以月芽藻類毒性試驗方法評估α,β-不飽和酮類之毒性與結構-活性關係之研究

國 立 交 通 大 學

環 境 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

以月芽藻類毒性詴驗方法評估α,β-不飽和酮類之毒性

與結構-活性關係之研究

Toxicity Assessment and The Quantitative Structure -Acitivity

Relationships of α,β-unsaturated Ketones based on the

Effects on Pseudokirchneriella subcapitata

研究生：黃聖然

指導教授：陳重元 教授

以月芽藻類毒性詴驗方法評估α,β-不飽和酮類之毒性

與結構-活性關係之研究

Toxicity Assessment and The Quantitative Structure -Acitivity

Relationships of α,β-unsaturated Ketones based on the

Effects on Pseudokirchneriella subcapitata

研 究 生：黃聖然 Student：Sheng-Ran Huang

指導教授：陳重元 Advisor：Dr. Chung-Yuan Chen

國 立 交 通 大 學

環境工程研究所

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering College of Engineering

National Chiao Tung University In partial Fulfillment of the Requirements

For the Degree of Master Science In

Environmental Engineering November 2010

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

I

以月芽藻類毒性詴驗方法評估α,β-不飽和酮類之毒性

與結構-活性關係之研究

中文摘要

學生：黃聖然 指導教授：陳重元

國立交通大學環境工程研究所碩士班

摘 要

本篇研究以月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata)針對 18 種酮類， 其中 16 種為-不飽和酮，2 種為飽和酮，所進行之 48 小時密閉式毒性

詴驗。實驗所得到之結果，將利用Do、Final yield 及 Growth rate 做為觀 測終點，藉由 Probit 模式求出半致死濃度 (50% Effect concentration，EC50)，

將其毒性詴驗後所得到的 log(1/ EC50)，與其物化參數(Log P)、電性參數

(Delta E、Q3、Q4、Elumo、Ehomo)及反應性參數(log(1/ RC50))進行迴歸分析，

找出定量-結構活性關係模式。 毒性由強至弱依序為不飽和酮＞鹵素取代酮＞飽和酮，炔酮類＞烯酮 類，無取代基不飽和酮＞甲基取代酮，造成此趨勢之主因為酮類含 C＝O， 屬於拉電子基，造成本身電子雲密度不均，使得酮類本體不穩定；不飽和 酮含鍵，使酮類結構活躍，導致電子易發生轉移，與生物體內所含之硫 氫基(－SH)產生交互作用，進而影響毒性；而甲基取代造成立體障蔽(steric hindrance)效應，使酮類不易與電子反應，毒性減弱。另外，由反應性詴驗 數據呈現亦與上述結果相同。 敏感度分析方面，藻類毒性詴驗反應終點以最終細胞變化量最為敏感； 與其他物種進行比較，藻類敏感性比纖毛蟲高。 QSAR 分析發現，本詴驗毒物屬親電性物質，與麻醉性作用機制常選 用之參數－辛醇-水係數迴歸結果不佳，故其不為反應性毒性作用機制；而 利用反應性參數迴歸效果佳，毒性與反應性呈現正相關；由逐步迴歸分析 法，挑選出與詴驗毒物相關性佳之電性參數，也找到一些相關性高之方程 式(R2_{=0.821~0.907)，未來可藉此預測迴歸式預測具相關結構、相同毒性作} 用機制之毒化物，以減少在生物毒性詴驗上人力、時間、設備上之成本。

Toxicity Assessment and The Quantitative Structure -Acitivity

Relationships of α,β-unsaturated Ketones based on the

Effects on Pseudokirchneriella subcapitata

英文摘要

Student：Sheng-Ran Huang Advisor：Dr.Chung-Yuan Chen

Institute of Environmental Engineering

National Chiao Tung University

Abstract

The objective of this study is to understand the toxic effect of ketones (that contains sixteen α,β-unsaturated ketones and two saturated ketones ) on

Pseudokirchneriella subcapitata using a closed system test. The effects of

ketones are evaluated by three kinds of response endpoints, i.e., final yield, growth rate, and the dissolved oxygen production. Median effective concentrations (EC50) are estimated using the Probit model with a test duration

of 48hrs. Then, log (1/EC50) is utilized to make a regression with physical

chemistry descriptors, electronic descriptors and reactive descriptors. Finally, we establish the QSAR models.

The results show that unsaturated ketones are the toxicest of these ketones. Alkynones are more toxic than alkenones, and no substitution ketones are more toxic than Methyl substitution ketones. Ketones become unstable owing to electron-withdrawing effect caused by the existence of carboxyl of ketones. In addition, unsaturated ketones contain -bond that make electron easily transfer and interact with sulfhydryl group which is in organisms. Methyl group substitution cause steric hindrance, hense toxicity decrease a lot. The same results of toxicity are also discovered in Reactivity.

The order of the relative sensitivity is as follows：algae(Final yield)＞ algae(Do production) ＞algae(Growth rate)＞Tetrahymena pyriformis.

The toxicant of this study is electrophile which results in poor relationship with 1-octanol/water partition coefficient. Toxicity is positive correlation with reactivity. The QSAR models are established well (R2=0.821~0.907) that based on electronic descriptors by stepwise analysis. The results of this study can help us to decrease the cost of toxicity test.

III

誌謝

首先誠摯的感謝指導教授 陳重元教授悉心的教導使我得以一窺毒物 學領域的深奧，不時的討論並指點我正確的方向，使我在這些年中獲益匪 淺。老師對學問的嚴謹更是我輩學習的典範。 本論文的完成另外亦得感謝交大生科所 楊進木教授以及中山醫大職 安系 趙木榮教授兩位口詴委員在論文中提出許多寶貴的意見與更正一些 觀念，使得本論文能夠更完整而嚴謹。 兩年半裡的日子，實驗室裡共同的生活點滴，學術上的討論、言不及 義的閒扯、讓人又愛又怕的宵夜、趕計畫實驗的革命情感、因為睡太晚而 遮遮掩掩閃進實驗室...，感謝眾位學長姐、同學、學弟妹的共同砥礪(墮 落?)，有你們的陪伴讓兩年半的研究生活變得絢麗多彩。感謝楊詔芬學姐 不厭其煩的指出我研究中的缺失，也感謝心渝、庭孙同學的幫忙，恭喜我 們畢業了。實驗室的思宏、家祥、哲賢學弟、萱芳、筱涵、慈君學妹們當 然也不能忘記，你們的幫忙及搞笑我銘感在心，也感謝思宏的哥哥替我修 改一些英文上的措詞文法，感恩！ 另外還要感謝的是我的摯友庚轅、信元、信佑，在我最需要發洩時， 充當我的沙包；當我需要流淚時，化作我的衛生紙，是你們給我撐完這兩 年半的力量，因為你們讓我的碩士生活不寂寞。 家人背後的默默支持更是我前進的動力，妹妹的鼓勵、爸爸的體諒、 媽媽的支持及銀彈補給，給了聖然一針強心劑，家人的溫暖一直是我待在 這風大的新竹最好的暖暖包。最後，謹以此文獻給我摯愛的雙親

目 錄

表次 頁次

中文摘要 ... I 英文摘要 ... II 誌謝 ... III 目 錄 ... IV 表目錄 ... VII 圖目錄 ... VIII 第一章、緒論... 1 1.1 研究緣起... 1 1.2 研究目的... 2 1.3 研究方法及架構... 2 第二章、文獻回顧... 4 2.1 毒性物質-酮類之介紹 ... 4 2.1.1 酮的定義... 4 2.1.2 酮類之物化特性... 5 2.1.3 常見酮類在環境中的流佈... 5 2.1.4 常見酮類之應用... 5 2.2 藻類毒性詴驗... 6 2.2.1 詴驗物種簡介... 6 2.2.2 藻類毒性詴驗優點... 7 2.2.3 藻類反應終點之量測... 7

2.2.4 批次式藻類毒性詴驗 (Batch of toxicity tests with microalgae) ... 8

2.2.5 密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗 ... 8

2.2.6 詴驗之重要參數... 8

2.2.7 揮發性有機物實驗... 11

2.3 定量-結構反應關係 (Quantitative Structure-Activity Relationship ；QSAR) ... 12 2.3.1 QSAR 之簡介 ... 12 2.3.2 常用之 QSAR 參數 ... 13 2.3.3 QSAR 在環境毒物學上的應用 ... 14 2.3.4 QSAR 的分類 ... 15 2.4 -不飽和酮類之 QSAR 研究 ... 17 2.4.1 結構及性質... 17

V

2.4.2 官能基的相互作用 (Interaction of functional groups) ... 17

2.4.3 親電子性加成反應 (Electrophilic addition) ... 18

2.4.4 親核性加成反應 (Nucleophilic addition) ... 18

2.4.5 親核性及親電子性加成反應的比較 (Comparsion of nucleophilic and electrophilic addition) ... 19

