親核性加成反應 (Nucleophilic addition)

有很多例子，都說明了明顯過量的毒性是由於包含鹵素或其他適合的 離基 (leaving group) 發生親核性反應 (S_N reaction) 所造成^{[42, 43]} 。藉由此 機制作用的化合物被認為在生物高分子內之化合物共價鍵與其硫氫基、氨

CH

₃

O O

CH

3

CH

3

O H H

2

SO

4

異丁烯基甲基酮 Mesityl Oxide

4-甲氧-4-甲-2-戊酮

4-Methoxy-4-methyl-2-pentanone

19

基及其他親核基鍵結。明顯過量的毒性在這些親電性物質其離基在-位置 為雙鍵 (allylic activation) 或參鍵 (propargylic activation) 亦或芳香環 (benzylic activation) 上被展現出來^[42] (圖2.4.3)。然而，和鹵碳化物

(halo-carbon) 類似的官能基，例如苯甲醯甲基 (phenacyl)、羧基 (carboxyl) 及氨基化物 (amide) 也會同時產生活化 (-activation) 作用^{[42, 43]}。

Fig 2.4.3 The chart of nucleophilic addition (1)

^[42]

由於S_N活化的部份 (activating moieties) ，基本結構 (substructural screen) 是以sp³碳位與一個鹵素及碳氫原子共價鍵結結合，用X－CY₃表示，

其中X = I, Br, Cl ，Y = C, H，只有I, Br, Cl 作為離基，而先前的研究指出 F, C≡N 不適合在親核性取代 (S_N displacement) 當做離基。

2.4.5 親核性及親電子性加成反應的比較 (Comparsion of nucleophilic

and electrophilic addition)

親核性及親電子性加成反應間的差異當然在其所生成中間體離子具有 相反電荷：在親核性加成反應中成負性，在親電性加成反應成正性。結果 取代基的效應完全相反。拉電子基去活化 C＝C 雙鍵的親電性加成反應，

活化親核性加成反應。拉電子基在親核性加成反應中因幫助分散生長中的 負電荷以穩定化導致生成中間體陰離子的過渡狀態(圖 2.4.4) ^[41]：

Fig 2.4.4 The chart of nucleophilic addition (2)

^[41]

-不飽和羰基化合物的加成反應以對整個全共軛系的攻擊論之最易

瞭解。欲得最穩定的中間體離子，此攻擊必頇發生在該共軛系的一端。親 核性詴劑攻擊-C 生成負電荷部份被電負性原子氧所容納的陰離子；親電 子性詴劑攻擊氧生成正電荷被碳所容納的 離子 (圖 2.4.5)^[41]。

Fig 2.4.5 The difference between nucleophilic and electrophilic

^[41]

2.4.6 Michael 加成反應 (The Michael addition)

含極性官能基之-不飽和羰基化合物具明顯的毒性由於 Michael 加 成 (Michael-type addition) 至親核性高分子位置作用所致^[42]。 圖 2.4.6 為 Michael 加成反應之示意圖^[42]，Enz 為強鹼性陰離子，SH 為硫氫基。

Fig 2.4.6 The chart of Michael addition

^[42]

Michael 加成 (Michael-type addition) 主要由兩個步驟形成^[44]： (1) 藉由所形成之共價鍵向內轉至親電性中心

(2) 最後在分子上不留下離基 (leaving group)

此分子機制常常發生在 C＝C 雙鍵之外層碳原子上，藉由硫醇基在外層碳 原子上之親核性加成反應^[44]。

2.4.7 -不飽和羰化物之毒性機制

Papirmeister et al. ^[45]重新探討 Michael 加成親電性物質的毒性，簡單來 說，毒性是由於一開始的 GSH 烷基化而之後依序遞減，使得其他含硫氫 基物質尤其是鈣離子轉運酶 (Ca²⁺ translocases) 較容易受到攻擊，干擾鈣

21

離子體內帄衡與細胞骨架，破壞並使細胞質膜喪失完整性。GSH 是一種由 L--glutamyl-L-cystemylglycine 所構成之三肽類，它的半胱氨酸 (cystemyl ) 提供了關鍵的硫氫基部分 (SH moiety) ，它亦是便利性傳輸之重要的功用 物質，會經由接合作用 (conjugation) 消除許多反應性化合物質。自發性接 合作用 (Spontaneous conjugation) 會將所選之軟親電性物質與 GSH 內之 硫醇基交互作用以保護含硫醇基的酵素與結構蛋白^[45]。

