第二章 研究材料與方法
第二節 研究方法
八、 統計方法
數據結果以平均值(mean) ±標準誤(Standard error, SE)表示，各組 與對照組間的數據以單因子變異數分析(One-way analysis of
variance；One-way ANOVA)方法分析，並進行 Dunnett 測試，以 P 值 小於0.05 表示在統計學上具有顯著差異。
第三章 實驗結果 一、 對體重的影響
TAA 投予前各組間小鼠平均體重沒有差異，約為 23- 24 g。小
鼠一週三次給予TAA，為期八週，第五週小鼠體重有減輕的傾向，
第六週至第八週，小鼠體重明顯低於控制組。AFEF 0.2 g/kg 組小鼠 體重於第5 週至第 7 週高於 TAA 組。AFEF 1.0 g/kg 組小鼠體重於 第5 週至第 8 週高於 TAA 組(Table 2)。
二、 對肝臟重量及含水量影響
TAA 組小鼠最後的肝臟絕對重量明顯比控制組輕，AFEF 1.0 g/kg 組的小鼠，其肝臟重量明顯比 TAA 組重，而 AFEF 0.2 g/kg 組 的肝臟重量與控制組沒有顯著差異(Fig. 1)。TAA 組小鼠的肝臟相對
重量較控制組顯著增加，給予AFEF 的小鼠肝臟相對重量 TAA 組輕 (Fig. 2)。
小鼠犧牲時秤取肝臟 0.2 g，放入烘箱中，經 1000C、16 小時乾 燥後，測量肝臟含水量。TAA 組小鼠肝臟含水量比控制組顯著增 加，而投與AFEF 的組別，其肝臟含水量皆比 TAA 組顯著降低(Fig.
3)。
三、 對血清生化值影響
實 驗 第 八 週 後 犧 牲 採 血 ， 取 血 清 部 份 測 定 ALT 活 性 及 Cholesterol 濃度。如 Fig. 4、Fig. 5 所示，第八週的 ALT 值，TAA 組小鼠較控制組顯著增加，AFEF 1.0 g/kg 組的小鼠其 ALT 值較 TAA 組顯著降低，低劑量組則無明顯差異。第八週血清 Cholesterol 濃度，
TAA 組較控制組顯著降低，給予 AFEF 的組別，無論高劑量或低劑 量，其血清膽固醇皆顯著增加。
四、 Hydroxylpoline 含量
TAA 組肝臟 hydroxyproline 含量較控制組顯著增加，AFEF 1.0 g/kg 組的小鼠其肝臟 hydroxylpoline 含量較 TAA 組低，低劑量組 無明顯差異(Fig. 6)。
五、 病理檢驗
肝臟病理切片的觀察顯示，投與TAA 八週之小鼠，其組織細胞 有浸潤的現象，且細胞核有破裂的情形(Fig. 7B)，投予高劑量的 AFEF 則可減少細胞死亡發生(Fig. 7C)。以 Sirus red 染色發現，單獨 給予 TAA 八週之小鼠肝組織出現膠原蛋白纖維束(Fig. 8B)，而高劑 量 AFEF 組可減少纖維束的產生(Fig. 8C)。
六、 RT-PCR 結果
如 Fig. 9 所示，RT-PCR 的分析顯示，TAA 組肝臟 Tgfβ1、Collagen (α1)(I)的表現較控制組分別提高 33、44%。AFEF 1.o g/kg 組的肝臟 Collagen (α1)(I)的表現低於控制組，Tgfβ1 的表現與控制組比較沒有 差異。TAA 組肝臟 MMP13 的表現較控制組低約 46%。AFEF 1.o g/kg
組的肝臟MMP13 的表現高於控制組。
如Fig. 10 所示，TAA 組肝臟 LBP、CD 14、TLR-4 及 TNF-α Rcepter 的表現較控制組分別提高37.5、23、23 及 65﹪。AFEF 1.0 g/kg 組的 肝臟LBP、CD 14、TLR4 及 TNF-α Rcepter 的表現低於控制組。
如 Fig. 11 所示，TAA 組肝臟 IGF-I 的表現與控制組比較沒有顯著 差異，AFEF 組的肝臟 IGF-I 的表現與 TAA 組比較也沒有差異。TAA 組肝臟IGF-R及 IGFBP-1 的表現較控制組分別提高 44、77﹪。AFEF 1.0 g/kg 組的肝臟 IGF-R及 IGFBP-1 的表現低於控制組。TAA 組肝臟 IGFBP-3 的表現較控制組低約 43%。AFEF 1.0 g/kg 組的肝臟 IGFBP-3 的表現高於控制組。
如Fig. 12 所示，TAA 組肝臟 HGF及 c-Met 的表現較控制組分別 提高56、44﹪。AFEF 1.0 g/kg 組的肝臟 HGF 及c-Met 的表現低於控 制組。
七、 Real-time PCR 結果
IGFBP-1、LBP 的表現進一步利用 Real-Time PCR 來分析，將 cDNA 稀釋 100 倍後，以 Titanium TaqPCR kit 進行定量分析。TAA
組小鼠，IGFBP-1 及 LBP 的表現約為控制組的 58、54%。AFEF 1.0 g/kg 組的肝臟 IGFBP-1 及 LBP 表現較 TAA 組分別減少約 40、 65