2.4.6 Michael 加成反應 (The Michael addition) ... 20

2.4.7 -不飽和羰化物之毒性機制 ... 20 2.5 挑選最適迴歸參數方法 ─ 逐步迴歸分析法(Stepwise anslysis)[46] ... 21 第三章、基本理論... 23 3.1 基本生長動力學... 23 3.2 毒性物質劑量反應模式... 24 第四章、實驗設備與方法... 28 4.1 實驗設備及材料... 28 4.2 毒性詴驗藻種... 38 4.3 實驗前的準備... 38 4.3.1 培養基配製... 38 4.3.2 玻璃器皿清洗與滅菌... 40 4.3.3 盤面光度之調整... 40 4.3.4 藻類之培養步驟及裝置... 40 4.3.5 ISOTON II 之配製 ... 42 4.3.6 電子顆粒計數器操作方式與原理... 42 4.4 儀器操作原理、步驟與設定條件... 44 4.4.1 TOC (總有機碳分析法) ... 44 4.4.2 總有機碳分析之標準液配製流程... 46 4.5 密閉式藻類毒性詴驗方法及步驟... 46 4.5.1 實驗方法... 46 4.5.2 實驗步驟... 46 4.6 RC50反應性參數值實驗 ... 50 4.7 實驗之品保及品管 (QA/QC) ... 52 第五章、結果與討論... 53 5.1 藻類毒性詴驗數據... 53 5.2 NOEC、EC10之比較 ... 54

5.3 急慢毒性比 (Acute-Chronic Toxicity Ratio；ACR) ... 57

5.4 -不飽和酮類與基線毒性之比較 ... 59

5.5 密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗與其他物種詴驗之比較 ... 62

5.6 QSAR 分析 ... 65

5.6.1 毒性數據與傳統物化參數 Log P (辛醇-水係數) 迴歸分析 ... 65

5.6.3 毒性數據與電性參數迴歸分析... 66 5.6.4 毒性數據與反應性分析... 72 第六章、結論與建議... 74 6.1 結論... 74 6.2 建議... 75 第七章、參考文獻... 76 附錄一、原始數據... 82 附錄二、統計方法... 110 附錄三、參數計算軟體使用方法... 115

VII

表目錄

Table 2.3.1 Classification of reactive mechanism ... 16

Table 3.2.1 The types of Weibull、Probit and Logit models ... 27

Table 4.1.1 Physical and chemical characteristic of -unsaturated ketones ... 32

Table 4.1.2 Reference toxicity data and descriptors of -unsaturated ketones ... 37

Table 4.3.1 The consist of micro-algae medium ... 39

Table 4.3.2 The consist of micro-algae medium (EDTA component) ... 39

Table 4.3.3 The conditions of Coulter Counter ... 43

Table 5.1.1 algal toxicity test results of three endpoints ... 55

Table 5.1.2 Substance classification ... 56

Table 5.3.1 The ACR values in three test end-points ... 58

Table 5.4.1 Used baseline toxicity predicted toxicity and residual between observed ... 60

Table 5.5.1 Comparison of algal toxicity test results with other spescies ... 64

Table 5.6.3.1 Utilized the descriptors of this study ... 70

Table 5.6.3.1 Utilized the descriptors of this study (continue) ... 71

圖目錄

Fig 1.3.1 The flow chart of this study ... 3

Fig 2.1.1 The structure of ketone[2]... 4

Fig 2.1.2 The structure of -unsaturated ketones [3] ... 5

Fig 2.2.1 The picturebook of Raphidocelis subcapitata ... 6

Fig 2.2.2 Carbonate system and photosynthesis method for pH balance ... 9

Fig 2.4.1 The chart of Electrophilic addition[41] ... 17

Fig 2.4.2 The formation of carbocation[41] ... 18

Fig 2.4.3 The chart of nucleophilic addition (1)[42] ... 19

Fig 2.4.4 The chart of nucleophilic addition (2)[41] ... 19

Fig 2.4.5 The difference between nucleophilic and electrophilic [41] ... 20

Fig 2.4.6 The chart of Michael addition[42]... 20

Fig 3.2.1 Dose-response relationships of common toxicity tests ... 25

Fig 4.3.1 The culture steps of algae ... 41

Fig 4.4.1 The graph of TOC analyzer ... 44

Fig 4.4.2 Introduction of TOC analyzer structure ... 45

Fig 4.5.1 The flow chart in close-system algae toxicity test ... 47

Fig 4.5.2 The diffuser system of deion-water ... 48

Fig 4.6.1 The flow chart of RC50 experiment ... 51

Fig 5.4.1 Correlation between log(1/EC50) and logP ... 61

Fig 5.5.1 Comparison of relation of P.subcapitata and T.pyriformis ... 63

Fig 5.6.3.1 Utilize Eq(11~13) predicted toxicity v.s. observed toxicity ... 69

1

第一章、緒論

1.1 研究緣起

隨著工業的發展與科技突飛猛進的快速提升，每年工廠將合成、生產 數以萬計之新化學物質，因而造成所產生的汙染物質之排放總量越來越多， 而這些新化學物質，毒性性質也相對複雜，使得造成環境之衝擊更勝於以 往。為此歐盟近年來提出一項草案 (安全化學管制法) ，此項草案業於 2006 年 12 月 13 日由經歐盟議會通過，這項法規名為 REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals；化學品註冊、評估、 授權法案) ，未來將取代歐盟現行管理化學物的 40 條法律規範。對於每項 年生產量或進口量等於或大於 1 噸的物質，除法規規定不適用或可豁免外， 每家製造商或進口商都有義務向歐盟化學總署 (ECHA) 進行註冊 (Registration) 。並提出足夠資訊以確定其安全使用。如未依相關規定完成 註冊，則無法繼續在歐盟市場流通。 針對一些廠商所需提出化學品資訊，在環境毒性風險評估部份，可利 用一些生物急毒性詴驗，讓我們可在短時間內瞭解到化合物對於生物所造 成的毒性，以便建立化學物對於造成環境生物之影響資訊及數據資料。 藻類為食物鏈的底層之生產者，當水中之毒性物質對藻類造成毒性傷 害時，會由食物鏈導致其他消費者，如微生物、甲殼類動物、無脊椎動物、 魚類…等產生生理變化，再經由生物累積及傳輸作用，進而影響到更大型 的生物種，間接破壞整個水體生態系統。由此可知藻類在水體環境中扮演 角色之重要性。 本研究實驗係採用浮游植物-月芽藻 (Pseudokirchneriella subcapitata) ， 其具有實驗方法簡單、快速、便宜、敏感均高於其他詴驗物種等優點，且 藻類繁衍迅速、生命週期較短暫、詴驗期間內帅年期或老年期對毒性物質 忍耐力之差異影響亦較小，適合選用當作毒性評估之詴驗物種。 對於許多複雜及不同結構之化學物質，由於種類繁多且數量龐大之因 素，因此無法針對所有化學物質一一進行完整之毒性分析。環境毒物學引 用醫學、製藥工業經常使用之定量-結構反應關係 (Quantitative

Structure-Activity Relatioships ; QSARs) 預測單一有機化學物質之毒性大 小及可能造成毒性之原因。此外，由於 QSARs 可以簡單而迅速的推估出 同類有機物質之毒性，不僅可節省龐大經費，亦可省下許多的時間及人 力。

本研究係利用藻類毒性詴驗方法，藉實驗結果及相關參數所建構之

能發生之毒性效應。

1.2 研究目的

1.

藉由密閉式藻類毒性詴驗，研究在不同結構之取代基 (烯基、炔 基、甲基) 、不同碳數、取代基位置之-不飽和酮類，以溶氧變 化量、最終細胞變化量和生長率為反應終點，求得各毒性化學物 質 EC50值，可做為毒性資料庫之數據以利建構更完善之毒性評 估。 2. 由於-不飽和酮類為不飽和羥基化合物，因此毒性反應機制與不 飽和羥基化合物相同均為生物親電性[1]_{，其毒性均較基線毒性} (baseline toxicity) 高，此外，藉由各種物理化學及親電性參數所 建構之 QSAR 與藻類毒性實驗所得之 log (1/ EC50) 進行迴歸分 析，以得知不同參數與毒性迴歸結果，進而可預測在不同毒性機 制下，受測有機物之毒性。 3. 過去實驗室的資料庫多探討麻醉性極性與非極性化物之 QSAR 的研究，因此想要針對反應性有機物建立更完整的數據及資 訊，所以選擇-不飽和酮類作為本研究之毒物，另外結構改變 對於親電性反應物與毒性及反應性之關係亦想作進一步探討。

1.3 研究方法及架構

首先由參考文獻中蒐集相關資料及數據，之後決定欲擬實驗毒性化學 物質後，再將所選定之毒性物質之物化資料及研究文獻做進行更進一步之 整理，其後建構實驗目的、實驗方法及實驗結果分析以完成毒性實驗流 程。 本研究乃以密閉式藻類毒性實驗，採批次實驗之方式進行，再將實驗 結 果 之 數 據 以 Probit 模 式 分 析 ， 進 而 求 得 EC50 值 及 劑 量 反 應 曲 線 (dose-response curve) 。最終再將實驗所得之結果進行更進一步之討論並提 出本研究之結論。詳細之流程如圖 1.3.1。

