本研究以目前只經電腦資料庫推定而未有實驗確認的 orf19.2730 為標 的，以啤酒酵母菌為表現平台
，
藉著偵測其蛋白質表現來推測此 ORF 的功 能性。經Coomassie blue staining 檢測未觀察到明顯的表現。另由實驗室 已構築的 pET∆5T 系列質體擷取 HA3His6 片段做為標籤，連接在去除 3’端stop codon 的 orf19.2730 下游，再以西方轉漬分析偵測，發現其確實能 夠表現。將orf19.2730 上游 371 個鹼基的序列保留 200 個鹼基後約略分成 三個片段，進行Yeast filter β- galactosidase assay 觀察，發現在上游中段 257 到315 個鹼基的區域內可能有某種序列存在會抑制其 promoter 的表現。至 於侵犯力分析則未觀察到假菌絲的生成有明顯的影響。唯本實驗僅止於以 啤酒酵母菌為平台之觀察，至於 orf19.2730 在白色念珠菌的表現則尚需進 一步研究，例如可利用gene targeting 的方法（Nakayama et al. 2000；Wilson, Davis, and Mitchell 1999）進行單套基因破壞（gene disruption）來進行突變 研究；利用同源重組之方式將TR system 置換其 promoter 區域進行基因功 能之研究(陳杏芳，2004)等。而資料庫推定的 DNA 修補、Histone 去甲基 及RNA polymerase II promoter 轉錄的抑制者等功能，都是有待進一步研究 的方向。
六、參考文獻
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B (80%) A (92%) orf19.2730
圖 1. SB021 序列和 orf19.2730 對應之相關位置
A：在 orf19.2730 的第 99 至 503 個鹼基的範圍對應到的 415 個鹼 基，有92%的 identity，3%的 gaps。
B：在 orf19.2730 的第 1 至 167 個鹼基的範圍對應到的 148 個鹼基，
有80.8%的 identity，9.8%的 gaps。
比對結果另見附錄二。
1 99 167 503 1821
圖 2. orf19.2730 及其對偶基因 orf19.10244 在 Candida albicans 第四對染 色體上的相對位置
圖仿自 CGD 資料庫(http://www.candidagenome.org)。
圖 1.orf19.2730 及其上游序列之限制酶切割部位分析。
圖3. orf19.2730 及其上游序列之限制酶切割部位分析
-371~-353
+1821 ~ +1796 promoter
圖 2. PCR 切取 orf19.2730 及其上游序列，長度為 2192 個鹼基
圖 4. PCR 切取 orf19.2730 及其上游序列，長度為 2192 個鹼基 圖中所示 M 為 marker，
T 為經限制酶切取之片段 Ta1。
圖5. Ta2Y 質體的構築
Ta2Y 是以 YEP363 為基礎，經限制酶 BamHI 和 HindIII 切割後，接 上Ta1 改建而成，大小為 10764 bp。以限制酶 XhoI 進行切割，可得 大小為1096 bp 和 9668 bp 兩片段，且切位都在 Ta1 片段上。
2µ：yeast ARS
lacZ：lacZ reporter gene Leu2：LEU2 gene
Apr：ampicillin resistance
BamHI
HindIII
圖 4. Ta2R 質體
圖6. Ta2R 質體的構築
Ta2R 是以 pRS426 為基礎，經限制酶 BamHI 和 HindIII 切割後，
接上Ta1 改建而成，大小為 7892 bp。pRS426 上原有的 lacZ 則被 破壞。以限制酶XhoI 進行切割，可切出 281 bp、1097 bp 及 6514 bp 三個片段。其中pRS426 質體本身有一個切位，而 Ta1 片段上有 2 個切位。
圖 5. Ta2Y 及 Ta2R 以限制酶 XhoI 切割後膠體電泳分析
圖7. Ta2Y 及 Ta2R 以限制酶 XhoI 切割後膠體電泳分析 圖中所示M 為 marker。
Ta2Y 經限制酶切割後產生兩個片段，y1 片段介於 8000 到 10000 個鹼基之間偏向10000 鹼基，y2 片段介於 1000 到 1500 個鹼基 之間偏向1000 鹼基。
Ta2R 經限制酶切割後產生三個片段，r1 片段介於 6000 到 80000 個鹼基之間，r2 片段介於 1000 到 1500 個鹼基之間略偏向 1000 鹼基，r3 則介於 200 到 500 個鹼基之間。
圖 6. Ta2Y 質體轉型到啤酒酵母菌 10560-2B，建構 10560-2B-Ta2Y
圖8. Ta2Y 質體轉型到啤酒酵母菌 10560-2B，建構 10560-2B-Ta2Y 圖中 T 為未經切割的 Ta2Y 質體，
C 為 10560-2B。
B1、B2、B3、B4 為 10560-2B-Ta2Y 轉殖之後以 SD/Uridine/
Histidine 培養基篩選的質體抽出液。在箭頭所指之處明顯出現 和 Ta2Y 質體相當的 band。
T M C B 1 B 2 B 3 B 4
10k 8k 6k 5k 4k 3k
圖 7. Coomassie blue stain 比對試驗
圖9. Coomassie blue staining 比對試驗