%(Fig. 13)。
Table 1 Oligonuleotide sequences used in RT-PCR and Real-time PCR*
reactions
mRNA size Oligomers
GAPDH 76 bp Sense 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′
Antisense 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′
Collagen（αⅠ）（Ⅰ） 174 bp Sense 5′-GGTCCCAAAGGTGCTGATGG-3′
Antisense 5′-GACCAGCCTCACCACGGTCT-3′
MMP13 135 bp Sense 5′-GGTGGAGATATCAGGGGAGA-3′
Antisense 5′-TGGGGTTCTCAATTGCATTA-3′
Tgfβ1 176 bp Sense 5′-CAAGGGCTACCATGCCAACTTC-3′
Antisense 5′-TTGCGACCCACGTAGTAGACGA-3′
IGF-I 99 bp Sense 5′-GCTCTGCTTGCTCACCTTCAC-3′
Antisense 5′-CTCGGTCC ACACACGAACTG-3′
IGF recepter-1 90 bp Sense 5′-GCTGAGGGAGGAGGCGGC-3′
Antisense 5′-GGCGAGGGGCAGAAACGC-3′
IGFBP-1* 81 bp Sense 5′-ACTCGGAATTCCTCATCGTC-3′
Antisense 5′-GGTTACACAATCAGCATCGG-3′
IGFBP-3 139 bp Sense 5′-ATTTGCGACATCTCTGAACG-3′
Antisense 5′-GTTCTAGGGCACTCTGGGAG-3′
LBP* 127 bp Sense 5′-ACCCTTGACCTGGACTTGAC-3′
Antisense 5′-ACAGTGCCCGCTCTTAAAGT-3′
CD 14 375 bp Sense 5′-CCTAGTCGGATTCTATTCGGAGCC-3′
Antisense 5′-AACTTGGAGGGTCGGGAACTTG-3′
TLR4 85 bp Sense 5′-ATGGAACACATGGCTGCTAA-3′
Antisense 5′-TCATACCCCTGGAAAGGAAG-3′
TNF recepter 96 bp Sense 5′-GAGATGGTTGTTTCCGTGTG-3′
Antisense 5′-GCCACTCCCTGAGTTTTAGC-3′
HGF 146 bp Sense 5′-GGGCTGAAAAGATTGGATCA-3′
Antisense 5′-TCGAACAAAAATACCAGGACG-3′
c-Met 370 bp Sense 5′-GAATGTCGTCCTACACGGCC-3′
Antisense 5′-CACTACACAGTCAGGACACTGC-3′
Table 2. The changes of body weight of mice
Group Dose body weight（g）
g/kg Week0 Week1 Week2 Week3 Week4 Week5 Week6 Week7 Week8 Control 24.3±0.4 25.2±0.6 25.5±0.7 25.8±0.5 26.0±0.6 25.3±0.3 26.8±0.4 28.0±0.5 27.8±0.7
TAA + H2O 25.2±0.3 24.2±0.4 24.3±0.4 24.6±0.6 24.9±0.5 23.0±1.0 19.4±0.8### 16.9±0.2### 16.8±0.2###
+ AFEF 1.0 25.5±0.4 24.3±0.3 24.3±0.3 24.5±0.3 24.8±0.4 25.5±0.3* 26.1±0.3*** 24.4±0.7**** 22.9±0.9***
0.2 25.5±0.3 24.0±0.5 24.0±0.4 24.2±0.3 25.1±0.3 25.6±0.4* 23.8±0.8** 20.5±0.9** 17.7±0.7
Values are presented as mean ± S.E.(n=12). ###P<0.001 compared with the control group. **P<0.01 and ***P<0.001 compared with the TAA + H2O group.