3 1.蒐集相關資料及文獻 2.選定實驗毒物及毒性數據 3.物化資料收集及整理 4.確認研究方向及目的 擬定實驗方法及步驟 α,β-不飽和酮類 藻類培養及實驗設計 TOC分析 1.針對Stock solution定量 2.求出名義濃度與實際濃 度之誤差比率 1.不同碳數之α,β-不飽和酮類(C4~C9) 2.單個取代基之α,β-不飽和酮類 (甲基、乙烯基、乙炔基、氯) 1.確認恆溫室內溫溼度為 適當範圍及震盪速度 2.配置基質進行連續式藻 類培養 3.實驗時儀器及盤面光度 校正工作，使調整至合 理的範圍裡 進行密閉式藻類毒性詴驗 實驗數據整理及分析 1.利用Probit模式計算出EC50 2.以藻類密閉式毒性詴驗與 其他物種進行比較 3.建立α,β-不飽和酮類之QSARs 4.從已建立資料庫之資料統整建立 更完整之QSARs 實驗結果討論及結論

第二章、文獻回顧

2.1 毒性物質-酮類之介紹

2.1.1 酮的定義

酮（ketone）：有機化合物的一類，是羰基[-C(O)-]的兩個單鍵分別和 兩個烴基連接而成的化合物。 通式：R1 -C(O)-R2，酮分子裡的羰基[-C(O)-]常被稱為酮基。 結構：其分子結構如圖 2.1.1 所示。 命名：簡單的酮常用普通命名法。芳香酮中芳基作為取代基來命名。 多元酮命名時，應選取含羰基儘可能多的碳鏈作主鏈，並標明 羰基的位置和羰基的數目。不飽和酮的命名除羰基的編號應儘 可能小以外，還要表示出不飽和鍵所在的位置。脂環酮命名 時，編號從羰基碳原子開始，僅在名稱前多加一個「環」字。 許多天然酮都有俗名，例如，天然麝香的主要成分麝香酮 (muscone) 為十五元環酮等。

Fig 2.1.1 The structure of ketone

[2]

不飽和酮類：

不飽和酮類是同時接有碳-氧雙鍵及碳-碳雙鍵的酮類，其化學結構如

下圖2.1.2所示：

5

Fig 2.1.2 The structure of -unsaturated ketones

[3]

C 為接酮基上碳之鄰近相接的 C＝C 之第一個碳，C 為接酮基上碳之 鄰近相接的 C＝C 之第二個碳，R1、R2 為分別不同的取代基；本研究係針 對具此結構之酮類及其衍生物或同分異構物做探討。

2.1.2 酮類之物化特性

羰基帶有極性，因此酮分子亦帶有極性。羰基與水分子之間有氫鍵， 因此酮能溶於水中。但是，酮分子之間沒有氫鍵，因此酮的揮發性較分子 重量相近的醇及羧酸為高。常見的酮類為丙酮、丁酮及丁二酮等等。以丙 酮為例，丙酮在常溫下為無色透明液體，易揮發、易燃，有芳香氣味；與 水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和吡啶等均能互溶，能溶解油、脂肪、樹脂 和橡膠等，亦能溶解醋酸纖維和硝酸纖維，是一種重要的溶劑。

2.1.3 常見酮類在環境中的流佈

酮類由於它很穩定所以常常被應用於工業製程及生產日常生活用品上 然而它也是揮發性有機溶劑的一種，在放流水中也常常存在著。酮類與同 碳數的醛類相比毒性也較低，但雙酮類例外[4]_{。另外，酮類在自來水消毒} 程序中也常常被當作臭氧的副產物，或是在不完全氧化與燃燒下的產物， 還有被當作代謝產物等[4]_。

2.1.4 常見酮類之應用

酮類在日常生活中廣泛被應用，較常見的有下列幾項：

1.

用作卸除指甲油的去光水，以及油漆的稀釋劑。

2.

可作為有機溶劑，應用於醫藥、油漆、塑料、火藥、樹脂、橡膠、照相 軟片等行業。

3.

在工業上應用於製造雙酚 A、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、丙酮氰醇、甲基 異丁基酮等產品，以及塑膠、纖維、藥物及其他化學物質。

4.

冷劑：丙酮與乾冰的混合物可當冷劑 (-50℃)。

5.

丁酮用作溶劑、變性劑、催化劑，也用於製取過氧化甲乙酮。

6.

在食品中可作為調味添加劑。例如，丁二酮與 3-羥基-2-丁酮一樣，是 使黃油帶上其獨特口感的化合物。正因如此，食品生產商在人造黃油或 類似油類食品終產品中添加丁二酮與 3-羥基-2-丁酮（同時添加 β-胡蘿 蔔素以增加黃色），雖然這些添加劑是無味的[5]_。

2.2 藻類毒性詴驗

2.2.1 詴驗物種簡介

本實驗所採用的詴驗藻種為月芽藻 (Raphidocelis subcapitata ,

Selenastrum capricornutum or Pseudokirchneriella subcapitata) Strains UTEX

1648，為 2008 年 8 月份向 The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austi (http://web.biosci.utexas.edu/utex/)所購得。Raphidocelis

subcapitata 是屬於綠藻綱 (Chlorophceae) 其特徵為單細胞、成群體但不糾 結、不能移動，一般細胞體積為 40-60µm3_{。典型的 Raphidocelis subcapitata} 體積約為 45µm3 _{且重量介於 10 至 20 pg/cell 之間}[6]_{，因為體型呈半月型，} 所以稱為月芽藻，具備有取得容易、培養簡單、容易觀察、生長期短、可 以大量生長、具有地區代表性等實驗用的藻種需具有的特點，並較其它微 生物詴驗來的敏感[7]_{，圖 2.2.1 為典型月芽藻。}

7

2.2.2 藻類毒性詴驗優點

藻類由於下列優點而被廣泛用於進行毒性之研究： 1. 藻類為生態系統中最低階的生產者之ㄧ，在食物鏈的過程中由於 生物濃縮作用 (Bioconcentration) 而造成其他高階消費者體內含 有高濃度之毒性物質。 2. 在毒性詴驗過程中，藻類生長過程可分成四個階段：遲滯期 (Lag phase)、對數生長期 (Exponential phase)、穩定期 (Stationary phase) 及死亡期 (Death phase) 。在良好的培養環境下，可以迅速讓藻類 到達對數生長期和穩定期，並且持續一段較長的時間，如此便有 利於實驗之進行。其他某些生物實驗則必頇受到長期的帅年時期 或生命週期之限制。 3. 藻類毒性詴驗與其他物種之毒性實驗進行比較後，可發現藻類具 有較高之再現性。尤其於密閉式之藻類毒性詴驗中[8]，當反應終

點為ΔDO 及 Growth rate 時，兩者之變異係數 (coefficients of variation；CV) 約為 10%，而傳統之藻類毒性詴驗其 CV 為 20~32% 左右，由此即可發現密閉式藻類毒性詴驗法具更高之再現性。

2.2.3 藻類反應終點之量測

一般藻類毒性詴驗之標準方法 (U.S. EPA[9]、OECD[10]、ISO[11]、

APHA[12]、ASTM[13]_{) 皆是於詴驗終點時，測量藻類的生物質量。而量測}

生物質量最直接的方法就是量測生物之乾重，但是直接稱重的方法，需要 花費較久的時間，所以利用電子顆粒計數器、光學顆粒計數器等之間接量 測生物質量的方法逐漸將直接稱重法取代，因為這些方法簡單、快速，所

需藻液量亦少，且與生物乾重之間有良好的相關性[14]_{。另外，生長率}

(growth rate) 也是一項經常被測量的反應參數，學者[15, 16]曾經分析 ISO’s

ring tests 實驗數據，發現以生物質量及生長率為反應終點時，生長率的 EC₅₀ 值高了一倍。 另外一個觀測終點是量測詴驗水的溶氧，直接量測水中溶氧之變化， 再依此計算出藻類生長之情形，優點是成本低、量測時間短。Hostetter 發 展出一套量測水中溶氧之藻類詴驗方法，詴驗時間僅需二十四小時，且在 以 Raphidocelis subcapitata (月牙藻) 為詴驗物種的實驗中發現，當一種或 多種之營養鹽呈限制性狀態時，藻類之淨光合反應量會與限制性營養鹽呈 現線性關係[17]。 綜合以上的觀點，本研究採用以細胞密度為基礎計算出的生物最終產 量 (final yield) 、生長率 (growth rate) 以及溶氧產生量 (ΔDO) 當作整個

詴驗的反應終點，並比較這三種反應終點對-不飽合酮類的敏感度。

2.2.4 批次式藻類毒性詴驗 (Batch of toxicity tests with microalgae)

批次式毒性詴驗為起初提供藻類足量的生長基質，但是在後續的實驗 過程中則不再添加任何基質，亦無藻類之代謝物質流出。在此條件之下， 基質的消耗及代謝物的累積皆會降低藻類毒性詴驗之敏感性，同時也難反 應出真實水體中的情況。但由於此方法的優點為操作容易、成本低廉且可 同時處理大量之樣本，因而到目前為止仍被廣為使用。

