有其他的偵測 方法，如同位素輻射偵測法、化學冷光偵測法、原子發射光譜偵測法等。
雖然這些偵測法的實用性仍有待發展，但它提供了另一種的選擇性。
(四)電化學偵測法(Electrochemical detection)
應用於毛細管電泳的電化學偵測法主要有下列幾種：
(I)電導度偵測法(Conductivity detection)
電導度偵測法是應用於毛細管電泳中最早使用的電化學偵測法，主要 是利用分析物中的離子與電解質溶液的電導度不同，因此可測得各成分離 子相對於背景電導度的訊號，此方法大致上分為兩類；on-column(74)和 end-column(75,76)偵測方式，這兩種方式分別利用不同的界面設計，將一對白 金電極置於毛細管內或是毛細管末端，直接偵測分析物電導度的變化，所 以電導度偵測法對毛細管電泳而言，是一種通用的偵測法。由於其偵測槽 製作不易，且毛細管電泳所產生之電泳電流會造成干擾，所以此偵測法並 不多見。
(II)電位偵測法(Potentiometric detection)
電位偵測法是使用離子選擇電極或薄膜指示電極，當分析物流過電極 表面時，偵測其所產生相對於參考電極的電位。由於選擇性的薄膜電極製 作不易，且十分脆弱，容易破裂，偵測訊號易受電泳的分離電壓所干擾，
因此在發展上受到許多條件限制，所以並不普遍被使用。
(III)安培偵測法(Amperometric detection)
為目前應用於毛細管電泳中最靈敏的偵測方法之一(77-83)，此方法是將 微電極以 off-column 或 end-column 偵測方式，off-column 是將電極伸到毛
細管內，end-column 是將電極對準在毛細管出口端，在微電極施加固定電 位，當分析物經由毛細管電泳分離後，依序流經電極表面產生氧化或還原 反應，測得這些反應訊號。首次將毛細管電泳與安培偵測器結合起來的成 功例子，是在1987 年由 Ewing 和 Wallingford(78)提出。他們將安培偵測法以 off-column 的 方 式 應 用 在 毛 細 管 電 泳 分 析 上 ， 由 於 施 加 分 離 電 壓 ( 約 10~30KV)後，在毛細管內所產生的電泳電流大於微電極所偵測到的分析物 氧化還原電流，為了避免高電壓所產生的電流干擾到樣品的偵測訊號，必 需將分離電壓與安培偵測器隔離。然而Ewing 和 Wallingford 利用一段長約 1.5~2.5cm 的多孔性玻璃管連接分離毛細管及偵測毛細管，將此連接界面浸 在電解液中，電流電泳即可藉此界面導出，且因分析物流過此界面之後，
雖然已經沒有電滲流的推動，仍因慣性的作用以原來具備的速度流到毛細 管末端之微電極處。此方式可減少分離電壓造成分析樣品偵測上的干擾。
另一種將毛細管電泳與安培偵測器結合起來的方法為 end-column 方式
(77)，是由 Zare 和 Ewing 等人利用內徑非常小(5µm)的毛細管來進行分離，
因此通過毛細管內的電流相當小(13nA)，對於安培偵測器中將微電極放置在 毛細管出口端所造成干擾較小，所以不需要分離電壓和偵測器隔離，使整 個操作更為方便、簡單，只需在毛細管出口端將分離電壓導出即可。在1993 年，Colon 和 Zare 等人(81)使用內徑 50µm 的毛細管來分離醣類，並以直徑 25µm 的柱狀銅微電極，放置在毛細管出口端偵測，在此系統下，並未將分
離電壓和偵測器隔離，其所偵測到醣類的偵測極限皆小於50 fmol，不需要 導電界面的設計，所以更方便使用。
八、研究目的
毛細管電泳具有分離效率高、靈敏度好，消耗試劑及樣品量少等優點，
而且毛細管的管柱是中空的 fused silica 材質，故不會像液相層析法發生有 阻塞管柱情形，使得解析度與再現性不好。然而連接毛細管電泳之偵測器 如螢光或 UV/VIS 偵測器，想要偵測單醣或雙醣物質，因醣類沒有發光基 團，所以必需添加其它化學成分才能偵測，而且要純化醣類物質，還要把 化學成分去除其過程不但費時，選擇性和靈敏度也都不好。於是利用毛細 管電泳結合電化學偵測法來做偵測與分離醣類的研究便因應而生。且因醣 類物質含有許多碳氫化合物基團，會與銅電極發生氧化反應，而偵測到氧 化電流，已有相關文獻得知(81-87)，本實驗延續莊清訓學長的研究成果(96)， 利用毛細管電泳搭配改良式柱狀銅電極偵測系統，經安培偵測法等在最佳 的偵測與分離條件下，分析北冬蟲夏草中甘露醇含量，來確認冬蟲夏草的 品質，以及探討工作電極與毛細管外接套管並施加高電壓之效應。
第二章 材料與方法 一、儀器設備
1.電化學分析儀(Electrochemical analyzer)
CHI-630a Electrochemical analyzer(CH Instruments, Inc.made in U.S.A.)，進 行毛細管電泳偵測時，採用Amperometric i-t Curve method。
2.電極偵測系統
工作電極(Working electrodes): copper rod electrode
參考電極(Reference electrodes): Ag/AgCl electrode (SSCE): MW-2030(BAS Inc. made in U.S.A.)