orf19.2730 大小為 1821 bp，預期目標應出現在 55~72 kDa
區域內。箭頭所指之處隱約出現的 band，大小和預期相
近，但表現量低，需進一步佐證。
M 為 Marker，
SC 為啤酒酵母菌上清液，
SCT-1，SCT-2 為 10560-2B-Ta2Y 上清液。
圖 8. 以 PCR 方式自 Ta2Y 切取 orf19.2730∆stop
圖10. 以 PCR 方式自 Ta2Y 切取 orf19.2730∆stop 利用 RYH20 和FYH20 為引子，以 PCR 方式自 Ta2Y 切取大小為1818 個鹼基的 orf19.2730∆stop (A、B) M 為 marker；
y1、y2 為 2 個 PCR 反應之產物。
M y1 y2
30002500 2000 1500
1000 A B
圖 9. 以 BamHI 和 HindIII 切割 YEP363 質體及切取 orf19.2730∆stop
圖11. 以 BamHI 和 HindIII 切割 YEP363 質體及切取 orf19.2730∆stop Y1、Y2 為對 YEP363 質體切割，可得 8568 個鹼基（A、B）和 20 個鹼基的二個片段。
O3、O4 是對 orf19.2730∆stop 連結 T-Vector 增殖後再切割的結果，
可以得到1818 個鹼基（E、F）和 3000 個鹼基（C、D）的兩條片 段。
M Y1 Y2 O3 O4
1818
3000
BamHI
HindIII
A B
C D E F
圖 10. Ta2Y∆stop 質體
圖12.Ta2Y∆stop 質體
在 YEP363 質體的基礎上加入去除終止碼的 orf19.2730，建構 大小為10392 個鹼基的質體，保留原本 YEP363 質體所具有的 lacZ、LEU2、2µ 及 Apr基因，而且在第 480 個鹼基和第 1576 個鹼基的位置具有orf19.2730 上的兩個限制酶 XhoI 的切位。
圖 11. 以限制酶 XhoI 切割確認 Ta2Y∆stop 質體
圖 13. 以限制酶 XhoI 切割確認 Ta2Y∆stop 質體
Ye 為 YEP363 質體，Yx 為 YEP363 經限制酶 XhoI 處理後
的結果，兩者沒有顯著差異，確認限制酶 XhoI 不會對
YEP363 質體發生作用。
Xo1 和 Xo2 為限制酶 XhoI 對 Ta2Y∆stop 質體作用後的結 果，可看見都出現兩條band，其中一條約在 10000 個鹼基 附近（A、B），另外一條則在 1000 個鹼基附近（C、D），
兩條鹼基分佈的位置恰好和預期的1097 個鹼基和 9295 個 鹼基相當，符合預期的結果。
A B
C D
圖 12. 以 PCR 方式在 pET∆5T-D24B-HAHis 質體上擷取 HA3His6 及其下 游共圖996 個鹼基的 pHas 片段 14. 以 PCR 方式在 pET∆5T-D24B-HAHis 質體上擷取 HA3His6
及其下游共996 個鹼基的 pHas 片段
圖中 1、2、3、4 皆為 pHas 片段，箭頭所指處顯示大小在 1000 個鹼基附近，和預期相符。
M 1 2 3 4
1500 1000
750
圖 13. Ta2HAS 質體
圖 15. Ta2HAS 質體
對Ta2Y∆stop 以限制酶 HindIII 和 BssHII 處理，切除 HindIII 之後 lacZ 的部份片段。再以限制酶 HindIII 和 BssHII 處理 pHas。將兩 者進行接合，經過轉形選殖後，可得到帶有 HAHis 的 Ta2HAS 質體，大小為9880 bp。若以限制酶 XhoI 處理，應可切出大小為 551 bp、1097 bp 及 8232 bp 的三個片段。
圖 14. 經限制酶 XhoI 處理確認建構 Ta2HAS 質體
圖16. 經限制酶 XhoI 處理確認建構 Ta2HAS 質體 Ta2HAS 質體經限制酶 XhoI 處理，應可切出大小為
8232、1097 及 551 個鹼基的三個片段。
M 為 Marker；
TH 為未經切割的 Ta2HAS 圓形質體。
THX 則為經限制酶 XhoI 切割後的結果，可以看到在 8000~10000（A）、1000~1500（B）及 500~750（C）個 鹼基之間出現三條band，和預期相符。
A
B C
圖 15. Ta2HAS 質體轉型到酵母菌，建構 10560-2B-Ta2HAS
圖17. 檢驗 10560-2B-Ta2HAS 轉型株 圖中 M 為 Marker。
TH 為 Ta2HAS 質體。
#6、#7 為 10560-2B-Ta2HAS 抽出之真菌質體。
#6P、#7P 是以#6、#7 為板模經 PCR 增殖 HA3His6 及 其下游共 996 個鹼基的 pHas 片段後的產物（A、B）。
A B
圖 16. 啤酒酵母菌及 10560-2B-Ta2HAS 進行 Coomassie blue stain 及 Western blot
圖 18. 啤酒酵母菌及 10560-2B-Ta2HAS進行 Coomassie blue staining及 Western bloting
上左圖（18A）為以 anti His 抗體進行 Western bloting 的結果。
上右圖（18B）Coomassie blue staining 的結果。將兩個結果重疊如
上右圖（18B）Coomassie blue staining 的結果。將兩個結果重疊如