2.2.5 密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗

想發展出成功的密閉式藻類毒性詴驗系統，需要克服兩個問題：1. 要 提供足夠的碳源 CO2，以避免藻類因為碳源不足生長受到抑制。2. 能確保 毒性物質在詴驗期間內能維持穩定的濃度。 本研究使用了具有完全密閉系統優點之 BOD 瓶進行毒性詴驗。過去實 驗室人員 Huang[18]，Lin[19]等發展出連續式培養加上 BOD 瓶密閉式詴驗系 統，利用連續式的培養方法結合了 BOD 瓶 (BOD bottle) 發展出詴驗方法 為「48 小時的批次式 BOD 瓶藻類毒性詴驗」其主要為使用體積 300ml 的 BOD 瓶，將藻類、營養鹽和詴驗毒物加入其內，再用蓋子密封，讓藻類暴 露於毒性物質一段時間，由觀測終點量測實驗組與無暴露控制組的抑制情 形並進行比較分析。整個實驗過程中沒有新鮮基質的加入，也沒有藻類之 代謝物移出，在其優點操作簡單，時間與成本的耗費也大幅減少，且可處 理較大量的樣品數、實驗數據取得容易，所以相對了提高實驗的再現性。

2.2.6 詴驗之重要參數

在進行任何的毒性詴驗之中，其結果皆可能不盡相同，而不同的操作 參數亦皆可能是導致實驗結果差異的主要因素之一，因此對於各參數必頇 進行嚴格的控制並了解各參數對於藻類生長與毒性之間是否有其相關性。 下列為本研究所考慮之參數： (一) pH 控制及碳源供給 由於藻類因進行光合作用而導致 pH 產生明顯的變化，因此於實驗系 統中若不對 pH 加以控制的話，則重複性的詴驗將難以進行。此外，

9 在碳源方面，由於藻類生長時首先會消耗水中之溶解性二氧化碳(本實 驗設備之曝氣幫浦和氣體鋼瓶所提供)，次者為培養基 (medium) 中的 碳酸氫鈉 (NaHCO3) ，當碳源不足時則會造成藻類死亡。在 pH 控制 方面，由於預測某特定 pH 值情況之物種濃度較有其困難性，且 pH 亦 會改變毒性物質於水中的型態及濃度，進而影響毒性的大小。如 HCN 於 pH 7.8 降至 7.5 時，毒性會提高 10 倍左右。因此標準藻類毒性詴驗 皆傾向於固定 pH 值。Nyholm[20]_{提出固定藻類 pH 的方式，如圖 2.2.2} 所示：

Fig 2.2.2 Carbonate system and photosynthesis method for pH balance

不同的標準方法對於 pH 的變化皆有不同之規定，如 U.S.EPA 要求最 終之 pH 需再 8.5 之下，OECD 則規定 pH 的變化不可超過一個單位；ISO 則要求 pH 的變化不可超過 1.5 的單位。因此控制 pH 變化的方法大致上有 下列幾種：

1.

減少接種生物量

2.

系統加入二氧化碳加以曝氣

3.

維持均勻振盪

4.

保持空氣流通

5.

縮短整體的實驗時間 Arensberg et al.[21]利用月芽藻為詴驗物種進行藻類毒性詴驗，為防止 pH 值的變化而將詴驗時間由三天縮短為二天。而 Lin et al.[19]_{於密閉式藻類毒} 性詴驗中並未控制整體系統之 pH，發現當水中溶解性金屬對於藻類的抑 制率高於 20%時，系統中的 pH 變化大多皆在 1.5 個單位以下，因此認為 藻類毒性詴驗是不需要針對 pH 變化而加以控制。本研究依據早期之藻類 毒性研究方法[22]於進行毒性詴驗前，將 pH 控制於 7.5 左右，使其減少 pH 變化所造成之可能誤差性。 (二) 光照強度

Nyholm and Kälqvist [23]提到光照強度會影響藻類行光合作用，因此在 ( Biomass production CO2(gas) CO_2(aqua) HCO3 -CO3 -H2CO3 )

其藻類毒性詴驗的設計中如要使藻類維持在 exponential phase，則光照需設 為常數，要維持在該條件下的方法有兩種：(1) 保持較低的生物質量 (biomass)、縮小培養體積及提供充分之混合，此一方法的主要目的是為可 減少「自身遮蔽（self-shading）」所產生之影響，即排除因光源的遠近距離 使得光照強度之差異。 (2) 為提供飽和的光照強度，使得藻類能吸收到一 定量的光度而不會影響到生長。因此，如光照強度為一常數時，能使藻類 呈現對數生長，縮小培養體積等優點以利藻類處於理想的環境中。

本研究依照 U.S. EPA[9]標準方法針對 Raphidocelis subcapitata 的規定， 於連續式培養和批次詴驗中所選擇的光照的強度為 4300±10% lux， 與其 它標準方法 ISO、OECD、EEC 的 8000 lux 不同，採用連續式的光照來排 除光暗交替循環式的光照所導致的藻類生物質量變異的缺點。 (三) 溫度 採用 U.S. EPA[9]_{建議的 24±1℃，在恒溫室下培養藻類及進行實驗，整} 個培養及詴驗過程中需注意恆溫室中溫度的變化，讓溫度維持在帄均溫度 變化量 1℃，以確定實驗進行溫度分布的均勻度。 (四) 植種之藻液初始密度和詴驗時間 在批次式實驗中，當植入 BOD bottle 的藻液初始密度過低時，即藻類 細胞數目過少，會導致些微的細胞數量變動便可讓生長率產生大幅度的變 化，將這樣的數據輸入 probit 等模式計算出的 EC50 也會有較大的變異性 （C.V.值），反之若植入的藻液初始密度過高時將會造成實驗後期由於藻類 細胞大量增加造成代謝物累積及水中碳源耗盡而導致 pH 值升高和 EC50 會隨之顯著升高等問題，進而影響毒性詴驗結果之精確度，因此決定較適 當的植種數量是影響詴驗結果中很重要的因子。 詴驗時間的長短會關係到毒性詴驗的敏感性和數據結果，如過長的詴 驗時間，會使得存在於 BOD bottle 內的營養鹽不足，使得無加毒物的藻類 也會與有加毒物的藻類發生出死亡的現象，受處理組與控制組在最終產量 的差距會逐漸縮短，此外過長的詴驗期間，也會使得毒性的反應消失，在 Lin[19]詴驗結果發現隨著時間增加，毒性詴驗的敏感度提高而 C.V.值減少， 隨著初始植種密度減少，則敏感度提高但 C.V.值亦提高。在兼顧兩者的考 量下，本詴驗選定最佳化條件為控制 BOD bottle 內藻類初始植種密度在 1.5×104 cells/ml，詴驗時間為 48 小時。 (五) 實驗培養基 實驗培養基的成份是影響微生物毒性詴驗結果的重要因子之一[24]，而 主要之影響培養基因子有 pH、硬度、螯合劑、氮、磷及一些主要陽離子。 一般為了使詴驗之環境符合自然環境之情況及讓藻類能有效的利用微量 元素，於詴驗中會額外加入一定量之螯合劑 (EDTA) 。此外，氮、磷元素 對於藻類生長與毒性詴驗結果影響最大。因此即針對上述之培養基質進行 分別探討： 1. 氮、磷的影響 在一般的自然水體中，存在這各種不同的生長元素，其中以氮、 磷兩種元素為藻類生長的主要限制因子。Lin[19] 針對重金屬鋅及有機

11

物質酚進行毒性詴驗，由詴驗結果發現，當 U.S. EPA 營養基質的 HCO3

-加倍後對毒性詴驗敏感度之影響並沒有一定之趨勢，而且並不會對其 毒性反應造成太大之影響，而最直接影響藻類生長最主要的因素則為 氮或磷的濃度，此即為藻類生長的限制性因子。 在水中只有 PO43--P 形態能夠直接被藻類吸收，故於各種藻類詴 驗方法中，磷皆是以正磷酸鹽之型態存在 (如 ISO 和 OECD 是 KH2PO4， U.S.EPA 是 K₂HPO₄)，至於氮的形態，由於 NO₃--N 及 NH₄+-N 皆能被 藻類吸收，在 ISO 和 OECD 用的是 NH4+ (NH4Cl)形態，U.S.EPA 用的

則為 NO3- (NaNO3) 形態。Millington et al.[25]提到自營菌無法像異營菌

能快速利用 NH4+-N 而快速生長，且 NO3--N 不似 NH4+-N 那麼容易為

異營菌所使用，所以一般自然環境中藻類的氮源應是硝酸態。 2. 螯合劑 (EDTA) 的影響

一般為使詴驗之狀態符合自然環境狀況及讓藻類能有效利用微量 元素於詴驗時會在培養基中加入固定量之螯合劑，但根據文獻指出一 些螫合物如 EDTA、NTA 等與常見之二價金屬 (Cu2+_、Cd2+_、Ni2+_、Pb2+_、

Zn2+) 所形成的親水性複合物，較之前未螫合時呈現的游離態時的毒 性還低，因此倘若進行重金屬實驗時勢必會影響毒性詴驗之結果[26, 27]_。 因此，1996 年 U.S. EPA[9]_{建議在培養藻類時可加入固定量之螯合劑於} 培養基中，但在進行藻類毒性詴驗時，培養基中則不添加任何螯合劑。