輔助電極(Counter electrodes): platinum electrode 3.高壓電源供應器(High-voltage power supply)
為BERTAN series-230 model 10(BERTAN Hickville,Now York, U.S.A )，可 提供＋/－0~10 KV 電壓及 0~1.5mA 電流。
4.記錄器
由 CHI-630a Electrochemical analyzer 的系統軟體搭配個人電腦當作記錄 器，具有data acquisition 及 data processing 等功能。
5.電化學偵測槽
以壓克力材質所製成。
6.微操控器
以壓克力材質所製成。
7.毛細管(Capillary)
使用內徑 20µm，外徑 150µm 之 polyimide coated fused silica capillary column，購自 Polymicro Technologuies, L.L.C.，長度可自行裁切。
8.套管
使用內徑 200µm，外徑 350µm 之 polyimide coated fused silica capillary column，購自 Polymicro Technologuies, L.L.C.，長度可自行裁切。
9.計時器
用來控制毛細管電泳之電壓注入樣品的時間。
10.微量吸量管(Micropipet)
使用 Gilson Pipetman Model P1000(200µl~1000µl)、P200(20µl ~200µl)、
P20(10µl ~20µl)等微量吸量管，可精確取少量溶液。
11.砂紙(1000 號及 4000 號) 用來拋亮銅電極表面。
12.超音波振盪機
由 Elma 公司，Typ T710DH，用來清潔電極表面。
13.純水製造機
Mill-Q 製造出純水裝置。
14.電子天平
型號: AND FR-120A，以小數點以下四位數精確稱取所需藥品的重量，購 置艾安得股份有限公司。
二、藥品及溶液之配製 (一)藥品
1.本實驗所使用的醣類標準品皆為分析級試藥，均購 Sigma 公司，其名 稱及分子式如下：
葡萄糖(Glucose，C6H12O6，FW=180.16) 半乳糖(Galactose，C6H12O6，FW=180.16) 甘露糖(Mannose，C6H12O6，FW=180.16) 甘露醇(Mannitol，C6H14O6，FW=182.17)
2.以下試藥皆為 Merck 公司出品的分析級試藥，其名稱及分子式如下:
氫氧化鈉(Sodium hydroxide，NaOH，FW=40) 氯化鉀(Potassium chloride，KCl，FW=74.55)
(二)溶液之配製
1.緩衝液(running buffer)配製
秤取 40.0g NaOH，以純水溶解並稀釋至 1000ml，即得 1.0M NaOH 溶 液裝入 PE 瓶中，配製其它較低濃度 NaOH 溶液時，可由 1.0M NaOH
溶液以純水適當稀釋即可。秤取1.1183g KCl，以 0.050M NaOH 溶解並 稀釋至 100.0ml，得到 0.050M NaOH, 0.15M KCl 緩衝液。
2.醣類標準儲存溶液 (a)葡萄糖溶液：
秤取 0.0360g 葡萄糖粉末，以緩衝液溶解並稀釋至 20.0ml，得到 10.0mM 葡萄糖溶液，當要配製其它較低濃度時，再以緩衝液稀釋即 可。
(b)半乳糖溶液：
秤取 0.0360g 半乳糖粉末，以緩衝液溶解並稀釋至 20.0ml，得到 10.0mM 半乳糖溶液，當要配製其它較低濃度時，再以緩衝液稀釋即 可。
(c)甘露糖溶液：
秤取 0.0360g 甘露糖粉末，以緩衝液溶解並稀釋至 20.0ml，得到 10.0mM 甘露糖溶液，當要配製其它較低濃度時，再以緩衝液稀釋即 可。
(d)甘露醇溶液：
秤取 0.0364g 甘露醇粉末，以緩衝液溶解並稀釋至 20.0ml，得到 10.0mM 甘露醇溶液，當要配製其它較低濃度時，再以緩衝液稀釋即
