3-1. 美白與抗氧化之體外評估試驗
本方法利用擬超氧岐化? 活性試驗及總抗氧化力活性試驗，來評 估具美白、抗氧化潛力之中草藥。
3-1-1. 擬超氧岐化? 活性試驗
圖十二至圖十四為檢品濃度與 NBT 抑制率之關係圖，如表五 及圖十五所示，可以發現紅景天、呂宋莢? 及欖仁葉在這組藥材 中超氧歧化? 含量較高。
3-1-2. 總抗氧化力活性試驗
圖十六為 L-維他命 C 濃度為 50、100、200、400、600 和 1000 µM，於 15 分鐘內 ABTS 自由基延遲時間與吸光值之關係 圖。利用 L-維他命 C 的濃度與延遲時間的關係作標準曲線。決定 係數 (R2)大於 0.999，線性關係良好 (圖十七)。
圖十八至二十為 15 分鐘內，測試檢品的延遲時間與吸光值 的關係圖。計算延遲時間後，對照 L-維他命 C 的標準曲線圖，計 算產生相同延遲時間之 L-維他命 C 濃度。如表六及圖二十一所
示，可以發現總抗氧化力活性大小比較，紅景天、呂宋莢? 及欖 仁葉在這組藥材中總抗氧化力較高。
表五 測試檢品超氧歧化? 活性 (依活性大小之排列)
中草藥測試檢品 每毫克藥材之超氧歧化? 含量 (U/mg) n=3
紅景天 3063.38±37.25
呂宋莢? 1677.18±38.11
欖仁葉 1276.12±25.43
葡萄籽 821.03±18.88
紅子莢? 724.93±15.81
旱蓮草 558.24±7.41
靈芝 331.80±4.31
台灣黃柏 275.31±4.81
黑星紫金牛 250.42±3.57
香菇 248.02±5.24
生毛將軍 155.81±2.81
台灣葛根 136.90±2.08
台灣醉魂藤 127.86±0.82
桑葉 79.56±2.08
綠藻 71.71±1.85
大白柚皮 32.64±0.85
石蓮 19.89±0.54
y = 14.775x - 4.5589
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 14.994x - 10.207
Inhibition of NBT Reduction (%)
(1) 台灣黃柏 (2) 黑星紫金牛
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 8.3502x + 35.256
Inhibition of NBT Reduction (%)
(3) 台灣醉魂藤 (4) 旱蓮草
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 0.9508x + 37.116
Inhibition of NBT Reduction (%)
(5) 大白柚 (6) 綠藻
圖十二 測試檢品抑制 NBT 之還原活性關係圖 (I)
y = 3.6762x + 26.604
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 8.1575x + 16.901
Inhibition of NBT Reduction (%)
(7) 生毛將軍 (8) 香菇
Inhibition of NBT Reduction(%)
y = 43.363x - 3.3332
Inhibition of NBT Reduction (%)
(9) 台灣葛根 (10) 葡萄籽
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 3.7744x + 2.158
Inhibition of NBT Reduction (%)
(11) 紅仔莢? (12) 桑葉
圖十三 測試檢品抑制 NBT 之還原活性關係圖 (II)
y = 11.353x + 15.836
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 76.351x + 5.9097
Inhibition of NBT Reduction (%)
(13) 靈芝 (14) 呂宋莢?