2.2.7 揮發性有機物實驗

早期的標準生物詴驗方法皆以評估「水溶性」及「非揮發性」的化學 物質，尚無方法可偵測揮發性有機物的毒性[28]_{。其主要因素為傳統的批次} 式毒性詴驗方法皆為開放式系統 (Open-system)，此一系統會提供激烈的振 盪以利藻類進行氣體交換並得到無機碳源 (CO2)。但揮發性化學物質濃度 會伴隨著詴驗期間拉長及震盪詴驗瓶之過程中逐漸消失因而低估其毒性， 相對地亦造成各個實驗室測詴的毒性結果會有所差異。 一般藻類毒性詴驗之密閉式系統，需考慮下列兩項重要的因素：(一) 為提供足夠的碳源，以避免藻類會因為碳源不足而生長受到抑制，(二) 為 確保詴驗毒性物質於詴驗期間因揮發作用而改變毒物濃度。 本詴驗方法為密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗，為了改善上述的缺點不 讓揮發性物質的濃度會因為詴驗容器的上方留有未裝滿液體的空間(head space)而有揮發、濃度減少的情形，因此在本詴驗的容器 BOD 瓶會將液體 (毒物+基質) 加滿至不留空間，讓 Head Space 減至最低；在提供足夠的碳 源的部分，事先將去離子水以 CO2－N2混合氣體曝氣，一方面除去水中溶 氧，另一方面便是增加碳源，讓營養液能有足夠的碳源使藻類生長不受抑 制。

2.3 定量-結構反應關係 (Quantitative Structure-Activity

Relationship ；QSAR)

2.3.1 QSAR 之簡介

雖然傳統的生物分析法可得知有機化合物對生態環境所造成之衝擊， 但其缺點為所需的時間較長，且由於大量新的化合物不斷的推陳出新，因 此即必頇建構出一套可快速預測化合物毒性的方法，以減少時間及金錢上 的浪費。 早在西元 1930~1960 年期間，就有幾位學者專家為了研究物質的化學 結構與其活性的關係，提出了 formal structure-activity relationship 的理論， 之後並陸續地應用在藥物以及殺蟲劑的研究方面，一直到了西元 1970 年， 才有學者提出了 Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR)，並且 開始廣泛地應用在環境毒理學上的研究。簡單來說，它就是以一種物質的 化學或物理性參數，來建立一個模式，描述並預測此物種與這些參數之間 的毒性關係。 環境毒理學中，QSAR 的建立即是為了預測每日所不斷產生的新化學 物質的毒性，因此為了能建構有效的 QSAR 模式則必頇注意下列因素： 1. 應用於 QSAR 模式之參數，必頇在極小的偏差範圍之內，所 建立之模式才能有效並準確的預測毒性大小及毒性反應機 制。 2. 目前為止，QSAR 模式的發展僅應用於預測單一毒性物質之毒 性，對於混合毒性之分析尚未有完整之研究。 3. QSAR 模式並非以一種模式就可以包含各種形式的化學物 質。簡單而言，針對某一種毒性物質之研究，最好能配合該 毒性物質之衍生物同時進行分析，其所建立之模式才有最佳 之效果。 4. QSAR 模式所應用之毒性數據及參數，需有容易取得之便利 性。此外，需針對實驗毒物之特性篩選所使用之參數；例如， 該毒物為低水溶解性，則不應將溶解度當為建立 QSAR 模 式之參數。 McFarland[29]認為化學物質的毒性主要有下列兩種因素所造成： (1) 毒物進入生物相的穿透力。 (2) 毒物和反應位置的相互作用。 以數學模式表示法如下：

13

2.3.2 常用之 QSAR 參數

參數含喻一些結構上的特性及性質，因此在定量方法上可利用生物活 性進行迴歸；一些特定物理化學性質參數值，可代表毒性物質與受測物種 之間的作用力。一般使用的 QSAR 參數大致可分為下列幾種類型： (一) 親脂性參數 (hydrophobic or lipophilicity parameter)

建立QSAR 模式最常使用的參數即為親脂性參數，這方面的參數包括 溶解度、辛醇-水分配係數 (log P or log Kow) 等。因為此參數與毒性的水溶 性、薄膜的滲透性及提供配位基 (ligand) 與接受器 (receptor) 的鍵結有直 接的關係。簡單而言，各類化學物質和不同生物系統的作用未必相同，但 是當化學物質要進入細胞體內時，親油性的作用機制將優先考慮於化學物 質和反應位置的作用，因為疏水性物質對細胞的作用機制被認為與被動擴 散 (Passive diffusion) 有關，所以穿透細胞膜的動力是與化學物質的疏水 性有直接關係。 親脂性參數定義為一個化合物在水溶液相和非水溶液相分佈的情況; 早期對於分佈係數 (partition coefficient ; P) 的定義為與「輕」和「重」相 有關。現今對於 P 的定義為物質濃度在有機相和水溶液相帄衡時分佈的 比例。 P= C_org/C_aq 在較早時期的QSAR 模式中會使用不同的有機相和水相系統所得到的分 佈係數，但自從Hansch 使用有取代基的苯甲酸正辛醇和水的分佈係數後， 正辛醇即變成分佈係數中所使用的有機相。Russom et al.[1]_{指出擁有越高} log P 的物質會增加物質在水中與生物相 (Biophases)的帄衡時間，因而增 加其LC50 ratio (24h LC50 / 96h LC50)。現今已有很多方法可以利用電腦軟體 幫助我們預測化合物的log P，但由於彼此之間的預測起始點不同，因此導 致有不同的結果，由其是對於一些溶解度低的化學物質，預測的結果常會 與實驗所得的結果有偏差[29]_。 (二) 電子參數 (Electronic parameter) 分子的電子性質可以用許多不同類型的參數來描述。一般這類型的參 數包括有原子電荷數 (Atomic charge) 、分子軌域能量 (Ehomo 和Elumo) 、

未定域化 (Delocalizability) 、偶極矩 (Dipole moment) 、Hammett 取代基 常數 (Hammett sigma substituent constant; σ ) 和還原位能 (Reduction potential)等。上述之所有參數都是描述一些基團 (group) 或取代基對電子 分佈的影響，因此在QSAR 的建立上都有應用過這些參數。相對於描述整 個分子性質的參數 (親脂性參數和莫耳折射率) ，電子參數主要著重於一 些原子或基團 (除了偶極矩)。例如，選擇σ p 來描述對位 (p-) 取代基對於 phenolic 酸性的影響，此模式可以表示phenolic 基團在與鍵結位置作用時 當作一個氫鍵的提供者或接受者。

根據 (Atkins, 1994)[30]_{第五版的物化課本中指出，highest occupied}

molecular orbital (HOMO) 和lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) 這兩個軌域會共同形成分子的「Frontier orbitals」，這個軌域對於一個分 子的化學及光學性質具有高度的關聯性。當分子之間以形成電荷轉移方式 相互作用時，HOMO 可作為分子給予電子能力的量度；而LUMO 則可做 為分子接受電子能力的量度，亦即電子是從HOMO 轉移至LUMO，因此 透過HOMO 和LUMO 來了解分子的電離能力和電子親合力。 (三) 立體 (空間) 參數 (Steric parameter) 立體效應很難去描述，因為在鍵結位置時的 3D 結構通常很難取得。 立體效應常數 Es 是在QSAR的研究中第一個被使用來描述立體效應的參 數，而其他相關參數包括總表面積 (Total surface area)、總分子體積 (Total molecular volume) 及莫耳折射率 (molar refractivity) 等。Di Marizo and

Saenz[31]發現化學物質之分子體積與其毒性成正比，因為在相同濃度的溶

液當中，分子體積較大的化學物質佔有較大的體積分率。 (四) 分子連結參數 (molecule connectivity indices; MCIs)

最早是由Randic [32]_{所提出，所代表的是化學結構上的鍵結與分支，可} 將其量化的結果做為化合物的參數，此一參數並非物理或化學性質，所以 很容易利用演算法從結構式中取得。 (五) 極性參數 (polarizability) 莫耳體積 (MV)、莫耳折射率 (MR) 及等張比容 (parachor; PA) 都為 相關性之參數。 MV=MW/ρ MW:分子量，ρ:密度 MR=MV×[n2-1/n2+2] n:折射係數 PA=MV×1/4 :表面張力

其中MR 被廣泛應用於QSAR，且與凡得瓦體積 (van der waals volume)、 等張比容有很好的相關性 (R=0.92 and 0.97)。MR的計算是經由極化性 (polarizability) 和一些基團的極性而來的，分子中極性的部分愈大者，MR 值就愈大。早期Kubinyi[33]_{認為在QSAR的迴歸方程式中如果MR之係數為} 正，則表示取代基鍵結在極性表面;反之，如為負值或是非線性關係則表示 此鍵結的位置受到立體障礙或是一個限制區域 (limit area)。