可。
以上醣類溶液均當天配製使用。
三、北冬蟲夏草萃取與配製方法 (一)材料
由某生技公司提供之冬蟲夏草樣品
某生技公司培育之北冬蟲夏草(Cordyceps militaris)子實體。
(二)方法
1.樣品之抽取
精確秤取(一)材料項中由某生技公司所提供之北冬蟲夏草樣品 5.0 克，於 250ml 圓底燒瓶中，加水 50ml，置於 60℃水浴器中加熱 1 小時，過濾，再加 50ml 水，重複上步驟，直到抽出液無色。合 併抽出液，濃縮至乾，秤重。
2.樣品溶液之製備
精確稱取(二)方法將北冬蟲夏草樣品抽取物各 25.0mg，加入緩 衝液稀釋至 25.0ml，經 0.45µm 濾膜過濾後成毛細管電泳定量分析 之檢品。
3.D-Mannitol 標準溶液之製備及檢量線之建立
精確吸取 D-Mannitol 標準儲存溶液，以緩衝液稀釋調配成
5.00、3.00、1.00、0.50、0.30、0.10、0.050、0.030、0.010、0.0050mM 等 10 種濃度標準溶液，經 0.45µm 濾膜過濾後，以電壓注入法注入 毛細管 10 秒鐘，進行分析。以毛細管電泳圖(Electropherogram)之 標準品波峰電流值為 Y 軸，濃度為 X 軸，繪圖製作檢量線，並求 得其線性迴歸方程式(y = ax + b)及相關係數(R)。
4.D-Mannitol 之再現性試驗
在同一天內，以緩衝液稀釋調配成 0.50mM 濃度標準溶液，利
用相同的分析條件做16 次同樣的分析，計算相對標準偏差(RSD)，
求其再現性。
5.分析條件
毛細管：內徑 20µm，外徑 150µm，長度 20cm。
分離電壓：3.50KV。
緩衝液(running buffer)：0.05M NaOH, 0.15M KCl。
樣品注入方式：電壓注入法。
樣品注入時間：10 秒。
工作電極：改良式柱狀銅電極，直徑 180µm。
參考電極：銀/氯化銀電極(3.0M NaCl)。
輔助電極：白金電極。
偵測電位：0.40V。
四、改良式柱狀銅電極之製作
以細純銅絲(直徑 180µm)插入長 3.5cm、內徑 250µm、外徑 350µm 之毛 細管內，一端露出銅絲，另一端再以 Epoxy 封埋銅絲與毛細管出口邊緣，
並露出約 5.0mm 的銅絲(見圖 7A)。圖 7B 為傳統式盤狀銅電極。
五、改良式柱狀銅電極之前處理與再生
改良式柱狀銅電極使用之前，先用細砂紙(1000 號)將電極前端磨平，
再用更細的砂紙(4000 號)將銅電極表面拋光，最後在酒精溶液，使用超音 波振盪器振盪 10 秒，然後利用微操控器將此銅電極送入電化學偵測槽內，
槽內進行毛細管電泳之分離電解質溶液，然後在 0.0V~+0.80V(vs.Ag/AgCl) 的電位範圍內，以 100mV/sec 掃瞄速率連續做循環伏特安培法(cyclic voltammetry, CV)之電位掃瞄活化電極，每次實驗進行之前，皆進行此活化
電極的過程，連續掃瞄兩次氧化還原反應，以縮短安培法偵測時背景訊號 達到穩定所需的時間。
六、外加套管之高電壓分離裝置
以長 4.0cm、內徑 200µm、外徑 350µm 的毛細管作為本實驗所使用之 分離毛細管的外接套管，將套管的一端置於電泳平檯上之高電壓槽，另一 端則與毛細管出口端一同置於電化學偵測槽內作為分離毛細管外加套管，
及施加另一高電壓進行分析研究(見圖 8)。
七、實驗過程
電化學的方法是利用三電極系統來進行偵測。圖 8 是本實驗中所使用 的改良式毛細管電泳電化學偵測法之系統裝置，其中 W.E.、R.E.、C.E.分別 表示工作電極(Working electrode)、參考電極(Reference electrode)及輔助電極 (Counter electrode)，使用的工作電極是改良式柱狀銅電極，參考電極是銀/
氯化銀 (3.0M NaCl 溶液中保存)電極，而輔助電極是白金電極。
