緒論

或 cytokines 的刺激，進行趨化作用 (chemotaxis) 到達患部。趨化作用的過程 裡，血液循環中的嗜中性白血球先向血管壁靠近，沿著內皮細胞滾動 (rolling)，

透過 selectin 與內皮細胞連接，進而附著 (adhesion) 在內皮細胞上，再由內皮 細胞間隙滲出 (transmigration) 離開血管向著患部移動 (migration) (圖1-1)。隨 後，嗜中性白血球對病原菌進行吞噬作用 (phagocytosis)，形成 phagosome，同

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cathepsin G、protease 3、azurocidin、myeloperoxidase 等；次級顆粒 (secondary /specific granules) 中的 lactoferrin、lipocalin、lysozyme、LL37、MMP8、MMP9 和 MMP25；三級顆粒 (tertiary/gelatinase granules) 中的 lysozyme、gelatinase、

acetyltransferase等 (Nathan, 2006)。Chediak-Higashi syndrome 和 specific granule deficiency 為兩種罕見的遺傳疾病，因缺乏非氧化性機制造成白血球功能的異 常，導致病患容易造成較嚴重的感染。第二種殺菌作用，為氧化性機制是嗜中性 白血球活化膜上的 NADPH oxidase，此過程迅速消耗大量的氧分子還原成超氧 自由基 (superoxide anion)，稱為呼吸爆發作用 (respiratory burst)。超氧自由基會 代謝成H₂O₂、HO^.和HOCl等產物，合稱為活性氧物質 (reactive oxygen species, ROS)。ROS會和細胞內的核酸、蛋白質、脂肪和醣類等作用，造成結構和生理 功能的改變。慢性肉芽腫病 (chronic granulomatous disease, CGD)是一種CYBB基 因突變因，NADPH oxidase異常無法正常生成超氧自由基，導致病患容易造成較 嚴重的感染。約70％患者為 gp91^phox缺陷 ，25％是 p47^phox的缺陷。但是NADPH oxidase過度活化也會造成正常組織器官的損傷，如動脈粥狀硬化 (atherosclerosis) 好發於慢性發炎反應。類風濕性關節炎 (rheumatoid arthritis)在關節部分發現大 量嗜中性白血球和巨噬細胞的聚集，因NADPH oxidase過度活化造成關節傷害 (El-Benna et al., 2009)。

NADPH oxidase

NADPH oxidase 為蛋白質複合物，包括在細胞膜上的cytochrome b₅₅₈ (由 gp91^phox/NOX2 及 p22^phox組成) 和存在細胞質中的 p47^phox、p67^phox、p40^phox 和 small G protein Rac (Babior et al., 2002)。在細胞進行吞噬作用的同時也活化了 NADPH oxidase，使細胞質中的 p47^phox、 p67^phox、 p40^phox 及 Rac 轉移到膜上，

與 cytochrome b₅₅₈ 結合形成完整具酵素活性的 NADPH oxidase。經由 NADPH

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oxidase 的穿膜電子傳遞鏈 (transmembrane electron transport chain) (NADPH → FAD → 2 heme → O2)，由 NADPH 提供電子來開啟反應，最後將氧分子還 原成超氧自由基 (NADPH + 2O₂ → NADP⁺ +2O₂^.- + H⁺) (圖1-2) (Takeya and Sumimoto, 2003)。

NADPH oxidase 催化作用的核心是醣蛋白 gp91^phox，存在嗜中性白血球細胞 膜和分泌顆粒的膜上。gp91^phox 的 N-terminal 有六個穿膜的 α-helices，且第三 homology 3 (SH3) domains 結合。另外，p22^phox 的 PRR 有一段 polyproline II (PPII) helix，其氨基酸序列上的 Pro152、Pro156 和 Arg158 與 p47^phox 的結合 有很重要的關係（Nobuhisa et al., 2006）。而在 cell-free system 中， p22^phox 可 經由 phosphatidic acid (PA) 依存性的方式進行磷酸化，進而活化 NADPH oxidase (Regier et al., 1999)。

p47^phox 或稱neutrophil cytosolic factor 1 (NCF1)由 390 個氨基酸構成，其結 構上包含有 N-terminal 的 phox homology (PX) domain、兩個 SH3 domains、