2.3.3 QSAR 在環境毒物學上的應用

QSAR是用來評估有機化合物毒性的工具之一，早期在QSAR的發展是 先將化合物進行分類的基礎上而建立的，亦即一個QSAR的模型只能預測 同類或具類似結構化合物的毒性。 Schultz et al.[34] _{認為，在毒性分析上要} 建立有意義的QSAR模式，必頇將不同毒性機制的化合物加以分類。由於 QSAR無法在不同毒性機制下討論，因此在建立QSAR模式前需先將毒物進 行分類。Verharra et al.[35]_{首先根據毒性反應的模式來分類，其依據之標準}

15

為毒性比例(Toxic Ratio; TR)。毒性比例TR 的定義為: TR=ECx , baseline / ECx , experimental

其中ECx , baseline 為預測之基線毒性 (baseline toxicity)，ECx , experimental

為測量之實驗值。

基線毒性可藉由QSAR來預測，而且通常以單一物化參數

-log K_ow 來描述，但是log K_ow無法完整模擬生物薄膜的情況，所以在基線

毒性中又分成非極性 (non-polar) 和極性 (polar) 麻醉作用 (narcosis) 。當 某種化合物之毒性大於從QSAR預測非極性麻醉作用的5-10 倍時，也就是 5≦TR≦10，則此化合物即被歸類為極性麻醉作用。反之，如某種化合物 之TR≧10，則此化合物即被歸類為反應性 (reactive) 或是特別反應 (specifically acting) ，且當此化合物之pKa ≦6.5 時，則該物質即屬於非耦 合 (uncoupler) 之化合物[36]_。

2.3.4 QSAR 的分類

Russom et al. [1] 則將有機物分成圖2.3.1的毒性機制，可分為一般的 (General) 和特異的 (Specific) 兩大類型。一般性毒物是指麻醉作用在細胞 膜非特定的位置上；而特異性毒物有又可稱為反應性毒物，它會作用在細 胞的特定位置上或抑制特定的反應。

Fig 2.3.1 Classification of toxicity mechanism in aquatic toxicity tests

[1]

一般性也就是麻醉性，主要可分為兩類：非極性、極性。非極性麻醉 性通常是較遲鈍的化合物，也可被稱作第一類化合物（class I compound）， 在QSAR分析上，與辛醇與水係數（log P）成良好線性關係，也可定義為 基線毒性 (baseline toxicity)。極性麻醉性之化合物通常比第一類化合物活 潑，包括了酚類與苯胺類等具有氫鍵給體 （hydrogen bond donoracidity） 特性的化合物。

(nonpolar narcosis) 、磷酸呼吸的非耦合 (phosphoric acid respiratory uncouplers) 與親電性 (electrophilic) 或親核性 (nucleophilic) 物質等。所 有的有機化合物皆有能力產生麻醉效應，但此效應於低濃度中會被許多特

異性機制的存在而抵銷[37]_{。因此常被用於描述難分解化合物與細胞膜間非}

共價性的交互作用 (interaction) ，其原因在於擾動了膜層(磷脂雙層)間脂

質與蛋白質的比例[38]_{，改變細胞膜脂質成份，進而產生毒性效應。}

Hermen[39]將化學物質廣義分成四大類：Class I inert chemicals、Class II less inert chemicals、Class III reactive chemicals、Class IV specifically acting chemicals。

Lipnick[40]將反應性有機物分為四類 (表2.3.1)，分別為反應性親電型毒 性(Electrophilie toxicity)、反應性前親電型毒性(Pro-electrophilie toxicity)、 反 應 性 具 氰 基 型 毒 性 (Cyanogenic toxicity) 和 反 應 性 多 機 制 型 毒 性 (Multiple toxicity) 。

Table 2.3.1 Classification of reactive mechanism

1. Excess toxicity of electrophile nonelectrolytes

Nucleophilic substitution: allylic and propargylic activation Nucleophilic substitution: benzylic activated

Nucleophilic substitution: α-halo-(C＝X, C≡X)

Acid anhydrides

Strained three-membered heterocyclic ring Michael-type addition

Schiff base formation

2. Proelectrophile noneelectrolytes and excess toxicity

Alcohol dehydrogenase activation Monooxygenase activation

Glutathione transferase activation

3. Cyanogenic noneelectrolytes and excess toxicity

Cyanide release via cyanohydrin-like toxicant Cyanide release via monooxygenase activation

17

2.4



-不飽和酮類之 QSAR 研究

2.4.1 結構及性質

一般，含有C＝C雙鍵和C＝O雙鍵的化合物具有二種官能基特徵的性 質。一種不飽和酮在C＝C雙鍵上能進行酸類或鹵素的親電子性加成反應、 氫化反應、羥化反應以及裂解；在羥基上能進行酮典型的親核性加成反應。 在-不飽和羰基化合物中，有C＝C雙鍵與C＝O雙鍵僅隔一C－C單鍵； －C＝C－C＝O即雙鍵共軛。因此種共軛之故，此種化合物不但具有各別 官能基的性質，亦具有某種其他性質[41]_。

2.4.2 官能基的相互作用 (Interaction of functional groups)

C＝C雙鍵被送電子基活化，被拉電子基去活化。C＝C雙鍵的作用如 親電子性詴劑的電子源；其電子的可用度取決於與之連結的基。具體一點

就是送電子性取代基使初期 離子分散其正在成長的陽電荷而穩定過渡

狀態；拉電子性取代基因加強陽電荷故使過渡狀態不穩定 (圖2.4.1)。

Fig 2.4.1 The chart of Electrophilic addition

[41]

C＝O，－COOH－，－COOR等基為有力的拉電子基，故可望去活化 C＝C雙鍵的親電子性加成反應。但此種強力的拉電子性，對於尋找電子的 詴劑有去活化C＝C雙鍵的作用，同時富電子詴劑會活化C＝C雙鍵。結果， -不飽和酮的C＝C雙鍵可接受親核性攻擊，而進行親核性加成反應 (nucleophilic addition)[41]。 

2.4.3 親電子性加成反應 (Electrophilic addition)

羰基的存在不但降低C＝C雙鍵對於親電子性加成反應的反應性，而且 控制加成反應的位向。一般言之，不對稱詴劑加成於-不飽和羰基化合 物時氫連結於-C而負性基連接於-C。例如： CH3—C＝CH—C—CH3 + CH3OH CH3—C—CH—C—CH3 單純烯類的親電子性加成反應以生成最穩定的中間體 離子的方式進行， -不飽和羰基化合物的加成亦與此原理一致。-C上的加成產生穩定生成 物 (Ⅲ) ，此物僅為不飽和羰基化合物的烯醇體 (enol form)。該烯醇體然 後進行互變異購化反應成酮體 (keto form) ，得生成物 (Ⅳ)[41] _{(圖2.4.2)。}

Fig 2.4.2 The formation of carbocation

[41]

2.4.4 親核性加成反應 (Nucleophilic addition)

有很多例子，都說明了明顯過量的毒性是由於包含鹵素或其他適合的 離基 (leaving group) 發生親核性反應 (SN reaction) 所造成[42, 43] 。藉由此

機制作用的化合物被認為在生物高分子內之化合物共價鍵與其硫氫基、氨 O CH3 O CH3 CH3O H H2SO4 異丁烯基甲基酮 Mesityl Oxide 4-甲氧-4-甲-2-戊酮 4-Methoxy-4-methyl-2-pentanone

19

基及其他親核基鍵結。明顯過量的毒性在這些親電性物質其離基在-位置

為雙鍵 (allylic activation) 或參鍵 (propargylic activation) 亦或芳香環 (benzylic activation) 上被展現出來[42] (圖2.4.3)。然而，和鹵碳化物

(halo-carbon) 類似的官能基，例如苯甲醯甲基 (phenacyl)、羧基 (carboxyl) 及氨基化物 (amide) 也會同時產生活化 (-activation) 作用[42, 43]。

Fig 2.4.3 The chart of nucleophilic addition (1)

[42]

由於SN活化的部份 (activating moieties) ，基本結構 (substructural

screen) 是以sp3碳位與一個鹵素及碳氫原子共價鍵結結合，用X－CY3表示，

其中X = I, Br, Cl ，Y = C, H，只有I, Br, Cl 作為離基，而先前的研究指出 F, C≡N 不適合在親核性取代 (S_N displacement) 當做離基。

2.4.5 親核性及親電子性加成反應的比較 (Comparsion of nucleophilic

and electrophilic addition)

親核性及親電子性加成反應間的差異當然在其所生成中間體離子具有 相反電荷：在親核性加成反應中成負性，在親電性加成反應成正性。結果 取代基的效應完全相反。拉電子基去活化 C＝C 雙鍵的親電性加成反應， 活化親核性加成反應。拉電子基在親核性加成反應中因幫助分散生長中的

負電荷以穩定化導致生成中間體陰離子的過渡狀態(圖 2.4.4) [41]_：

-不飽和羰基化合物的加成反應以對整個全共軛系的攻擊論之最易 瞭解。欲得最穩定的中間體離子，此攻擊必頇發生在該共軛系的一端。親

核性詴劑攻擊-C 生成負電荷部份被電負性原子氧所容納的陰離子；親電

子性詴劑攻擊氧生成正電荷被碳所容納的 離子 (圖 2.4.5)[41]_。

Fig 2.4.5 The difference between nucleophilic and electrophilic

[41]