2.4.8 毒化物與榖胱甘肽(glutathione)之反應性

Michael 加成親電性物質的毒性易受到 GSH 烷基化所影響，隨著 GSH 水準來決定變數去留，自變數partial R squared 值則為對模式之影響效果，

其亦作為模式選入之參考標準。^[46]

小者，並對留在迴歸模式中的變數作F 檢定（Minitab 內定p<0.1），最不 顯著之變數則刪除，直到沒有變數可消去。逐步選擇法為向前選擇法和後 退消去法之結合，剛開始時模式中並無變數存在，先採用向前選擇法選取 對模式貢獻最大者之變數進入迴歸模式中，下一步驟使用向後選擇法考驗 此變數是否留下或去除，一步步考慮選取進入模式之變數，反覆選取刪除 後，直到當模式中所有變數之水準被測定為可進入且無任何變數可再進入 時，逐步選擇停止。逐步迴歸的F 統計檢定Minitab 內定標準為p<0.15，

為選取進入與消去之基礎，檢驗已在模式中之變數，刪除具有較少區別力 之變數，反之則加入，當沒有適合的變數落在模式外則結束逐步程序，可 設定較小的顯著水準提高選取變數數目，但可能所選取的變數並無法顯著 影響模式。不論是使用顯著水準還是partial R squared 之值為標準，變數的 選取個數也許不同，但選取順序依然相同。^[46]

23

則

  

以毒理學的角度而言，劑量與反應關係(dose-rseponse relationship) 是 探討化學物質對生物體所造成影響之基礎。美國國家科學院將劑量—反應 Concentration 50%) 或 LC₅₀ ( Lethal Concentration 50%)；而由受影響或死 亡的百分率所迴歸出的S 曲線關係，稱為劑量-反應曲線圖（Dose-response curve）；這些在於毒性評估方面皆為相當重要。生物體受毒性物質影響的

25

Fig 3.2.1 Dose-response relationships of common toxicity tests

欲從 S 型曲線求得EC₅₀或EC₁₀並不容易，因此必頇藉由數學關係式將 S 型轉為直線型以便求取，此種數學轉換模式便稱為劑量反應關係模式，

不同的模式根據的理論基礎互有出入，因此同一組數據，經由各種不同模 式的分析，其結果可能有所差異；以生物詴驗來講，不同生物甚至不同觀 測參數 ( Endpoint ) 對毒性物質容忍度不盡相同，若以不適當之反應模式 計算，實驗點與理論點間變異過大，則所得結果則相當可議，尤其在所求 為外插情況下，變異波動更加明顯，因此數據處理程序中往往需要作適合 度分析，以判斷最適合之使用模式。

一般常見的毒性物質劑量-反應模式為有三種，包括了：Probit、Weibull 及Logit 模式，皆是依據不同的假設發展而成；Probit 模式為假設毒性物 質對於受體生物的容忍度為一常態分布，因此以常態分佈函數來表示毒物 對生物抑制率 P 對毒物濃度（劑量）Z 的濃度（劑量）反應曲線。Weibull 模式則是符合毒性物質與受體生物間產生化學鍵結的假設，為機率-反應機 制基礎（Mechanistic-Probability basis）模式，發展根據毒性物質分子與受 測詴生物之受體分子間化學鍵關係所推演而來。至於Logit模式則與Monod Equation 相似，由人口成長研究所發展而出的另一種模式，描述毒性反應 中的某種酵素反應( Enzyme Reaction），適用於自催化( autocatalysis ) 之 化學反應。表 3.2.1 為三種劑量反應曲線之數學轉換關係式。

其中，Probit模式，為毒性詴驗報告中最常見的劑量-反應模式，主要 是由實驗經驗，再加上理論基礎所得的一個模式，其係假設生物對毒性物 質的容忍度分布為常態分布（Log-normal distribution），其主要以毒性物 質濃度之log值與反應率之 NED（Normal equivalent deviation）具有線性關 係為基礎，其中反應率即測詴生物對毒性物質之反應比率（如死亡率等）。

此模式將劑量-反應模式之S型曲線，轉換成 NED 尺度上的一直線，原來

劑量-反應曲線在抑制率於 50％ 之處對應到 NED scale 上為0，84.1％反 應率之處對應為1，而 NED scale 之座標值加5 即為 Probit 的座標，Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下：

Y  A  B log Z

 

 

 



 



 



  



2 1 5

5 .