autoinhibitory region (AIR) 和 C-terminal 的 PRR。p47^phox 在非活化狀態下，經 由 AIR 將兩個 SH3 domain 的活性部位遮蔽起來；而 SH3 domain 將 PX domain 活性部位遮蔽起來 (Hiroaki et al., 2001)。當細胞受到刺激時，AIR 可經 由多處 Ser 的磷酸化 (S303、S304、S359、S370)改變了 p47^phox 的構形，使 SH3 domain 暴露出來與膜上 p22^phox 的 PRR 結合 (El Benna et al., 1994; Inanami et al., 1998; Johnson et al., 1998)；而 p47^phox 的 PRR 則與 p67^phox 的 SH3 domain

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結合 (Sumimoto et al., 2005)。另外，在 AIR磷酸化的同時，低濃度的 AA (1-5 μM) 可以幫忙 p47^phox 將 PX domain 暴露出來，具有更好的活性。在 cell-free system 或完整的細胞中，高濃度的 AA (50-100 μM) 可直接使 p47^phox 與 p22^phox 完整 地結合進而活化 NADPH oxidase (Shiose et al., 2000)。PX domain 可與位在膜上 的 phosphoinositides (PI(3,4)P₂)或 phospholipids（PA、phosphatidylserine (PS)）

結 合 (Karathanassis et al., 2002; Stahelin et al., 2003) 。 另 外 ， 在 formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) 或 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)刺激下，許多蛋白質激酶(protein kinase)會對p47^phox磷酸化，包括p38 Mitogen-activated protein kinase (MAPK)和extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)，還有protein kinase B (PKB/Akt)、protein kinase C (PKC)、p21-activated kinase (PAK)等都會增強NADPH oxidase的活性 (El-Benna et al., 2009)。相反的，

protein kinase A (PKA)和casein kinase II 對p47^phox磷酸化則有可能造成其活性下 降 (Bengis-Garber et al., 1996; Park et al., 2001)。

p67^phox (NOX activator)由 526 個氨基酸構成，其結構上的 N-terminal 具有

四個 tetratricopeptide repeat (TPR) motifs，而 C-terminal 有兩個 SH3 domains 和介於 SH3 domain 間的 Phox and Bem1 (PB1) domain。TPR motifs 可與 Rac

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p67^phox 在膜上的結合（Kuribayashi et al., 2002）。p40^phox 的 PX domain 可與膜 上的 PI(3)P 結合，因此 p67^phox 便能藉此與細胞膜連接 (Ellson et al., 2001)。但 目前對 p40^phox 功能的了解仍然有限。有些學者認為 p40^phox 會活化 NADPH oxidase，但也有些學者認為 p40^phox 會抑制 NADPH oxidase (Sathyamoorthy et al., 1997)。

Rac (21 kDa) 是 Rho-family small GTPase 的成員，包含三種 isoforms

（Rac1、Rac2和Rac3）。Rac2 主要表現在在嗜中性白血球，而 Rac1 主要表現 在巨噬細胞。Rac2 在活化的過程中為獨立的，並不受 p47^phox 或 p67^phox 的影 響，並將 C-terminal的 Cys189 上 geranylgeranylation 以便與細胞膜結合。未活 化態的 Rac-GDP 存在細胞質中，且與 guanine nucleotide dissociation inhibitors (GDIs) 結合，抑制 GDP 和 GTP 的交換。當細胞受刺激活化時，Rac-GDP 與 GDI 分開，並在 P-Rex1 (185 kDa) 的調節下， GDP 交換 GTP 而成活化態，

並轉移到膜上與 cytochrome b₅₅₈ 和 p67^phox 的 TPR 結合，最後活化 NADPH oxidase (Chuang et al., 1993；Bokoch, 1994；Koga et al., 1999；Sarfstein et al., 2004) 。 而 P-Rex1 為 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) ， 可 受 到 phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP3) 和 Gβγ subunits 的調節。

NADPH oxidae活化的細胞訊息傳遞路徑

已知formylpeptide receptors (FPR)接受刺激後，會經由 phosphoinositide 3-kinase (PI3K)和 phospholipase C (PLC)、PAK、PKC、Rac和MAPK (Montserrat et al., 1992; Stoyanov et al., 1995)訊息傳遞途徑來活化NADPH oxidae (圖1-4)。