Inhibition of NBT Reduction (%)
y = 62.55x + 0.2131
Inhibition of NBT Reduction (%)
(15) 石蓮 (16) 欖仁葉
Inhibition of NBT Reduction (%)
(17) 紅景天
圖十四 測試檢品抑制 NBT 之還原活性關係圖 (III)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
紅景天 呂宋莢? 欖仁葉 葡萄籽 紅子莢? 旱蓮草 靈芝 台灣黃柏 黑星紫金牛 香菇 生毛將軍 台灣葛根 台灣醉魂藤 桑葉 綠藻 大白柚皮 石蓮
中草藥測試檢品
超氧歧化?含量 (U/mg)
圖十五 測試檢品超氧歧化? 活性之比較圖
0
0 200 400 600 800 1000 1200
L-維他命 C 濃度(uM)
Lag time(sec)
圖十七 不同濃度 L-維他命 C 延遲時間之線性關係圖
0
0
0
表六 測試檢品總抗氧化力活性 (依活性大小之排列)
中草藥測試檢品 每克藥材相當於維他命 C 之微克數 (µ g/g) n=3
呂宋莢迷 263679.52±6237.73
紅景天 247603.45±6549.65
欖仁葉 235226.49±6765.08
葡萄籽 228257.75±5617.48
紅子莢迷 163163.76±4563.53
黑星紫金牛 146230.4±4018.83
台灣黃柏 76508.92±1639.39
靈芝 34466.04±646.09
旱蓮草 31916.8±657.97
生毛將軍 25020.72±436.98
香菇 23538.97± 576.58
台灣葛根 12681.73±226.69
大白柚皮 9428.46±143.82
桑葉 8179.21±89.17
台灣醉魂藤 6035.34±158.45
海藻 3826.89± 107.73
石蓮 －
－: 無法測得
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000
呂宋莢迷 西藏紅景天 欖仁葉 葡萄籽 紅子莢迷 黑星紫金牛 台灣黃柏 靈芝 旱蓮草 生毛將軍 香菇 台灣葛根 大白柚皮 桑葉 台灣醉魂藤 海藻 石蓮
中草藥檢測樣品
相當於Vit.C之量 (ug/g)
圖二十一 測試檢品總抗氧化力活性比較圖
3-1-3. 具有美白、抗氧化潛力的中草藥比較
依據擬超氧岐化? 活性試驗及總抗氧化力活性試驗，其活性 比較，紅景天、呂宋莢? 及欖仁葉有較高抗氧化活性，為具有美 白、抗老化潛力之中草藥。而呂宋莢? 因氣味不佳，且少有藥用 記載文獻，故選擇紅景天、欖仁葉繼續深入研究，作為中草藥美 容化妝品的成分。
3-2. 中草藥層析指紋圖譜之建立與確效
中藥指紋圖譜是指中藥材或中成藥中，所共有的具有特徵性的某 類或幾類成分的色層分析或光譜的圖譜 66。其特點是 1. 經由指紋圖 譜的特徵性，能有效鑑別檢品的真偽；2. 經由指紋圖譜主要特徵峰 的面積和比例的制定，能有效控制檢品質量，保證檢品質量的相對安 定。指紋圖譜已成為國際公認品管天然藥物品質的最有效方法。
欖仁葉之指紋圖譜已由楊惠雯所建立 67。本方法主要針對紅景 天來進行指紋圖譜建立及確效。
1. 分析條件:
流速使用 1 ml/min，移動相是甲醇及 0.1 % 磷酸緩衝溶液 (pH 2.4)組成，以梯度方式沖提，其比例變化如表七所示。
2.分析波長之選擇:
圖二十二至二十六為高效液相層析法以 PDA 作為檢測器，所 檢測出五種波長的層析圖，波長分別為 210、254、280、330 及 500 nm，發現以波長 330 nm 所呈現出的層析峰較多，對於 確效較容易進行，故選擇 330 nm 作為確效分析的波長。指標
成分紅景天? 於滯留時間 10.84 分鐘出現。
3. 層析峰之再現性:
以上述之分析條件，每日做一次 HPLC 分析確效，共做 6 日，
可發現有 12 支層析峰變異係數均在 10 % 以內 (表八)。
顯示此分析方法之再現性良好。
表七 紅景天層析之移動相梯度表
時間 (分鐘) MeOH (%) 0.1 % 磷酸緩衝溶液 (%)
0 5 95
15 15 85
60 30 70
90 45 55
105 60 40
115 75 25
125 100 0
圖二十二 紅景天 HPLC 之 PDA 層析圖 (波長 210 nm)
0 20 40 60 80 100 120
Retention Time (min) 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Intensity (AU)
圖二十三 紅景天 HPLC 之 PDA 層析圖 (波長 254 nm)
0 20 40 60 80 100 120
Retention Time (min) 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Intensity (AU)
圖二十四 紅景天 HPLC 之 PDA 層析圖 (波長 280 nm)
0 20 40 60 80 100 120
Retention Time (min) 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Intensity (AU)
圖二十五 紅景天 HPLC 之 PDA 層析圖 (波長 330 nm)
0 20 40 60 80 100 120
Retention Time (min) 0.000
0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035
Intensity (AU)
紅景天?
