三、 結果 3-1 鱸魚頭腎細胞最適生長條件
首先要找出金目鱸魚頭腎細胞最適合生長細胞濃度及培養條件。因此依據
(94)這篇研究來對鱸魚生長條件做適當調整。 一開始先選擇三種不同細胞數 : 1×106cells/ml、5×105cells/ml 、2.5×105cells/ml；以及二種不同培養時間，分別為 48 小時及 72 小時。
以三種免疫刺激因子，LPS、合成之CpG ODN及合成之GpC ODN來刺激不 同細胞數之頭腎細胞48 小時後以WST-1 偵測在第 24、48、72 小時吸光值 450nm 下細胞增生情況。當細胞數為 1×106cells/ml，以LPS刺激細胞時與控制組比較並 沒有明顯差異；而以合成之CpG ODN刺激細胞時與控制組比較有明顯細胞增生 情形 (p ＜ 0.05, p ＜ 0.01)；而對照組GpC ODN則無任何反應如圖3-1(a)。而 當細胞數為5×105cells/ml，以LPS、合成之CpG ODN及對照組GpC ODN刺激細 胞時與控制組比較都沒有明顯的任何反應如圖3-1(b)。當細胞數2.5×105cells/ml，
以LPS、合成之CpG ODN及對照組GpC ODN刺激細胞時與控制組比較都沒有明 顯的任何反應如圖3-1(c)。
以三種免疫刺激因子，LPS、合成之CpG ODN及合成之GpC ODN來刺激不 同細胞數之頭腎細胞72 小時後以WST-1 偵測在第 24、48、72 小時吸光值 450nm 下細胞增生情況。當細胞數 1×106cells/ml，可明顯得知以LPS刺激細胞時與控制 組比較有明顯細胞增生情形 (p ＜ 0.01)；以合成之CpG ODN刺激細胞時與控制 組比較也有明顯細胞增生情形 (p ＜ 0.05, p ＜ 0.01)；而對照組GpC ODN則無 任何反應如圖3-2(a)。而當細胞數5×105cells/ml，當以LPS刺激細胞時與控制組 比較並沒有明顯差異；而以合成之CpG ODN刺激細胞時與控制組比較有明顯細 胞增生情形 (p ＜ 0.05, p ＜ 0.01)；而對照組GpC ODN則無任何反應如圖 3-2(b)。細胞數2.5×105cells/ml，當以LPS、合成之CpG ODN及對照組GpC ODN 刺激細胞時與控制組比較都沒有明顯的任何反應如圖3-2(c)。
總結在三種不同細胞數 : 1×106cells/ml、5×105cells/ml、2.5×105cells/ml，以 細胞數1×106cells/ml不管是培養在 48 或 72 小時下以CpG ODN刺激都可以成功 促使細胞增生。而培養在48 小時及 72 小時，以細胞數 1×106cells/ml刺激都可以
促使細胞增生，但培養在72 小時下細胞增生效果為較好。因此往後實驗都選擇
將頭腎細胞以細胞數1×106cells/ml培養在 72 小時的條件下來測試細胞增生情況。
3-4 使用 Vybrant Apoptosis Assay Kit 染色法來鑑別出存活、apoptotic 及死亡細胞 族群。
為了得知頭腎細胞與CpG ODN 共同培養 24、48、72 小時後，細胞是否為 存活狀態或是已經走向apoptosis，所以使用Vybrant Apoptosis Assay Kit 來測試 細胞生長狀況，結果如圖3-5、6、7、8、9、10所示。
由圖中可得知當頭腎細胞與CpG ODN 共同培養不管是在 24、48 或 72 小時後，
細胞液，經由流式細胞分析結果得知R2 之 macrophage、neutrophils、及 monocytes 族群由原本9.89% 降至為 8.59%，而貼附在玻璃培養皿上之 R2 族群有 14.79%。
3-6 將巨噬細胞移除後對頭腎細胞增生影響
確定了使用磁珠確實可以去除巨噬細胞後，將頭腎細胞中巨噬細胞移除後以 CpG ODN 刺激頭腎細胞，測試是否依然會有細胞增生情況。
以合成之CpG ODN 及合成之 GpC ODN 來刺激移除巨噬細胞之頭腎細 胞，72 小時後以 WST-1 偵測在吸光值 450nm 下細胞增生情況。結果如圖3-13 所示。
由圖中可明顯得知當以合成之CpG ODN 及對照組 GpC ODN 刺激移除巨 噬細胞之頭腎細胞時，與控制組比較並無任何明顯增生效果。
由此結果可得知當將巨噬細胞移除後以合成之CpG ODN 刺激細胞時並無 任何反應，因此可以推測當以CpG ODN 刺激頭腎細胞增生時是需要有巨噬細胞 存在。
3-7 收集 CpG ODNs 刺激過後上清液對頭腎細胞增生影響
CpG ODNs 並不是直接去誘導促使細胞增生，而是促使細胞產生細胞促進 因子 (PIFs) 作用到標的細胞上而使細胞增生。所以需要收集由 CpG ODNs 刺激 頭腎細胞後所釋出的cytokines 來測試到底細胞促進因子是作用到哪個細胞身上 呢？分別進行三組實驗來找出是由哪個細胞所產生cytokines？及作用到哪個細 胞上。