FPR

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FPR為 G protein-coupled receptor (GPCR) 與 chemoattractant 結合，會使其 構形發生變化，並可促使 Giα 的 GTP 與 GDP 交換，造成 Gβγ subunits 與 G_iαsubunit 分離。當 G_iα-GTP 的 GTP 被水解為 GDP，可和 G_βγ subunit 再結 合回到不活化態 (Simon et al., 1991)。表現在人類嗜中性白血球的有 FPR 和 FPRL1 (FPR-like 1)兩種，且 FPR 對 fMLP的親合度較佳。fMLP 刺激細胞所產 生的生物功能，包括趨化作用、去顆粒作用和超氧自由基生成。

PI3K

PI3K 為一種 lipid kinase 主要對phosphoinositide 結構上inositol的3'-OH進行 磷酸化。依受質的不同可分三類：class I (IA、IB)、II 和 III。PI3K 都具有 C2 domain 和 catalytic domain ，且都經由 helical domain (PIK domain) 連接。Class I 可作用 於 phosphatidylinositol (PI) 、 phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) 和 phosphatidylinositol 4,5- bisphosphate (PI(4,5)P2)；class II 可作用於 PI 和 PI(4)P；

class III 可作用於PI (Koyasu, 2003) 。

Class IA PI3K由adaptor subunit 和catalytic subunit 複合體形成的heterodimer。其 中catalytic subunit 有 p110α、β 和δ 三種。p110α 和β 分佈較廣，而 p110δ 主 要表現在白血球。而adaptor subunit 有 p85α、p85β、p55α、p55γ 和 p50α 五種。

其中 p85α 、p85β 皆具有二個 SH2 domain 可與 p110 的N-terminal region 連接，

以維持 p110 的穩定(圖1-5)。SH2 domain 可與phospho-tyrosine結合，在tyrosine kinase 活化時可促進 p110 聚集到膜上，造成 p110 的活化 (Wymann and Pirola, 1998)。Class IB PI3K只有一種，由 p110γ catalytic subunit 和p101 adaptor subunit 形 成heterodimer。Class IB 只存在哺乳動物，主要表現在白血球中。Class IB 主要受到 GPCR 所調節，Gβγ 作用到 p101 並活化 p110γ (Furman et al., 1998; Vanhaesebroek and Waterfield, 1999) 。Class IA 或 IB 皆具有 Ras-binding domain ，因此活化態的

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Ras-GTP 也會活化 Class IA 或 IB (圖1-5)。Class II 及 class III 的活化機轉尚未完 全釐清 (Koyasu, 2003)。

活 化 PI3K 生 成 的 PI(3,4)P2 或 PI(3,4,5)P3 ， 會 誘 使 下 游 蛋 白 激 酶 phosphoinositide-dependent kinase (PDK) 和 Akt利用其結構上的PH domain 與之 結 合 ， 由 細 胞 質 中 轉 移 至 細 胞 膜 上 ， 方 便 PDK 對 Akt 的 磷 酸 化 作 用 (Vanhaesebroeck and Alessi, 2000；Koyasu, 2003) (圖1-7)。此外，G_βγ亦可經由促進 Shc adaptor protein 的活化及與growth-factor-receptor-bound protein 3 (Grb3)、Sos 形成複合物去活化Ras，進而活化p85 (Koyasu, 2003; Wymann, 2003)。PI(3,4,5)P₃和 PI(3,4)P₂，也可分別與p40^phox和p47^phox的PX domain結合 (Kanai et al., 2001)。 PI3K 與Akt 可藉由影響actin polymerization調控嗜中性白血球的趨化作用(Inoue and Meyer, 2008)。

PDK (63 kD) 為 serine/threonine kinase，有 PDK1 和 PDK2 兩種。PDK1 在 結構上 N-terminal 有 catalytic domain，C-terminal 有 PH domain ，可對 Akt1的 Thr308磷酸化並活化Akt1 (Alessi et al., 1997)。有研究指出，人類的PDK1在Ser241 的磷酸化會促進其活性 (Casamayor et al., 1999)。