Fig. 1 Effect of AFEF on the absolute weight of liver in TAA- treated mice. Values are presented as mean ± S.E. (n=12). ##P<0.01 compared with the control group. ***P<0.001 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2
0 1 2
AFEF
Absolute liver weight (g) # # * * *
TAA
(g/kg body weight)
H
2O
Fig. 2 Effect of AFEF on the relative weight of liver in TAA- treated mice. Values are presented as mean ± S.E. (n=12). ###P<0.001 compared with control group. **P<0.01 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2 0
2 4 6 8
AFEF
R el at ive l iver w ei gh t ( % ) # # # * * * *
TAA H
2O
(g/kg body weight)
Fig. 3 Effect of AFEF on the water content (﹪) in TAA-treated mice.
Values are presented as mean ± S.E. (n=12). ###P < 0.001 compared with the control group. *P<0.05, ***P<0.001 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2 0
20 40 60 80
w ate r c on te nt ( % )
AFEF
# # # * * * *
TAA
H
2O
(g/kg body weight)Fig. 4 Effect of AFEF on the serum activities of GPT in TAA- treated mice. Values are presented as mean ± S.E. (n=12). ###P < 0.001 compared with the control group. *P<0.05 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2
0 20 40 60 80 100
Se ru m A LT ( u/ l)
AFEF
# # #
*
TAA H
2O
(g/kg body weight)
Fig. 5 Effect of AFEF on the concentration of serum cholesterol in TAA-treated mice. Values are presented as mean ± S.E. (n=12).
###P<0.001 compared with the control group. *P<0.05, ***P<0.001 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2
0 20 40 60 80 100 120
Ser um C hol es te ro l ( m g/ dl )
AFEF
# # #
*
TAA H
2O
(g/kg body weight)
* * *
Fig. 6 Effect of AFEF on hepatic hydroxypoline contents in
TAA-treated mice. Values are presented as mean ± S.E. (n=12).
###P<0.001 compared with control the group. **P<0.01 compared with the TAA + H2O group.
Control ---- 1 0.2
0 200 400 600 800
H yd roxyp ol in e ( m g/ g w t t is su e)
AFEF
# # # * *
TAA H
2O
(g/kg body weight)
Fig. 7 The photomicrographs of liver section taken from mice and stained with hematoxylin-eosin. (A) Control group. (B) TAA+H2O, Note that tissue infiltration and necrosis was observed.
(C) TAA+AFEF 1.0 g/kg body weight (Original magnification : left ×40, right ×100)
(A)
(B)
(C)
Fig. 8 The photomicrographs of liver section taken from mice and stained with Sirus red. (A) Control group. (B) TAA+H2O, Note that displaying fibrin of collagen was observed. (C) TAA+AFEF 1.o g/kg body weight. (Original magnification ×40)
(A)
(B)
(C)
Fig. 9 (A) RT-PCR analysis of Collagen (α1)(I), Tgfβ1 and MMP13 expressions in control mice, in TAA-treated mice, and in mice treated with TAA + AFEF (1.0 or 0.2 g/kg body weihgt).
Expression of the amplified fragement corresponding to GAPDH is shown for comparison. (B) Densitometric analyses of Collagen (α1)(I), Tgfβ1 and MMP13 expressions after normalization against GAPDH. Values are presented as mean ratio ± S.E. (n=4).
##P<0.01, ###P<0.001 compared with the control group. *P<0.05 compared with the TAA + H2O group.
mRNA expression(ratio) # # *
# # # *
C o l l a g e n (α 1 ) (I ) T g fβ 1 M M P 1 3
Fig. 10 (A) RT-PCR analysis of LBP, CD14 ,TLR4 and TNF-R expressions in control mice, in TAA-treated mice, and in mice treated with TAA + AFEF (1.0 or 0.2 g/kg body weight).