0 Y

erf P

其中 Y 為 Probit 單位，A

、 B為劑量-反應曲線之截距與斜率， Z 為毒性

物質劑量濃度（單位：mg/L）； P 為測詴物種對毒性物質之反應率（如 死亡率等，單位：%），erf 為error fuction。

27

Table 3.2.1 The types of Weibull、Probit and Logit models

Type Transformation Probability density Probiblity of response P Weibull ^{u  ln( k )   ln( z )} exp( t  e

^t

) 1  exp(  kz

^

)  1  exp(  e

^u

)

Type Probility of no-response Q Transform vs P Transform vs Q

Weibull exp(  kz

^

)  exp(  e

^u

) u  ln(  ln( 1  P )) u  ln(  ln Q )

第四章、實驗設備與方法

4.1 實驗設備及材料

密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗之設備材料：

1. 恆溫無塵室

恆溫無塵室大小約為五坪，其溫度控制在24±1℃，

保持恆溫，藻類培養、詴驗皆在此溫控室內進行。

2. 水質

實驗中清洗容器、器具之二次清洗水及藥品配製用水皆為自 來水依次經過四道濾心過濾、離子交換、蒸餾然後再經超過濾 （Milli-Q plus）處理之去離子水。使用時需確定水質之電阻值 ≧18.2 Mega-ohm（M Ω-cm）才可開始使用。

3. 培養裝置與迴轉式振盪儀

培養裝置為自行裝配之培養箱，台面可依所需而更改、拆換，以 角鋼為架構主體，長×寬×高為 135 ×110 ×135cm，頂面履以 120cm 長之白色螢光燈管 8 支。並設有迴轉式振盪儀

(EIRSTEK公司，型號S103)，搖動速度可大於 100 rpm，其台面 共有 66 個位置。培養設備置於恆溫室內，控制溫度在 24 ±l ℃。

作為藻類批次式培養與毒性詴驗之用。

4. 批次式培養器皿

以批次方式培養液態藻類時所使用之容器為 125ml，Erlnmeyer之 三角錐瓶。每次使用前皆經過滅菌斧殺菌。

5. 紗布

藻類於批次培養時，使用消毒紗布覆蓋至三角錐瓶瓶口，除了可 防止異物進入，且可利於空氣中之 CO₂流通來提供藻類生長所需 之碳源。

6. 連續式培養母槽

連續式培養之母槽使用體積 5 公升，直徑為 18cm 之玻璃容器。於體 積 4 公升處開口做為溢流口，並且於體積 2 公升處開一口

做為取樣之用。母槽上方亦有兩開口，一作為營養基質流入口、

29

幫浦管使用Materflex公司，型號 H-96400-14。輸送管為矽膠材 質，不具毒性，可避免影響母槽之培養及毒性詴驗之結果。

Coulter Counter，型號為 MULTISIZER II，並以 5.06μm 標準顆 粒乳液來校正。配有 50 及 100μm 孔徑之玻璃管。本實驗使用

± 0.01%。

31

量測藥品用，產牌 Precisa 205A，精確度至0.01mg。

26. 定量吸管

量，再依濃度比例將名義濃度(nominal concentration) 換算為實際濃度進行 實驗;實驗結果也分別以溶氧變化量 (ΔDO) 、最終生物數量 (Final Yield)

32

Table 4.1.1 Physical and chemical characteristic of -unsaturated ketones

Chemical CAS No. Formula M.W. Structure Log P

Solubility (mg/L)

3-butyn-2-one 1423-60-5 C

4

H

4

O 68.08 -0.52 178550

3-buten-2-one 78-94-4 C

4

H

6

O 70.09 0.41 10977

3-chloro-2-butanone ﹡ 4091-39-8 C

4

H

7

ClO 106.55 0.44 75022

Methyl ethyl ketone ﹡ 78-93-3 C

4

H

8

O 72.11 0.26 96451

CH3

O C CH

CH₃ O H₂C

CH3

O H3C

Cl

CH3 O H3C

33

Chemical CAS No. Formula M.W. Structure Log P

Solubility (mg/L)