圖二十六 紅景天 HPLC 之 PDA 層析圖 (波長 500 nm)
0 20 40 60 80 100 120
Retention Time (min) 0.00
0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14
Intensity (AU)
表八 紅景天層析峰之再現性分析 (C.V.＜10%)
日 1 2 3 4 5 6
峰 RT Area RT Area RT Area RT Area RT Area RT Area Average C.V. (%) 1 10.84 380959 10.63 328382 10.66 377951 9.89 324396 9.69 380127 10.57 389541 363559.3 8.0 2 26.52 324721 26.28 305593 26.23 353073 24.79 318285 25.01 341818 26.01 330885 329062.5 5.1 3 30.52 208079 30.27 179364 30.21 208838 28.59 203179 28.93 210836 29.99 206222 202753.0 5.7 4 34.28 110254 33.99 95413 33.93 111029 32.08 122965 32.55 122872 33.73 119092 113604.2 9.2 5 37.84 103760 37.49 89012 37.41 99386 35.08 83460 35.65 87548 37.15 93420 92764.3 8.2 6 40.27 246644 39.84 215114 39.75 248894 36.89 253769 37.55 247675 39.4 259833 245321.5 6.3 7 42.07 221572 41.73 189255 41.68 218119 39.32 232819 39.81 236294 41.2 240022 223013.5 8.3 8 49.57 187808 49.09 156062 49.08 185443 45.32 193863 46.35 188177 48.48 189016 183394.8 7.4 9 56.33 831784 55.85 721185 55.81 837614 52.28 761279 53.36 789198 55.32 844594 797609.0 6.1 10 62.57 529145 62.12 452473 62.19 518058 58.89 481980 60.12 482237 61.72 487170 491843.8 5.6 12 108.83 309124 108.83 265797 108.88 306662 107.79 263496 108.59 303222 108.85 311809 293351.6 7.6 RT: Retention time
3-3. 中草藥之皮膚及眼球刺激性試驗
表十 眼睛刺激性評分 (中草藥之水提取液 0.1 ml))
藥材 時間 評分
1 hr 0
24 hr 0
48 hr 0
紅景天
72 hr 0
1 hr 0
24 hr 0
48 hr 0
欖仁葉
72 hr 0
3-4. 乳霜基劑之研究
從 13 個配方中，依照外觀、塗擦感覺、pH 值、滾球距離 (表 十一，市售乳霜試驗在 4.12 至 5.5 厘米)及離心後是否分層，
來選擇適當的基劑。
如表十二，可以發現配方 5 及 12 無論在外觀、光澤度、塗 擦感覺、滾球距離且離心不分層等綜合評估上，都比其他配 方好。但本試驗主要須添加中草藥成分，所以配方 5 在製法 上，可能因溫度過高而破壞有效成分，又配方 12 在製程上 會比配方快速、便利，所以本試驗選擇配方 12 作為中草藥 乳霜之基劑。
表十一 市售乳霜之滾球距離試驗 (C.V.＜2%)
乳霜 滾球距離 (cm) n=6 pH
安芳膠原霜 4.77 4.7
安芳緊緻霜 5.50 5.5
安芳眼脣霜 4.60 4.7
歐夏蕾潤膚霜 4.45 5.3
資生堂滋潤霜 4.65 5.5
盛香堂雪芙蘭 4.12 6.1