第一組：將頭腎細胞以合成之CpG ODN 及合成之 GpC ODN 刺激頭腎細 胞24 小時後以 L-15 培養液清洗 3 次將其剩餘 ODN 移除後，再次把頭腎細胞培 養在24 孔盤中 48 小時後收集其上清液。由 CpG ODN 及 GpC ODN 刺激過後之 上清液與頭腎細胞共同培養72 小時後以 WST-1 偵測在吸光值 450nm 下細胞增 生情況。結果如圖3-14所示。
由圖中可明顯得知當以合成之CpG ODN 刺激過後之上清液與控制組之上 清液比較可明顯得知以CpG ODN 刺激過後之上清液可明顯促使細胞增生( p ＜ 0.05)；而對照組 GpC ODN 刺激過後之上清液則無任何反應。
由此結果可得知CpG ODN 刺激過後之上清液可成功的促使頭腎細胞增生。
而吞噬性細胞 (phagocytes)可能扮演著 accessory cells 角色去促使 T 細胞增生。
3-8 使用 CFSE 染色法來鑑別增生之頭腎細胞族群
由之前實驗得知當以CpG ODN 刺激頭腎細胞時會促使細胞增生。為此想要 尋找出CpG ODN 主要是誘使哪個細胞族群增生呢？所以使用 CFSE 染色法來鑑 別出增生細胞族群。結果如圖3-17所示。
當CFSE 染色後以 CpG ODN 刺激結果由圖3-17(a)、(b)可明確得到二個細胞 族群Lymphocytes (R1)及 Macrophages (R2)。
CpG ODN刺激或刺激 48 小時結果來看Macrophages族群都不會進行細胞分裂，
這個結果與(94) 在鳟魚頭腎細胞上觀察得到結果大不相同，如圖3-18所示。
3-9 使用 Concanavalin A 來刺激頭腎細胞測試分裂族群是否為 T 細胞
從CFSE 染色結果(圖3-17)得知在淋巴細胞族群中有一群細胞是不進行分 裂，另一群細胞會隨著培養時間而分裂。為此想知道會進行分裂細胞族群為何，
所以使用Concanavalin A。Concanavalin A 可快速使 T 細胞族群分裂，因此當 CFSE 染色後以 Concanavalin A 刺激結果由圖3-19所示。
由圖中可明顯得知當以LPS、合成之 CpG ODN 及對照組 GpC ODN 所收集 得到之上清液刺激頭腎細胞時，與控制組比較並無任何明顯增生效果。 因此可 以確定所收集得到之上清液是為蛋白質。
3-11 以 SDS-PAGE 來分析金目鱸魚頭腎細胞上清液
以合成CpG ODNs、細菌 DNA 刺激頭腎細胞培養 72 小時離心移除細胞後 取出上清液至10k 蛋白質濃縮過濾離心管再次離心，得到上清液之濃縮液進行蛋 白質電泳分析。設定電泳條件為150 V 跑約 70 分鐘。將蛋白質依分子量大小不 同作分離；接著以硝酸銀套組進行染色染出膠片上之蛋白質。結果如圖 3-21 所 示。
由圖中可觀察得知: Lane A 與 Lane C 比較，可明顯發現 Lane C 比 Lane A 多 出三組不同的bead，根據 marker 比對大概可以推測可能是 IL-1、TNF- 或 IL-12。
四、 討論
在宿主防禦 (host defence) 機制演化的過程中，自軟骨魚類始出現適應性免疫系 統 (adaptive immunity)，因此科學家可藉由各種疫苗之開發，幫助養殖戶降低因 魚病所造成的損失。然而對魚類免疫系統之研究，始終受限於對魚類免疫系基礎 知識之不足與相關試劑之缺乏而進展有限，對於魚病之控制依舊停留在隔離病源 與施用抗生素等傳統方法。近年來由於人類基因體計劃的完成與基因體學的進 展，河豚與斑馬魚之基因體已先後完成定序，對於魚類免疫學的進展提供相當的 助力，魚類CD4、CD8、TCR、MHC-II 等免疫相關分子的基因亦相繼被定序出 來。然而在市場上依然買不到可供辨識B 細胞與 T 細胞之單株抗體，因此本研 究選用南台灣常見的養殖魚種之一尖吻鱸 (Lates calcarifer) 為實驗材料，轉而依 白血球之吸附性與功能之不同，意圖自鱸魚頭腎細胞中分離出具吞噬作用的細胞
如嗜中性球與巨噬細胞。
本研究結果顯示經由 CpG ODNs 刺激吞噬性細胞後會分泌出促使細胞增生 因子，而實驗也証實這些促使細胞增生因子為蛋白質，同時也證實了促使細胞增 生因子可以誘導在淋巴細胞中某一族群的增生。此外，吞噬性細胞在此反應中也 同時扮演如同是accessory cells 角色。
而由結果圖3-21 可以推斷使用 CpG ODN 可以刺激頭腎細胞產生一些促使 細胞分裂因子，如IL-1、IL-12 或是 TNF- 。
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