2-cyclopenten-1-one 930-30-3 C

5

H

6

O 82.10 0.71 7639.2

3-pentene-2-one 625-33-2 C

₅

H

₈

O 84.12 0.52 8179.2

2-methyl-2-cyclopenten-1-one 1120-73-6 C

6

H

8

O 96.13

1.26 4268.5

3-hexyn-2-one

1679-36-3 C

6

H

8

O 96.13 0.17 ND

O

CH₃ O CH₃

O

CH₃

CH₃ O C C CH₃

34

Chemical CAS No. Formula M.W. Structure Log P

Solubility (mg/L)

3-methyl-2-cyclopenten-1-one 2758-18-1 C

6

H

8

O 96.13 1.26 4268.5

5-hexen-2-one 109-49-9 C

6

H

10

O 98.14 1.10 11454

3-methyl-3-penten-2-one 565-62-8 C

6

H

10

O 98.14 1.37 4554.3

4-hexene-3-one 2497-21-4 C

₆

H

₁₀

O 98.14 1.31 2771.2

O H₃C

CH3

O H₂C

CH₃ O

H₃C CH₃

O

CH3

H3C

35

36

Chemical CAS No. Formula M.W. Structure Log P

Solubility (mg/L)

6-methyl-5-hepten-2-one 110-93-0 C

₈

H

₁₄

O 126.20 2.06 4364.1

3-nonene-2-one 14309-57-0 C

9

H

16

O 140.23 2.79 96.955

ND：No Data

Log P data from EPIWEB version 4.0 software

﹡： saturated ketone

CH3

CH3

CH3

O

CH3

O CH3

37

Table 4.1.2 Reference toxicity data and descriptors of -unsaturated ketones

Chemical CAS No. Formula IGC

50

(mM) RC

50

(mM) Q

3

+Q

4

(au)

3-butyn-2-one 1423-60-5 C

4

H

4

O 0.011

^a

0.057

^c

-0.3560

^b

3-buten-2-one 78-94-4 C

4

H

6

O 0.032

^a

0.090

^c

-0.3775

^b

3-chloro-2-butanone ﹡ 4091-39-8 C

₄

H

₇

ClO ND ND ND

Methyl ethyl ketone ﹡ 78-93-3 C

4

H

8

O 0.012

^a

ND ND

2-cyclopenten-1-one 930-30-3 C

₅

H

₆

O 0.230

^b

ND -0.3454

^b

3-pentene-2-one 625-33-2 C

5

H

8

O 0.290

^a

0.11

^c

-0.3321

^b

3-hexyn-2-one 1679-36-3 C

6

H

8

O 0.055

^a

0.12

^c

-0.3083

^b

2-cyclopenten-1-one, 2-methyl- 1120-73-6 C

₆

H

₈

O 6.699

^b

ND -0.2949

^b

2-cyclopenten-1-one, 3-methyl- 2758-18-1 C

₆

H

₈

O 21.038

^b

ND -0.2927

^b

4-hexene-3-one 2497-21-4 C

6

H

10

O 0.118

^a

0.34

^c

-0.3333

^b

5-hexen-2-one 109-49-9 C

6

H

10

O 13.821

^a

ND ND

3-penten-2-one, 3-methyl- 565-62-8 C

₆

H

₁₀

O 2.213

^b

10

^c

-0.2794

^b

4-methyl-3-pentene-2-one 141-79-7 C

6

H

10

O 4.403

^a

28

^c

-0.2771

^b

5-methyl-5-hexen-2-one 3240-09-3 C

7

H

12

O 8.669

^a

ND ND

3-heptene-2-one 1119-44-4 C

₇

H

₁₂

O 0.201

^a

ND -0.3301

^b

3-octene-2-one 1669-44-9 C

8

H

14

O 0.182

^a

0.46

^c

-0.3298

^b

6-methyl-5-hepten-2-one 110-93-0 C

8

H

14

O 2.833

^a

ND ND

3-nonene-2-one 14309-57-0 C

₉

H

₁₆

O 0.104

^a

ND -0.3302

^b

a

：data from Reference by T. W. Schultz et al. 1995.

^{[47] b}

：data from Reference by T. W. Schultz et al. 2005.

^[3]

c

：data from Reference by T. W. Schultz et al. 2007.