新毛細管在第一次使用時，要先用針筒連接毛細管，先將純水推擠入 毛細管內，然後再改抽 0.10M NaOH 溶液，之後，將此充滿 0.10M NaOH 溶液之毛細管置於毛細管電泳系統中，施加分離電壓利用電滲流沖洗毛細 管約 30min，然後，改用分離之緩衝液沖洗毛細管，待毛細管內電流值達到 穩定即可進行分析。
之後，在每次進行樣品的分析之前，亦需先以分離之緩衝液在相同的 分離電壓下，利用電滲流沖洗毛細管，使其達到穩定的狀態。再將活化過 的銅電極，利用微操控器送到最接近毛細管的出口端，但是不碰觸到毛細 管距離大約 50µm 處，以免阻礙到毛細管的出口端，而影響到偵測結果。樣 品的注入則採用電壓注入法的方式，注入數秒，施加的電壓為進行毛細管 電泳分離時所使用的電壓，樣品的偵測則以安培法偵測之，再由電腦記錄
實驗資料。
在每次分析完一次樣品之後，必須更換毛細管注入端及出口端的電解 液，因為防止不同樣品之間的干擾，再進行下一次的樣品分析。各種醣類 標準儲存溶液的循環伏特安培圖是在一容積30ml 的圓筒形電化學偵測槽中 所測得，使用的銅電極及銀/氯化銀參考電極皆與進行毛細管電泳偵測時所 使用的相同，輔助電極為白金電極，而電位掃瞄是以CHI-630a 電化學分析 儀來控制。
第三章 結果 一、D-Mannitol 及醣類產生氧化電流的情形
本實驗是以安培偵測法的方式偵測 mannitol 及其他醣類，當工作電極 施加不同電位時，分析物的氧化電流可能會隨之不同，所以必須選擇適當 的偵測電位來偵測分析物。醣類在鹼性情況下，被銅電極催化作用，例如 glucose →gluconic acid 產生，單醣類會產生 12 個電子，雙醣類會產生 3~13
個電子，因而被偵測到(84-90)。其化學反應式為:
R-CHO+2Cu2+(aq)+5OH-(aq)→R-COO-+Cu2O(s)+3H2O(l)
在強鹼性溶液下，可與銅電極氧化反應，由不同價數銅離子狀態，產 生一連串可逆氧化反應，反應平衡方程式如下(91,92)：
2Cu+2OH- ⇌ Cu2O+H2O+2e- (1) Cu+2OH- ⇌ Cu(OH)2+2e- (2) Cu2O+6OH- + H2O ⇌ 2Cu(OH)2-4 +2e- (3) Cu2O+2OH- + H2O ⇌ 2Cu(OH) 2 +2e- (4) Cu+2OH- ⇌ CuO+H2O+2e- (5)
其中以 Cu2+離子參與反應較多，醣類被銅催化反應，產生氧化物或氫氧化 物，進而偵測到分析物電流值(85)，而且在高pH 值下，會增加電滲流的產生
(93-95)。圖 9 是冬蟲夏草中含有 mannitol 及一些可能並存的醣類之結構式；
圖 10 為緩衝液中，以 100mV/sec 的掃瞄各分析物所得到的循環伏特安培
圖。由圖10B 可以看出 mannitol 約在+0.30V 左右就有氧化電流產生，而在 +0.30V~+0.80V 之間有氧化電流產生，其他醣類也在這範圍內，所以可以在 這電位範圍內選擇最佳偵測電位，並根據莊清訓學長(96)在流體動力伏特安 培法中所偵測到醣類氧化電位+0.40V 之下有較大的氧化電流產生，因此選 擇此電位來作分析。
二、D-Mannitol 及醣類於 0.050M NaOH 添加不同 KCl 濃度對氧化電流的影 響
根據 mannitol 及其他醣類在最佳偵測電位下於 NaOH 中產生氧化電流 的情形(96)，因此本實驗在 0.050M NaOH 中添加不同 KCl 濃度對 mannitol 及其他醣類分析探討。由圖 11 可得知，當所添加的 KCl 隨著濃度逐漸增加，
所有分析物的氧化電流則逐漸減少。因此選擇在 0.050M NaOH 添加 0.15 KCl 作為北冬蟲夏草樣品中 mannitol 及其他醣類的分離。
三、改良式柱狀銅電極與傳統式盤狀銅電極效能之探討
經由圖 7 中工作電極在設計形態上的不同，因此來做偵測上的比較：
(一) D-Mannitol 偵測極限及再現性測定之比較