2.4.6 Michael 加成反應 (The Michael addition)

含極性官能基之-不飽和羰基化合物具明顯的毒性由於 Michael 加

成 (Michael-type addition) 至親核性高分子位置作用所致[42]_{。 圖 2.4.6 為}

Michael 加成反應之示意圖[42]，Enz 為強鹼性陰離子，SH 為硫氫基。

Fig 2.4.6 The chart of Michael addition

[42]

Michael 加成 (Michael-type addition) 主要由兩個步驟形成[44]： (1) 藉由所形成之共價鍵向內轉至親電性中心

(2) 最後在分子上不留下離基 (leaving group)

此分子機制常常發生在 C＝C 雙鍵之外層碳原子上，藉由硫醇基在外層碳

原子上之親核性加成反應[44]_。

2.4.7 -不飽和羰化物之毒性機制

Papirmeister et al. [45]重新探討 Michael 加成親電性物質的毒性，簡單來 說，毒性是由於一開始的 GSH 烷基化而之後依序遞減，使得其他含硫氫

基物質尤其是鈣離子轉運酶 (Ca2+

21 離子體內帄衡與細胞骨架，破壞並使細胞質膜喪失完整性。GSH 是一種由 L--glutamyl-L-cystemylglycine 所構成之三肽類，它的半胱氨酸 (cystemyl ) 提供了關鍵的硫氫基部分 (SH moiety) ，它亦是便利性傳輸之重要的功用 物質，會經由接合作用 (conjugation) 消除許多反應性化合物質。自發性接 合作用 (Spontaneous conjugation) 會將所選之軟親電性物質與 GSH 內之 硫醇基交互作用以保護含硫醇基的酵素與結構蛋白[45]。

2.4.8 毒化物與榖胱甘肽(glutathione)之反應性

Michael 加成親電性物質的毒性易受到 GSH 烷基化所影響，隨著 GSH 被消耗會使硫氫基 (-SH) 容易受到攻擊，由於所選的親電性毒化物會與 GSH 自發性的結合以保護細胞內所含之硫氫基遭受攻擊。於是了解分子結 構與 GSH 之間反應性關係成為解釋不飽和毒化物結構毒性關係一個 重要的關鍵[3]

2.5 挑選最適迴歸參數方法 ─ 逐步迴歸分析法(Stepwise anslysis)

[46] 逐步迴歸法(stepwise anslysis)大多與迴歸模式結合，其為迴歸模式之一， 可將主要分析參數選出，避免不必要之預估參數，並可將影響模式之變數 影響力排序。在此所選用之統計軟體為Minitab 15。 一般在建立迴歸模式時，希望盡可能包含主要之自變數以減少誤差項， 並求得較精確之結果。但變數過多常導致模式冗大而分析困難，故常使用 較少卻足以達到解釋模式變異程度之變數數目。逐步迴歸分析可以藉由向 前選擇法(forward)、向後消去法(backward)、及逐步選擇法(stepwise)，選 擇較少數目卻足以反應迴歸模式之變數，降低預估參數量而簡化模式。逐 步迴歸程序乃利用選取一組新集合的自變數以產生一較佳的迴歸模式，將 一連串的變數簡化，藉由逐步迴歸將與因變數較有顯著關係之自變數選出， 刪除對此迴歸模式較無顯著相關之變數，經由逐步迴歸之程序減少不必要 之自變數，減低模式預估參數。變數之選取或消去通常使用F檢定之顯著 水準來決定變數去留，自變數partial R squared 值則為對模式之影響效果， 其亦作為模式選入之參考標準。[46] 向前選擇法在開始時並無變數進入迴歸模式中，在每次選擇程序中， 選出一個對模式影響最大之變數進入迴歸方程式中，並對迴歸程式選擇外 的變數以是否顯著（F 檢定，Minitab 內定p<0.25），以決定某一個預測 變數是否有資格被選入迴歸模式中。向前選擇法一步步選取變數，直至無 變數可進入模式。向後消去法和前進選擇法類似，不同的是向後消去法在 剛開始時所有變數皆在模式之中，在每一次的選擇步驟去除對模式貢獻最

小者，並對留在迴歸模式中的變數作F 檢定（Minitab 內定p<0.1），最不 顯著之變數則刪除，直到沒有變數可消去。逐步選擇法為向前選擇法和後 退消去法之結合，剛開始時模式中並無變數存在，先採用向前選擇法選取 對模式貢獻最大者之變數進入迴歸模式中，下一步驟使用向後選擇法考驗 此變數是否留下或去除，一步步考慮選取進入模式之變數，反覆選取刪除 後，直到當模式中所有變數之水準被測定為可進入且無任何變數可再進入 時，逐步選擇停止。逐步迴歸的F 統計檢定Minitab 內定標準為p<0.15， 為選取進入與消去之基礎，檢驗已在模式中之變數，刪除具有較少區別力 之變數，反之則加入，當沒有適合的變數落在模式外則結束逐步程序，可 設定較小的顯著水準提高選取變數數目，但可能所選取的變數並無法顯著 影響模式。不論是使用顯著水準還是partial R squared 之值為標準，變數的 選取個數也許不同，但選取順序依然相同。[46]

23

第三章、基本理論

3.1 基本生長動力學

在批次式藻類培養中，單細胞藻類的生長通常依循簡單的一階動力 學：

X

dt

dX





其中，X 為生物質量（一般以乾重或是細胞數表示之）；為比生長率；t 為時間。影響生長率之因子有光照、溫度、營養鹽及碳源之供應，如果光 照、營養鹽或碳源受到限制，則藻類之基本生長模式將由指數型態變成直 線型態。 在連續式藻類培養中，當系統達到一帄衡（Steady State）時： 一、 由反應槽中生物質量之帄衡可得下列式子：

X

DX

D

X

dt

dX

)

(













其中，D 為稀釋率（day-1_{）即入流量與反應槽體積之比值，當系統達到帄} 衡穩定狀態時，



0

dt

dX

則D 此表示當反應槽達到帄衡穩定狀態時，反應槽內生物之生長率即為該系統 之稀釋率。

二、

由反應槽內之基質帄衡可得下式：

         Y X DS DS dt dS

_

0 其中，S0為入流基質濃度（mg/l）；S為系統達帄衡穩定狀態時，限制性基 質之濃度（mg/l）；X 為系統達帄衡穩定狀態時，生物質量之密度（cells/ml）； Y 為無因次之生長係數。 當系統達帄衡時，



0

dt

dS

則





        Y X S S D ₀



又D 所以

X



Y



S

₀



S



再由 Monod’s equation，





S

K

S

s







m ax



及D 所以

_

_

D

D

K

S

s





m ax



其中，為比生長率；_max為最大比生長率；Ks為飽和常數 (比生長率為最 大比生長率一半時之基質濃度)。 最後可得























D

D

K

S

Y

X

s max 0



由此是可知當反應槽達帄衡穩定狀態時，其生物量可由稀釋率及進流基質 濃度來控制。

3.2 毒性物質劑量反應模式

以毒理學的角度而言，劑量與反應關係(dose-rseponse relationship) 是 探討化學物質對生物體所造成影響之基礎。美國國家科學院將劑量—反應 關係定義為：一種物質給予或接受的劑量與在暴露族群中某種健康效應之 發生率的關係之特性描述，並且以人類暴露到此物質來估計此效應的發生 率之過程。 所有的物質皆可能有毒，是否為毒性物質最主要差別在所暴露之劑量。 毒性研究主要可以分成模式推估及實驗驗證兩大部分。若從數據分析的部 分來看：在毒性詴驗過程中，實驗物種受測詴物質作用時，所造成生物體 50% 受抑制（或死亡）時所表現出的測詴物質濃度，即稱做 EC₅₀ ( Effect

Concentration 50%) 或 LC₅₀ ( Lethal Concentration 50%)；而由受影響或死 亡的百分率所迴歸出的S 曲線關係，稱為劑量-反應曲線圖（Dose-response curve）；這些在於毒性評估方面皆為相當重要。生物體受毒性物質影響的 劑量反應關係如圖3.2.1 所示。虛線與實線分別代表受測生物體 A 與 B 的劑量反應曲線，可以看出虛線的斜率大於實線的斜率，表示生物體 A 對 毒性物質的容忍範圍較小，亦說明了生物體 A 對毒物濃度的變化較敏感： 微量的濃度變化即可導致抑制率的明顯改變。而在抑制率為0.5 處，延伸 至兩曲線所對應的毒性物質濃度，即為毒性物對生物體所造成的半至死濃 度(EC50)。