^[45]

IGC

50

：50% Inhibit Growth Concentrations with Tetrahymena pyriformirs RC

₅₀

：50% Reactive Concentrations with GSH Q

₃

+Q

₄

：sum of the partial charges of C

₄

and C

₃

ND：No Data ﹡：saturated ketone

4.2 毒性詴驗藻種

本研究中，採用植物性浮游生物，在分類上屬於綠藻綱 (Chlorophceae）

的月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata) ，Strains UTEX 1648，其特徵 為單細胞、成群體但不糾結、不能移動，一般細胞體積為 40-60 μm³，體

39

時則使用不含EDTA之貯備液。最後配成的營養鹽其巨量及微量營養素濃 度列於表4.3.1及表4.3.2。營養基質的滅菌是以 0.45μm 的濾膜過濾，過濾 滅菌後的營養基質頇保存在 4 ℃ 且置 於陰暗無光線照射處，以免產生光 化學反應。

Table 4.3.1 The consist of micro-algae medium

Chemical concentration (mg/L) element Final conc. (mg/L)

NaNO

₃

25.5 N 4.20

MgCl

2

〃6H

₂

O 5.7 Mg 2.90

CaCl

₂

〃2H

₂

O 4.41 Ca 1.20

MgSO

₄

〃7H

₂

O 14.7 S 1.91

K

2

HPO

4

1.04 P

K

0.186 0.649

NaHCO

₃

15.0 C

Na

2.14 11.0

Table 4.3.2 The consist of micro-algae medium (EDTA component)

Chemical concentration (g/L) element Final conc. (g/L)

H

3

BO

3

186 B 32.5

MnCl

2

〃4 H

2

O 264 Mn 115

ZnC1

₂

3.27 Zn 1.57

FeC1

3

〃6H

2

O 96.0 Fe 30.0

CoC1

2

〃6H

2

O 0.78 Co 0.354

Na

2

MoO

4

〃2 H

2

O 7.26 Mo 2.88

CuCl

₂

〃2H

₂

O 0.00900 Cu 0.0400

Na

₂

EDTA〃2H

₂

O 300

4.3.2 玻璃器皿清洗與滅菌

實驗物種 Pseudokirchneriella subcapitata 在進行實驗前必頇經過 2-7 天預培養 (pre-culture) 使之帄均細胞體積 (mean cell volume) 達到

39-46μm³ ，而藻類細胞數量達到 1.9~2.0×10⁶ cells/mL，在此條件下才取 藻類進行實驗。在培養藻類最需注意的步驟為微營養鹽貯備液的加入方法，

一開始活化藻類加的是stock1 (100％ EDTA)，而在連續式母槽中培養藻類 時使用的是stock2 (10％ EDTA)。此外液態營養基質中之藻類可在 4℃下

41 (約為1.9~2.0x10⁶ cells/mL) 始

以幫浦輸入基質。由於母槽

Fig 4.3.1 The culture steps of algae

恆溫室內進行

恆溫室外進行

4.3.5 ISOTON II 之配製

ISOTON II 之作用主要是作為電子顆粒計數器之導電溶液，使用電子 顆粒計數器量測藻類細胞數時，所使用之溶液皆為 ISOTON II。ISOTON II 的配製是於 20 公升的超純水中加入 200g 氯化鈉（NaCl），攪拌使其混 合均勻，然後以電導計測量其導電度，所需要之導電度為 17mmho。若是 導電度低於 17mmho，則再慢慢加入氯化鈉，攪拌均勻，直到導電度為 17mmho；相反的，如果導電度超過了17mmho，則慢慢加入超純水，攪拌 均勻，直到導電度降至 17mmho。待導電度達 17mmho 後再以 0.2μm 之 濾膜過濾此溶液，其濾液即是進行計數時所需之 ISOTON II 溶液。

4.3.6 電子顆粒計數器操作方式與原理

在電子顆粒計數器中有一根玻璃管及一攪拌器，將待測之顆粒樣品先 與 ISOTON II 稀釋樣品（氯化鈉溶液）混合製成稀釋懸浮液。此懸浮液 自玻璃管近底端的側面的一口徑已定之小孔抽引入測詴管 (Aperture) 內，

在電子顆粒計數器中有一根玻璃管及一攪拌器，將待測之顆粒樣品先 與 ISOTON II 稀釋樣品（氯化鈉溶液）混合製成稀釋懸浮液。此懸浮液 自玻璃管近底端的側面的一口徑已定之小孔抽引入測詴管 (Aperture) 內，

在文檔中 以月芽藻類毒性試驗方法評估α,β-不飽和酮類之毒性與結構-活性關係之研究 (頁 28-0)