於表 1 的實驗條件下，圖 12 為 mannitol, galactose, glucose 和 mannose 偵測於改良式工作電極之毛細管電泳圖，各分析物之平均移動時間分別是
mannitol 約為 484 秒，galactose 約為 716 秒，glucose 約為 763 秒，而 mannose 則約為 844 秒，相較於圖 13 的傳統式工作電極下，背景雜訊約 0.002nA，
降低約 30~40 倍。由圖 14 可知，使用改良式工作電極 mannitol 之最低偵測 極限濃度可達 5.0µM，並且 s/n(signal/noise)≧2，與傳統式工作電極 mannitol 之最低偵測極限濃度達50µM 做比較(見圖 15)。以 0.50mM mannitol 之標準 溶液，在連續重複注入分析16 次(見圖 16)，所得到氧化電流訊號的再現性，
以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示為 3.49%；而傳統式工
作電極在連續重複注入分析 15 次(見圖 17)，所得到氧化電流訊號的再現 性，以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)表示為 4.77%。再現性 皆小於 5%，在可接受的誤差範圍內。
(二)D-Mannitol 檢量線測定之比較
D-Mannitol 之移動時間(migration time)約為 480(±7)秒，由圖 18 得知在 改良式工作電極所測得之檢量線線性範圍為0.0050mM~5.00mM，檢量線方 程式為 y = 1.00×10-6x+ 1.00×10-10 (R=0.9989，n=3)。圖 19 中，傳統式工作 電極所測得之檢量線線性範圍為 0.050mM~5.00mM，檢量線方程式為 y = 7.00×10-7x+ 9.00×10-11 (R=0.9977，n=3)。
四、北冬蟲夏草樣品中，D-Mannitol 及其他醣類的分析結果
由於北冬蟲夏草樣品本身所含的 mannitol 外，還有其他的醣類存在。
利用毛細管電泳-電化學偵測法偵測並鑑定樣品中的 mannitol 及其他醣類，
由圖 20 可看到分析樣品之毛細管電泳圖，為了確定冬蟲夏草樣品中之 mannitol 及其他所含的醣類，因此在分析樣品中分別加入醣類標準品，藉由 所加入的單一標準品造成樣品單一波峰電流的增加來確定分析樣品中特定 醣類的存在。將樣品添加 0.50mM mannitol，當樣品中 mannitol 波峰電流從 原來的 0.38nA 增加至 1.47nA，確定樣品中 mannitol 的存在(見圖 21)。圖 22 中，添加 0.50mM galactose 時，分析樣品之電泳圖中有獨立的單一波峰 電流產生，更可區分其他醣類；另外，圖23 中添加 0.50mM glucose 時，樣 品中所含 glucose 的波峰電流從原來的 0.08nA 增加至 0.36nA，但也影響到 鄰近的分析物的波峰電流大小及移動時間，其中以 glucose 的移動時間縮短 約 50 秒，及其後 mannose 的波峰電流也增加約 0.28nA。最後添加 0.50mM mannose 時，樣品中所含 mannose 的波峰電流從原來的 0.14nA 增加至 0.38nA，也縮短樣品中 glucose 和 mannose 的移動時間各約 100 秒較為明顯 (見圖 24)。
五、北冬蟲夏草樣品及配製成溶液時的儲存時間與成份含量之探討
分別在不同的天數中，以同一樣品進行分析，對於北冬蟲夏草樣品及
以添加 0.15M KCl 的 0.05M NaOH 稀釋成溶液時的儲存時間比較，而儲存 的條件於 4℃冷藏保存，當樣品稀釋成溶液時，mannitol 的濃度為 0.34mM，