旁氏嫩白乳霜 4.65 5.2
杏輝愛麗霜 4.45 5.5
表十二 乳霜預配方之評估結果
配方編號 外觀 光澤 pH 塗擦感覺 滾球距離 (cm)
n=6 離心分層否
1 乳白色乳霜 無 5.3 質地硬、不易塗開、油膩 6.4 否
2 亮白色乳霜 有 5.4 質地細緻、易塗開、油膩 4.2 否
3 亮白色乳霜 無 5.3 質地鬆軟、不易塗開、不油膩 10.8 是
4 亮白色乳霜 有 5.2 質地鬆軟、易塗開、油膩 10.5 是
5 亮白色乳霜 有 5.2 質地細緻、易塗開、不油膩 5.1 否
6 乳白色乳霜 無 5.3 質地細緻、易塗開、不油膩 5.2 否
7 亮白色乳霜 有 4.7 質地細緻、易塗開、油膩 5.5 否
8 亮白色乳霜 有 4.7 質地細緻、易塗開、油膩 5.6 否
9 亮白色乳霜 有 4.7 質地鬆軟、易塗開、油膩 3.5 否
10 亮白色乳霜 有 4.7 質地細緻、易塗開、不油膩 5.8 否
11 亮白色乳霜 有 4.7 質地鬆軟、易塗開、不油膩 6.2 否
12 亮白色乳霜 有 4.7 質地細緻、易塗開、不油膩 5.1 否
13 乳白色乳霜 無 5.6 質地細緻、易塗開、不油膩 5.7 否
3-5. 中草藥品管方法
3-5-1. 選擇中草藥之指標成分 1. 紅景天之指標成分:
根據文獻記載 17, 68之紅景天層析指標成分為紅景天?
(salidroside)，最大吸收波長為 223 及 270 nm。且在使用 PDA 進行指紋圖譜確效時，可發現到 10.84 分鐘出現的層 析峰，其最大吸收波長與文獻記載相同 (圖二十七)，依文獻 記載，此峰為紅景天? 。
2. 欖仁葉之指標成分:
參照 Masuda.等人 48對欖仁葉的分析方法，分析出欖仁葉之 指標成分鞣花酸 (ellagic acid)。分析條件為 C-18 層析管 柱，流速 1 ml/min，移動相組成為 0.1 % 磷酸緩衝液 (A) 及 acetonitrile (B)，以梯度沖提。0 分鐘時 A:B=90:10，40 分鐘時 A:B=60:40，50 分鐘時 A:B=0:100。其紫外光光譜及 層析圖譜 (圖二十八、圖二十九)，與文獻上記載相同。依文 獻記載之方法，此層析峰為鞣花酸。最大吸收波長為 254 nm 及 360 nm。
圖二十七 紅景天? 水溶液之紫外光光譜圖
圖二十八 鞣花酸水溶液之紫外光光譜圖
270 nm 223 nm
254 nm
360 nm
2.27 3.09
4.11 4.75 5.57 6.887.33 9.33 10.88 12.67 14.13 15.65 16.67 17.47
18.21 18.99
19.47 22.16 24.85 26.29 34.19 44.03 49.52
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Retention Time (min) 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Absorbance (AU)
鞣花酸
圖二十九 鞣花酸層析圖
3-5-2. 中草藥指標成分之製備 1. 紅景天? 之製備:
取紅景天之水提取液，以 Purospher® STAR RP-18e (5µm) 層析管柱，在移動相 MeOH : H2O =15:85 下，收集滯留時 間為 4.4-4.9 分鐘之紅景天? 層析峰洗出液，於室溫下，氮 氣吹乾後稱重。以微量天平稱重後得到檢品重量為 330 µg。
2. 鞣花酸之製備:
取欖仁葉之水提取液，以 Purospher® STAR RP-18e (5µm) 層析管柱，在移動相 Acetonitrile :HCl buffer (pH 2.4) = 20:80 下，收集滯留時間為 8.8-9.4 分鐘之鞣花酸層析峰洗 出液，於室溫下，氮氣吹乾後稱重。檢品以微量天平稱重得 136 µg。
3-5-3. 指標成分之純度試驗 1. 紅景天? 之純度試驗:
將紅景天? 330 µg 溶於 1 ml 移動相做為檢品。高效液相層 析法之移動相由：Methanol : 0.1 % phosphoric acid solution (pH 2.4)=15:85 所組成。流速:1 ml/min，檢測波長 為 200 nm，Aufs: 0.01，檢品注射量 20 µl。