Akt (57-60 kDa) 亦為 serine/threonine kinase。Akt 參與細胞生長、存活和轉 錄因子調控。Akt 有三種 isoforms 即 PKBα/Akt1 、PKBβ/Akt2 和 PKBγ/Akt3 (圖 1-6)。Akt的 N-terminal 有 PH domain，中間為 kinase domain (又稱 activation loop)， C-terminal 則是 regulatory domain (又稱 hydrophobic motif, HM)。Akt1的 活化，包含由PDK1對kinase domain上的Thr308進行磷酸化，而PDK2則會對HM 上 的Ser473進行磷酸化 (Toker and Newton, 2000)。至於PDK2為何，至今仍眾說紛紜。

有 文 獻 指 出 ， 嗜 中 性 白 血 球 的PDK2 可 能 是 MAPK-activated protein kinase-2 (MAPKAPK2或MK2)。另外，有學者提出三種方式會對 Ser473磷酸化：(1) PDK1 (2) PDK2 (3) Akt 自體磷酸化 (Rane et al., 2001)。且 Akt可直接磷酸化 p47^phox 而參與 NADPH oxidase 的活化 (Chen et al., 2003) 。

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PAK

PAK為serine/threonine kinase，根據蛋白結構與活性調節方式可分為二個族 群：第一類包括PAK1、PAK2和PAK3，而第二類為PAK4、PAK5和PAK6 (圖1-8)。

第一類 PAK的N-terminal 有p21-binidng domain (PBD) (又稱Cdc42/Rac-interactin binding domain 或CRIB) 和autoinhibitory domain (AID)為重疊部分，PBD可與活 化態的Rac和Cdc42 GTPase結合 (Manser et al., 1995；Knaus et al., 1998；Mira et al., 2000；Jaffer and Chernoff, 2002)。第一類 PAK的N端含有2個 SH3-binding motif 和1個非典型的 SH3-binding site，此2個 SH3-binding site 可與 Nck 和 Grb2 結合，非典型 SH3-binding site 則可與 Pak-interacting exchange factor (PIX) 結 合 (Bokoch et al., 1996; Manser et al., 1998; Puto et al., 2003)。第一類 PAK的 C-terminal有 catalytic domain可對下游 p47^phox、p67 ^phox蛋白分子進行磷酸化作用 (Ahmed et al, 1998; Martyn et al., 2005)。第二類 PAK 則缺乏N-terminal的 AID和 SH3-binding site，所以其活性調控的方式與第一類 PAK不相同。第二類 PAK可 與Cdc42結合，但是不與Rac結合，且與GTPase結合後並不會増加其活性 (Abo et al., 1998; Cotteret and Chernoff, 2006)。第一類的PAK對於嗜中性白血球超氧自由 基生成、趨化作用以及吞噬作用有關(Bokoch, 2003；Martyn et al., 2005)。

不活化狀態的PAK以dimer的形態存在於細胞質中。PAK的活化過程 (圖 1-9)，當small GTPase 與 PBD結合後，PAK構形受改變，使其AID與catalytic domain分開，促使activation loop 的autophosphorylation，進而增加 PAK 的活性 (Zenke et al., 1999; Lei et al., 2000)。第一類 PAK 的 activation loop 中，在Thr423 的磷酸化對於PAK的活化極為重要 (Gatti et al., 1999)。另外，Ser144、Ser199 和 Ser204的磷酸化亦可促進PAK的活性 (Gatti et al., 1999; Chong et al., 2001)。Rac 可藉由PAK影響p47^phox 磷酸化作用 (Knaus et al., 1995)。此外，PAK可經由促進

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其下游蛋白的磷酸化，例如 myosin light chain kinase、LIM kinase，進而影響細 胞的趨化作用 (Daniels and Bokoch, 1999; Bokoch, 2003)。

PKC

PKC為serine/threonine kinase，屬於 AGC kinase family當中一員到目前共發 現 11 種 異 構 物 。 PKC 結 構 的 N-terminal 是 regulatory region ( 含 有 pseudosubstrate、C1與C2 domain)，C-terminal為catalytic region (含有C3 與 C4 domain)，兩者間經由一個hinge bond 連接。其中，pseudosubstrate 序列有 autoinhibition的作用，C1 domain 為DAG 和 PMA的結合位置 (Bell and Burns, 1991)；C2 domain 為鈣離子和 PS 的結合位置 (Igarashi et al., 1995)；C3 domain 為 ATP 結合的位置；C4 domain 為與受質結合的位置 (Silinsky and Searl, 2003)。依 regulatory region結構上的不同可將PKC分為classical PKC (cPKC) 、 novel PKC (nPKC)和atypical PKC (aPKC) 三個族群。cPKC包括PKC-α、-βI、-βII 和 -γ，於 regulatory region具 pseudosubstrate、C1和C2 domain，需要PS、DAG 和 鈣離子的存在下才可以活化。nPKC包括 PKC-δ、-ε、-η 和-θ，在regulatory region 具有 pseudosubstrate和C1 domain，需要PS、DAG，但不需要鈣離子即可活化。