mannose 的濃度為 0.24mM，glucose 的濃度為 0.16mM。由圖 25 可得知 mannitol 和其他醣類的濃度分別於稀釋後第 2 天濃度開始降低，於第 6 天後 mannitol 降低至 47%，mannose 降低至 40%，其中以 glucose 降低至 8%為 最多。另外再將樣品分別於不同天重新配製並稀釋，樣品在第 18 天和第 23 天時mannitol 及其他醣類濃度降低，再經由第 112 天的測量，可發現 mannose 降低至 25%，mannose 降低至 18%，其中以 glucose 降低至 8%為最多(見圖 26)。圖 27 為樣品於第 112 天測量之毛細管電泳圖，其中以 mannitol 的波峰 電流為 0.21nA 尚可觀察出。
六、工作電極與分離毛細管出口端外接套管的效應
毛細管在外接套管的情形下有助於和工作電極對齊，因此對工作電極 與分離毛細管出口端外接套管在不同的距離下所產生的影響作探討。首先 將分離毛細管伸出套管外約 2.50mm，與工作電極分析 mannitol 及其他醣類 (見圖 28)。圖 29~30 為工作電極與分離毛細管出口端外接套管時各波峰電 流的變化及移動時間之影響關係，當工作電極剛好位於套管出口端時，可 知所有分析物的移動時間皆為縮短，其中 mannitol 縮短約 33 秒(約 7%)、
galactose 縮短約 83 秒(約 12%)、glucose 縮短約 102 秒(約 14%)，mannose
則縮短約 129 秒(約 16%)；分析物的波峰電流也分別降低，mannitol 降低約 0.24nA(約 30%)、galactose 降低約 0.14nA(約 28%)、glucose 降低約 0.10nA(約 50%)，mannose 則降低約 0.08nA(約 27%)。而將工作電極伸入套管約 1.25mm 時可觀察出，分析物的波峰電流降至最低，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 0.14nA、galactose 約 0.08nA、glucose 約 0.03nA，mannose 則約 0.10nA，分析物的移動時間也更加縮短，其中 mannitol 縮短約 60 秒(約 12%)、galactose 縮短約 151 秒(約 22%)、glucose 縮短約 192 秒(約 26%)，
mannose 則縮短約 256 秒(約 32%)。當工作電極伸入套管約 2.50mm 時，分 析物的波峰幾乎完全消失。分別將工作電極伸入套管約 3.75mm 和 5.00mm 時皆產生單一波峰電流約 375 秒及 396 秒。而各分析物的波峰電流若依照 未接套管時 mannitol 及其他醣類的比例計算，在 3.75mm 時分別為 mannitol 約 1.06nA、galactose 約 0.75nA、glucose 約 0.33nA，mannose 則約 0.44nA。
而在 5.00mm 時，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 2.12nA、galactose 約 1.43nA、glucose 約 0.64nA，mannose 則約 0.83nA(見表 3~4)。
七、工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓的效應
藉由毛細管在外接套管中和工作電極對齊下，並在套管另一端施加另 一電壓(見圖 7)，使電壓經由套管產生電滲流反應，來評估毛細管在雙重電 壓下的分離情形。當未對套管施加電壓時，高電壓源產生 0.016~0.018mA
電流值，因此依照套管施加電壓後所產生的電流值大小分成：
(一)套管施加電壓後高電壓源產生 0.030±0.002mA 電流值之分析
首先將分離毛細管伸出套管外約2.50mm，且在不對套管施加電壓下，