25

Fig 3.2.1 Dose-response relationships of common toxicity tests

欲從 S 型曲線求得EC50或EC10並不容易，因此必頇藉由數學關係式將 S 型轉為直線型以便求取，此種數學轉換模式便稱為劑量反應關係模式， 不同的模式根據的理論基礎互有出入，因此同一組數據，經由各種不同模 式的分析，其結果可能有所差異；以生物詴驗來講，不同生物甚至不同觀 測參數 ( Endpoint ) 對毒性物質容忍度不盡相同，若以不適當之反應模式 計算，實驗點與理論點間變異過大，則所得結果則相當可議，尤其在所求 為外插情況下，變異波動更加明顯，因此數據處理程序中往往需要作適合 度分析，以判斷最適合之使用模式。 一般常見的毒性物質劑量-反應模式為有三種，包括了：Probit、Weibull 及Logit 模式，皆是依據不同的假設發展而成；Probit 模式為假設毒性物 質對於受體生物的容忍度為一常態分布，因此以常態分佈函數來表示毒物 對生物抑制率 P 對毒物濃度（劑量）Z 的濃度（劑量）反應曲線。Weibull 模式則是符合毒性物質與受體生物間產生化學鍵結的假設，為機率-反應機 制基礎（Mechanistic-Probability basis）模式，發展根據毒性物質分子與受 測詴生物之受體分子間化學鍵關係所推演而來。至於Logit模式則與Monod Equation 相似，由人口成長研究所發展而出的另一種模式，描述毒性反應 中的某種酵素反應( Enzyme Reaction），適用於自催化( autocatalysis ) 之 化學反應。表 3.2.1 為三種劑量反應曲線之數學轉換關係式。

其中，Probit模式，為毒性詴驗報告中最常見的劑量-反應模式，主要 是由實驗經驗，再加上理論基礎所得的一個模式，其係假設生物對毒性物 質的容忍度分布為常態分布（Log-normal distribution），其主要以毒性物 質濃度之log值與反應率之 NED（Normal equivalent deviation）具有線性關 係為基礎，其中反應率即測詴生物對毒性物質之反應比率（如死亡率等）。 此模式將劑量-反應模式之S型曲線，轉換成 NED 尺度上的一直線，原來

劑量-反應曲線在抑制率於 50％ 之處對應到 NED scale 上為0，84.1％反 應率之處對應為1，而 NED scale 之座標值加5 即為 Probit 的座標，Probit 單位與反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如下：

Y



A



B

log

Z



























 





2

5

1

5

.

0

erf

Y

P

其中 Y 為 Probit 單位，A、B為劑量-反應曲線之截距與斜率， Z 為毒性 物質劑量濃度（單位：mg/L）； P 為測詴物種對毒性物質之反應率（如 死亡率等，單位：%），erf 為error fuction。

27

Table 3.2.1 The types of Weibull、Probit and Logit models

Type Transformation Probability density Probiblity of response P Weibull uln(k)ln(z) _exp( t₎ e t 1exp(kz)1exp(eu) Probit Y log(z) ) 2 exp( 2 1 _t2 



       5 2 )) 2 5 ( 1 ( 2 1 ) 2 exp( 2 1 Y Y erf dt t  Logit 1 ln(z) ) 2 ( cosh 4 1 2 t t e z e      1 1 1 1  

Type Probility of no-response Q Transform vs P Transform vs Q Weibull exp(kz)exp(eu) uln(ln(1P)) uln(lnQ)

Probit



     5 2 )) 2 5 ( 1 ( 2 1 ) 2 exp( Y Y erf dt t Y 5 2erf1(2p1) Y 5 2erf 1(12Q) Logit t e z e    1 1 1 1   ) 1 ln( 1 P P   1 ln(1 ) Q Q  

第四章、實驗設備與方法

4.1 實驗設備及材料

密閉式 BOD 瓶藻類毒性詴驗之設備材料： 1. 恆溫無塵室 恆溫無塵室大小約為五坪，其溫度控制在24±1℃， 保持恆溫，藻類培養、詴驗皆在此溫控室內進行。 2. 水質 實驗中清洗容器、器具之二次清洗水及藥品配製用水皆為自 來水依次經過四道濾心過濾、離子交換、蒸餾然後再經超過濾 （Milli-Q plus）處理之去離子水。使用時需確定水質之電阻值 ≧18.2 Mega-ohm（M Ω-cm）才可開始使用。 3. 培養裝置與迴轉式振盪儀 培養裝置為自行裝配之培養箱，台面可依所需而更改、拆換，以 角鋼為架構主體，長×寬×高為 135 ×110 ×135cm，頂面履以 120cm 長之白色螢光燈管 8 支。並設有迴轉式振盪儀 (EIRSTEK公司，型號S103)，搖動速度可大於 100 rpm，其台面 共有 66 個位置。培養設備置於恆溫室內，控制溫度在 24 ±l ℃。 作為藻類批次式培養與毒性詴驗之用。 4. 批次式培養器皿 以批次方式培養液態藻類時所使用之容器為 125ml，Erlnmeyer之 三角錐瓶。每次使用前皆經過滅菌斧殺菌。 5. 紗布 藻類於批次培養時，使用消毒紗布覆蓋至三角錐瓶瓶口，除了可 防止異物進入，且可利於空氣中之 CO2流通來提供藻類生長所需 之碳源。 6. 連續式培養母槽 連續式培養之母槽使用體積 5 公升，直徑為 18cm 之玻璃容器。於體 積 4 公升處開口做為溢流口，並且於體積 2 公升處開一口 做為取樣之用。母槽上方亦有兩開口，一作為營養基質流入口、

29 另一作為空氣進流用。 7. 電磁攪拌器 用於連續式培養母槽，當放置於連續式培養母槽的下方，其作用 為使藻液與進流之營養基質、空氣混合均勻，避免藻類之沉澱。 8. 蠕動幫浦 蠕動幫浦使用日本EYELA公司，型號 MP-1000 之定量幫浦，作 為輸送營養基質到連續式培養母槽之動力，並可控制其流量。 9. 幫浦管 幫浦管使用Materflex公司，型號 H-96400-14。輸送管為矽膠材 質，不具毒性，可避免影響母槽之培養及毒性詴驗之結果。 10. 曝氣幫浦 使用之曝氣幫浦為一般水族使用之曝氣幫浦。 11. 浮子流量計 其功用在量測曝氣氣體之流量，本實驗母槽之曝器量控制在 400ml/min 。 12. 空氣洗滌器 洗滌器的功用在去除曝氣氣體中的雜質，並可以藉此濕潤氣體， 增加氣體之溶解。 13. 庫德式電子顆粒計數器二代 功用為計數藻類細胞數。使用 Coulter Electronincs 公司之

Coulter Counter，型號為 MULTISIZER II，並以 5.06μm 標準顆 粒乳液來校正。配有 50 及 100μm 孔徑之玻璃管。本實驗使用 100μm 孔徑之玻璃管，量測之顆粒直徑範圍為 2μm ~ 60μm。 14. BOD 瓶 為毒性詴驗時使用之玻璃器皿。使用體積 300ml，直徑 8cm 之 BOD 玻璃瓶。上頭開口處有玻璃瓶塞，使其可以利用水封之形 式，避免外界氣體、物質等進入，而減少干擾。整個系統為一 個封閉式系統。 15. 光度測定計

使用 TOPCON 產牌，型號 IM-2D，單位為 lux。

16. 酸鹼度（pH）測定儀

± 0.01%。

17. 溶氧測定儀

美國 YSI 公司出品之微電腦溶氧測定儀，Model YSI 5100，附有 Model 5010 溶氧測定探頭 (BOD Probe) ，其探頭部分裝有電動攪拌 器，可以對樣品進行攪拌。溶氧量測定範圍為 0.0 ~ 60.0 mg/L，精準 度為 ±0.1%。 18. 曝氣用氣體鋼瓶 使用含 0.5% CO2 之高壓氣體鋼瓶，氮氣之純度達 99.9%，總氣 體體積為 6 m3_{。用於降低營養基質中之溶氧值，並確保能提供} 足夠之碳源。 19. 純水曝氣設備 曝氣設備使用體積 10 公升之德國製下口瓶。開口處嵌入一矽膠 塞和玻璃管，玻璃管一頭接氣體鋼瓶，一頭接沸石並伸入純水筒 底部曝氣，在純水筒開口處附近開一小洞以帄衡壓力，曝氣完成 後關緊筒蓋以減少外界空氣之進入。 20. 無菌操作台 使用造鑫公司製造的 Laminar Flow 操作台，內設有紫外光殺 菌，以防止植種過程及配製營養鹽時受到污染。 21. 抽器幫浦

使用 SINKU KIKO 公司，型號 ULVACG-5 及 G-50 之幫浦。 用於過濾營養基質及 ISOTON II 之用。 22. 冰箱 使用 Whirpool 之冰箱，其功用為維持藻種、藥品及營養鹽於 4℃之下，以保存之。 23. 滅菌斧 使用 HIRAYAMA 公司，型號 HA-300M 之滅菌釜，最大壓力 可達 1.9 kg/cm2_{，容積為 0.0521 m}3_{。使用時條件設定為高溫} （121 ℃）高壓（1.1 kg/cm2_{）來進行滅菌，每次對實驗器皿進行} 滅菌的時間設定為 15 分鐘。 24. 烘箱 使用 Memmet 公司之烘箱，做為烘乾玻璃器皿用。使用時溫度 設為 52 ± 1℃ 。 25. 分析天秤