aPKC包括 PKC-ζ、-τ 和-ι/λ，其regulatory region 只有 pseudosubstrate domain、

nuclear localization signals 和 nuclear export signals， 因 此 不 需 要 鈣 離 子 和 DAG，但可受到磷脂類 (PS、PA 和 ceramides) 或轉移到細胞核受刺激而活化 (Newton, 2003)。

PKC 成熟至活化的過程：(1) 首先經轉譯作用剛合成尚未磷酸化且未成熟 (immature)的 PKC先停留在細胞質中；(2) PDK1 可使位於PKC catalytic region的 Thr500磷酸化；(3) PKC 進行 autophosphorylation 將本身C-terminal的Thr641 和 Ser660磷酸化，導致構形改變，此時為安定且成熟 (mature) 的 PKC而存在於細

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胞 質 中 (Bornancin and Parker, 1997; Edward et al., 1999) 。 此 構 形 變 化 使 N-terminal的pseudosubstrate 序列和 Thr500結合並將C 端的catalytic region遮 蔽，因而抑制 PKC 的活性 (Gao et al., 2001)；(4)當訊息刺激細胞時，細胞膜上 et al., 1993；Kent et al., 1996)。而大鼠的嗜中性白球中具有 PKC-α、-β、-δ、-ε、

-θ、-μ、-ι/λ 和 -ζ，且 PKCλ 和 PKCζ 含量很少 (Tsao and Wang, 1997)。

PKC-α、-βI、-βII、-δ 和 -ζ 皆與呼吸爆發有關。在嗜中性白血球細胞中，cPKC、

PKCδ 和 PKCζ 會對 p47^phox 進行磷酸化 (El-Benna et al., 1996；Dang et al., 2001；Yamamori et al., 2004) 增加 NADPH oxidase 的活性 (Regier et al., 1999;

Fontayne et al., 2002)。

MAPK

MAPK 為 Ser/Thr kinase。MAPK 可依其訊息傳遞路徑之不同而分成幾類：

p38 MAPK (p38α/β/γ/δ 四種 isoforms)、ERK (ERK1/2 二種 isoforms)、c-Jun NH₂-terminal kinase (JNK) (JNK1/2/3 三種 isoforms)、ERK3、ERK4 及 ERK5 (Johnson and Lapadat, 2002)。其中，以 p38 MAPK、ERK1/2 與 JNK 活化的機 轉研究最清楚 (Roux and Blenis, 2004)。嗜中性白血球表現有 ERK1/2 (Torres et al., 1993)，而 p38 MAPK 以 α 與 δ 兩種 isoforms 為主，β 與 γ 含量極少 (Hale et al., 1999)。

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MAPK 活化的過程，主要是一連串的 kinase cascade，即 MAPK kinase kinase (MKKK/MEKK)、MAPK kinase (MKK/MEK) 及 MAPK 三個階段 (Kyriakis and Avruch, 2002) (圖 1-10)。當細胞受到刺激，經由 small G protein 活化 MKKK，

然後對 MKK 進行磷酸化作用。活化的 MKK 會對下游的 MAPK 結構上的 T-X-Y Y domain 形成一個 catalytic domain、PH domain、EF-hand domain 及 C2 domain (Katan, 1998)。因具有 EF-hand 與 C2 domain，所以需要鈣離子才可以活化 PLC

然後對 MKK 進行磷酸化作用。活化的 MKK 會對下游的 MAPK 結構上的 T-X-Y Y domain 形成一個 catalytic domain、PH domain、EF-hand domain 及 C2 domain (Katan, 1998)。因具有 EF-hand 與 C2 domain，所以需要鈣離子才可以活化 PLC