進行 mannitol 及其他醣類的分析(見圖 31)，之後則開始依照工作電極伸入 套管的距離，並施加電壓，來做比較。圖 32~33 為工作電極與分離毛細管 出口端外接套管於施加電壓後高壓電源產生 0.030±0.002mA 電流值對各波 峰電流的變化及移動時間之影響關係。最初也在相同位置對套管施加電 壓，此時所有分析物移動時間皆縮短約 10~20 秒左右(約 3~4%)，其中 mannose 則 縮 短 約 52 秒 ( 約 8%) ； 分 析 物 的 波 峰 電 流 也 分 別 降 低 約 0.06~0.02nA(約 18~8%)。當工作電極剛好位於套管出口端時，所有分析物
的移動時間皆為縮短，其中 mannitol 縮短約 23 秒(約 5%)、galactose 縮短約 40 秒(約 7%)、glucose 縮短約 36 秒(約 6%)，mannose 則縮短約 62 秒(約 10%)；
分析物的波峰電流也分別降低約0.08~0.04nA(約 27~16%)更為稍稍下降。再 將工作電極伸入套管約 1.25 和 2.50mm 時，所有分析物的波峰電流幾乎完 全消失，當工作電極伸入套管約 3.75mm 和 5.00mm 時也產生單一波峰電 流，移動時間約 450 秒及 470 秒。各分析物的波峰電流若依照未接套管和 未施加電壓時 mannitol 及其他醣類的比例計算，在 3.75mm 時分別為 mannitol 約 0.80nA、galactose 約 0.41nA、glucose 約 0.25nA，mannose 則約 0.32nA。而在 5.00mm 時，各分析物的波峰電流分別為 mannitol 約 0.64nA、
galactose 約 0.32nA、glucose 約 0.20nA，mannose 則約 0.25nA(見表 5~6)。
相較於未加電壓下，施加電壓時所有的分析物其波峰電流逐漸下降，而移 動時間減少將近約 120 秒。
(二)套管施加電壓後高壓電源產生 0.050±0.002mA 電流值之分析
同樣將分離毛細管伸出套管外約2.50mm，且在不對套管施加電壓下，
來進行 mannitol 及其他醣類的分析(見圖 34)，之後則開始依照工作電極伸 入套管的距離，並施加電壓，來做比較。圖 35~36 為工作電極與分離毛細 管出口端外接套管於施加電壓後高壓電源產生 0.050±0.002mA 電流值對各 波峰電流的變化及移動時間之影響關係。最初也在相同位置對套管施加電 壓，此時分析物的波峰電流也開始降低，其中 mannitol 降低約 0.72nA(約 44%)、galactose 降低約 0.09nA(約 17%)、glucose 降低約 0.09nA(約 33%)，
mannose 則降低約 0.12nA(約 27%)；所有分析物的移動時間皆開始縮短，
mannitol 縮短約 2 秒左右(約 0.4%)差異不大，其他如 galactose 縮短約 15 秒 (約 2%)、glucose 縮短約 11 秒(約 2%)，mannose 則縮短約 18 秒(約 2%)。當 工作電極剛好位於套管出口端時，各分析物的波峰電流也分別降低，
mannitol 降低約 0.83nA(約 50%)、galactose 降低約 0.18nA(約 33%)、glucose 降低約 0.18nA(約 67%)，mannose 則降低約 0.22nA(約 48%)；分析物的移動 時間皆更為縮短，mannitol 縮短約 5 秒(約 2%)、galactose 縮短約 33 秒(約 5%)、glucose 縮短約 35 秒(約 5%)，mannose 則縮短約 60 秒(約 8%)。之後，
同樣將工作電極伸入套管約 1.25mm、0.25mm、3.75mm 和 5.00mm 時，則 沒有任何波峰電流產生(見表 7~8)。
八、工作電極與分離毛細管出口端外接套管產生單一波峰電流的鑑定 分別將 mannitol 及三種醣類直接以工作電極伸入套管約 3.75mm 處偵 測，此時每種分析物皆有單一波峰電流產生，同樣的在 5.00mm 處時，每種 分析物也皆有單一波峰電流產生，因此可確定實驗中產生的單一波峰電流 包含了 mannitol 及三種醣類存在(見圖 37~38)。