Expression of the amplified fragement corresponding to GAPDH is shown for comparison. (B) Densitometric analyses of LBP, TLR4, CD14 and TNF-R expressions after normalization against GAPDH. Values are presented as mean ratio ± S.E. (n=4). #P<0.05,
##P<0.01 compared with the control group. **P<0.01 compared with the TAA + H O group.
mRNA expression(ratio) # * *
# * *
* * # #
#
*
L B P C D 1 4 T L R 4 T N F - R
0
mRNA expression(ratio) # # * *
# # # *
* * #
I G F - 1 I G F - R I G F B P - 1 I G F B P - 3
Fig. 11 (A) RT-PCR analysis of IGF-I, IGF-R, IGFBP-1 and IGFBP-3 expressions in control mice, in TAA-treated mice, and in mice treated with TAA + AFEF (1.0 or 0.2 g/kg body weight).
Expression of the amplified fragement corresponding to GAPDH is shown for comparison. (B) Densitometric analyses of IGF-R, IGFBP-1 and IGFBP-3 expressions after normalization against GAPDH. Values are presented as mean ratio ± S.E. (n=4). #P<0.05, #P<0.05, ##P<0.01 compared with the control group. *P<0.05, **P<0.01 compared with the TAA + H2O group.
Fig. 12 (A) RT-PCR analysis of HGF and c-Met expressions in control mice, in TAA-treated mice, and in mice treated with TAA + AFEF (1.0 or 0.2 g/kg body weight). Expression of the amplified fragement corresponding to GAPDH is shown for comparison. (B) Densitometric analyses of HGF and c-Met expressions after normalization against GAPDH. Values are presented as mean ratio ± S.E. (n=4). #P<0.05, #P<0.05 compared with the control group. **P<0.01 compared with the TAA + H O group.
Fig. 13 Real Time PCR analysis of IGFBP-1 and LBP levels in TAA-treated mouse liver tissue. Results are expressed in arbitrary units, and Data are mean mean ± S.E. (n=3). #P<0.05 compared with the control group.*P<0.05 compared with the TAA + H2O group.
IGFBP-1 LBP
0 1 2 3 4
Control TAA+H2O
TAA+AFEF 1g/kg TAA+AFEF 0.2g/kg
mRN A f ol d i nc re as e # *
第四章 討論與結論
本研究以小鼠同時投與AFEF及TAA，探討AFEF對TAA誘發小鼠 肝纖維化是否有減輕的作用，結果發現AFEF可以減輕TAA誘發的小 鼠肝臟纖維化，此減輕作用可能經由抑制發炎相關的LBP及IGFBP-1 的表現。
文獻指出TAA會使小鼠體重減輕(Laleman, 2006)，在本研究也發 現TAA 使小鼠體重明顯減輕，AFEF的處理能明顯提升小鼠的體重。
TAA的體重下降作用與血中的leptin 及IGF-I經由中樞神經系統的作 用有密切關係(LaPaglia, 1998)。本實驗重點在抗纖維化的研究，僅分 析肝臟 IGF-1基因的表現，沒有測定血中的leptin 及IGF-1的含量，
無法說明AFEF的減輕體重下降作用是否與leptin 及IGF-1有關。