結果所檢測的層析面積值，占總面積值的 91.19 % (如圖三 十及表十三所示)，其純度為約為 91.19%。
2. 鞣花酸之純度試驗:
將鞣花酸 136 µg 溶於 1ml 移動相做為檢測液。高效液相層 析法之移動相由：Acetonitrile : 0.1 % HCl solution (pH 2.4)=20:80 所組成。分析流速:1 ml/min，檢測波長為 200 nm，Aufs: 0.01，檢品注射量 20 µl。
結果所檢測的層析面積值，占總面積值的 90.05 % (如圖三 十一及表十四所示)，其純度為 90.05%。
3-5-4. 指標成分之標準曲線建立 1. 紅景天? 之標準曲線建立:
利用 HPLC 的分析方法分析之，在紅景天? 濃度
100(330ug/ml)、50.0、25.0、12.5、6.25、3.13 及 0.313%
下，求得各濃度峰的面積值，製備標準曲線。可得相關係數 (r)=0.9997。 (如圖三十二)
2. 鞣花酸之標準曲線建立:
利用 HPLC 的分析方法分析之，在紅景天? 濃度 100 % (136ug/ml)、50.0、33.0、25.0、12.5、6.25、及 3.13%下，
求得各濃度峰的面積值，製備標準曲線。可得相關係數 (r)=0.9994。 (如圖三十三)
表十三 紅景天? 各層析峰面積值及含量百分比。
層析峰 滯留時間 (min) 面積值 層析峰面積百分比 (%) 1 2.46 4072 0.468
2 2.93 7810 0.898 3 4.52 8148 0.937 4 5.57 793383 91.19 5 8.58 2051 0.236 6 11.33 6429 0.739 7 15.97 1340 0.154 8 16.93 29098 3.345 9 21.46 17703 2.035
表十四 鞣花酸各層析峰面積及含量百分比。
層析峰 滯留時間 (min) 面積值 層析峰面積百分比 (%) 1 2.31 6379 2.691
2 3.07 14103 5.789
3 4.08 951 0.391
4 5.01 2802 1.15
5 8.67 635 0.204
6 4.39 219383 90.051
2.46 2.93 4.52 5.57 8.58 11.33 15.97 16.93 21.46
0 10 20 30 40 50 60
Retention Time (min) 0
10 20 30 40 50
Intensity (mV)
紅景天?
圖三十 紅景天? (salidroside)之層析峰純度圖。
2.31 3.07
4.08 5.01
8.67
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Retention Time (min) 0.000
0.005 0.010 0.015 0.020
Intensity (AU)
鞣花酸
圖三十一 鞣花酸 (ellagic acid)之層析峰純度圖
3-5-5. 指標成分之安定性試驗
1. 紅景天? 水溶液之安定性試驗
(1). 在 60℃下，紅景天? 3 % H2O2水溶液每 20 分鐘取樣 分析，共取 7 次，其分解速率常數 (k)為 0.8112 hr-1。 (圖 三十四)
(2). 在 60℃下，紅景天? 0.1N HCl 水溶液，每 1 小時取樣 分析，共取 7 次，其分解速率常數 (k)為 0.1981 hr-1。 (圖 三十五)
(3). 在 60℃下，紅景天? 0.1N NaOH 水溶液，每半小時取 樣分析一次，共取 7 次，其分解速率常數 (k)為 0.5466 hr-1。 (圖三十六)
(4). 在 60℃下，pH 7.0 之紅景天? 磷酸緩衝液，每 3~7 天 取樣分析一次，共取 7 次，其分解速率常數 (k)為 9.0x10-4 hr-1。 (圖三十七)
其結果，紅景天? 於鹼性環境下較不安定。於酸性環境下 較鹼性環境安定。而於 pH 7.0 之磷酸緩衝液下，紅景天? 水溶
其結果，紅景天? 於鹼性環境下較不安定。於酸性環境下 較鹼性環境安定。而於 pH 7.0 之磷酸緩衝液下，紅景天? 水溶