第四章 討論
一、D-Mannitol 及醣類於 0.050M NaOH 添加與不添加 KCl 的探討
由於本實驗所使用的毛細管長度為20cm，根據莊清訓學長的實驗中，
若只以 0.050M NaOH 當緩衝液是無法將 mannitol, galactose, glucose 和 mannose 分離的，必須再另添加其他電解質來幫助分離，且在經過多種電解 質的測試，選擇以背景雜訊小、分離效果較佳的 KCl 添加於 0.050M NaOH 中，當添加 KCl 的濃度越高，移動時間越長，波峰電流也隨著降低是已知 的，因此選擇在 0.050M NaOH 中添加 0.15M 的 KCl 作為 mannitol 及其他醣 類緩衝液的分離條件。而由本實驗可證實，是因為添加 KCl 的濃度越高造 成氧化電流的降低，與移動時間的延長無關。
二、改良式工作電極設計形態的影響
一般毛細管電泳所使用的偵測銅電極皆封於毛細管內，我們所使用的 工作電極是將銅絲露出於包圍的毛細管外約 5.0mm 處，藉此可使銅絲與毛 細管剛好置放於偵測槽內，讓銅絲和毛細管出口端保持約 0.050mm 處，不 碰觸到毛細管，而達到最佳的偵測效果，與原傳統型式電極比較下，偵測 極限可得 5.0µM，約降低 10 倍；背景雜訊約 0.002nA，約降低 30~40 倍；
再現性為 3.49%，傳統電極為 4.77%；檢量線的線性範圍為 0.0050~5.00mM、
斜率為 1.00×10-6、相關係數為 0.9989，傳統電極之檢量線的線性範圍為
0.050~5.00mM、斜率為 7.00×10-7、相關係數為 0.9977。由此比較下，改良 式柱狀銅電極的偵測靈敏度較高。
三、北冬夏草樣品分析的探討
為了鑑定北冬夏草樣品中 mannitol 和其他醣類的存在，因此分別添加 0.50mM 的 mannitol, galactose, glucose 和 mannose 於樣品內，並依序對樣品
中 mannitol 及可能存在的醣類做鑑定。由鑑定結果可知，北冬蟲夏草所含
mannitol, mannose 和 glucose，與文獻之冬蟲夏草的含醣組成(mannitol, mannose, glucoesl 和 galactose)不同。而本實驗之北冬蟲夏草中 mannitol 的
含量為 31.39(mg/g) ，mannose 的含量為 21.83(mg/g)，glucose 的含量為 13.83(mg/g) 。
四、工作電極與分離毛細管外接套管的效應探討
毛細管與工作電極的對齊一直為毛細管電泳結合電化學法的一大難 題，為了讓毛細管能和工作電極對齊，則是使用顯微鏡和放大鏡當輔助工 具，若在技術不純熟下，往往會造成實驗上的誤差，因此對分析的工作會 產生相當大的麻煩，所以我們使用外接套管將分離毛細管固定，除了可以 方便毛細管直接與工作電極對齊外，更可以評估毛細管與工作電極靠近的 距離。由圖 28 可知，當將工作電極伸入套管時，分析物的波峰電流會逐漸
降低，甚至消失，且移動時間也逐漸縮短。當工作電極伸入套管一半以上(約 3.75mm)時，會產生較大單一波峰電流，移動時間也同樣縮短。
五、工作電極與分離毛細管出口端外接套管並施加電壓的效應
另外，我們也在套管處施加另一電壓，主要是要探討分離毛細管及外 接套管同時施加電壓在雙重電滲流作用下的影響。由圖 31 和圖 34 可知，
當 將 工 作 電 極 伸 入 套 管 並 同 時 對 套 管 施 加 電 壓 ， 在 高 電 壓 源 產 生 0.030±0.002mA 和 0.050±0.002mA 電流值下，分析物的波峰電流會比未施加 電壓時降低，但移動時間並不會有太大的改變，可能為對套管施加電壓後，
電流值增加而產生較大的焦耳熱，且因熱效應的緣故，導致電雙層的極化 作用，因而改變電滲流的流速，使離子的擴散係數和遷移率受到影響。當 施加電壓後產生的電流值愈大，背景訊號會隨著波動，甚至會有雜訊產生，
而單一波峰電流也隨之消失。