肝臟受到損傷時，肝會腫大，當損傷嚴重時，肝臟會萎縮(Bissell, 1990)。TAA雖使肝臟絕對重量減輕，但肝臟相對重量卻增加，顯示 在本試驗條件下，TAA對肝臟的損傷還不是很嚴重。AFEF對TAA肝 臟重量的影響有反轉的效果。肝臟生長因子HGF具有促進肝臟再生的 作用(Skrtic et al, 1999)，在肝臟受到傷害時，由於修複的作用，會使 肝臟HGF的表現增加 (Sanz et al., 2005)。TAA誘使肝臟的HGF及其作 用的接受體 c-Met mRNA的表現增強，此應與肝臟的相對重量增加有 AFEF可以減弱TAA所提升的HGF及c- Met mRNA的表現。這些結
果顯示AFEF有減輕TAA肝損傷的效果。
當肝細胞受到損傷時，細胞內的GPT會釋放至血液中，所以GPT 最常被用來當作肝臟損傷時初期的生化指標(Sturgill and Lambert, 1997)，而血清GPT在肝臟中比GOT更具專一性(Bissell, 1990)。投與 TAA八週後發現，高劑量AFEF明顯降低血清GPT值，顯示高劑量 AFEF對於TAA肝臟損傷具有減輕效果。病理切片檢查的結果也顯 示，AFEF可以減輕TAA引起的肝組織發炎及壞死的情形。
膽固醇主要在肝臟合成(Bissell, 1990)，合成完成的膽固醇會釋放
至血液中，因此血中膽固醇的濃度可以顯示肝藏的合成功能。TAA使
血中膽固醇濃度下降，顯示TAA的肝損傷影響到肝臟的合成功能。
AFEF對此有改善的效果，支持了AFEF可以減輕TAA的肝毒性。
所有慢性肝炎皆會引起肝纖維化的產生(Poynard, 1997、2000；
Brunt, 2004)，小鼠經 TAA 八週的投予，在組織病理的檢查可見現纖 維狀組織出現(Ramaiah et al., 2001；Mangipudy et al., 1995)，即結締 組織增生。結締組織主要由膠原蛋白構成，hydroxypoline 是膠原蛋白 特有的成分，測定 hydroxypoline 可以反應膠原蛋白的量，可用來表 示肝纖維化的程度(Hanauske-Abel, 1996)。在本實驗 TAA 誘發肝臟纖 維化，其肝臟 hydroxypoline 含量明顯增加，而高劑量 AFEF 可使 hydroxypoline 含量減少，此情形在組織病理檢驗也得到證實。膠原蛋
白種類很多，已知在肝臟纖維化時以膠原蛋白型 I 的增加最主要 (Iredale, 1996) ， 因 此 在 本 實 驗 也 利 用 RT-PCR 的 技 術 分 析 肝 臟 Collagen (α1)(I)的表現，TAA 明顯增加肝臟 Collagen (α1)(I)的表現，
此作用可被 AFEF 減弱。顯示 AFEF 可以減輕 TAA 誘發肝纖維化的 作用。
肝臟纖維化是因為細胞外間質(extracellular matrix；ECM)過度 沉積(Friedman, 2003)。Matrix metalloproteinases (MMPs)是一種蛋白分 解酵素，可以降解細胞外間質。MMPs有多種，與肝纖維化有關的以 MMP13較主要，可降解膠原蛋白型I (Yoshiji, 2002)。肝臟MMP13的 表現曾強，可以降解肝纖維化，反之則肝纖維化較重。TAA可使肝臟 的MMP13表現減弱，AFEF的處理可以增強MMP13的表現，此更支持 了AFEF可以減輕TAA誘發肝纖維化的作用。
Lipopolysaccharide (LPS) 是 一 眾 所 皆 知 的 發 炎 因 子 ， 其 會 與 Kupffer 細胞作用引起發炎反應，造成肝損傷。已有文獻指出，TAA
的肝損傷會使肝臟的LPS 增加(Chen, 2005)。LPS 會刺激肝臟合成 LPS 結合蛋白金(LPS-binding protein；LBP)，血中的 LBP 與 LPS 結合，
可將LPS 運送至 kupffer 細胞與 Toll 接受體及 CD14 結合，進而活化 kupffer 細胞釋放出 TNF-α 等發炎因子造成發炎反應(Su, 2002)。在本 實驗，TAA 造成的肝臟發炎反應，其 LBP、TL-4 接受體及 CD-14 的
mRNA 的表現顯著提高，投與 AFEF 則有效降低這些 mRNA 的表現。
高劑量的AFEF 也可以減少 TNF-α Rcepter 的表現，此結果表示 AFEF 可以有效抑制LPS 所引起的發炎反應。
胰島素成長因子-I (insulin growth factor 1；IGF-I) 在肝硬化的病
理角色還有很多爭議，肝硬化的病人血中IGF-1 濃度下降，此與肝硬 的併發症營養不良有關(Mendenhall et al., 1989; Inaba et al., 1999)。因 此 有 研 究 指 出 ， 外 給 IGF-I 對 實 驗 肝 硬 化 有 改 善 的 效 果 (Castilla-Cortazar et al., 1997; Mirpuri et al., 2002; Canturk et al., 2003)。雖然如此，局部作用的 IGF-1 具促細胞分裂增生的作用，能 活化星狀細胞產生膠原蛋白會促進肝臟纖維化(Scharf et al., 1998)。
在血液中，IGF-I是與其結合蛋白結合的，結合蛋白有6種之多，
在血液中，IGF-I是與其結合蛋白結合的，結合蛋白有6種之多，