纖維素水解酵素 纖維素水解酵素
纖維素水解酵素之 之 之 之分離與純化 分離與純化 分離與純化 分離與純化
1.分離純化商業化水解酵素分離純化商業化水解酵素分離純化商業化水解酵素分離純化商業化水解酵素：：：：
下表中 Fraction 1-5 的蛋白質(Novozyme 188)已經利用不同條件的 Q-column 純化出，根據受質專一性測試 這些蛋白均有 exoglucanase 及 beta-glucosidase 的酵素活性。
各酵素之純化結果如下列各圖所示：
Ion-exchange chromatography with Q column
利用離子交換層析在不同鹽梯度沖 堤下，可得到兩個純的蛋白質，分別 命名為 fraction 1 及 fraction 2
1
2
Ion-exchange chromatography with Q column
同樣利用離子交換層析，改變鹽 梯度，可得到另一純的蛋白質，
將它命名為 fraction 3
3
4
5
利用離子交換層析，改變鹽 梯度，可得到另一純的蛋白 質 fraction 4
利用離子交換層析，改變 鹽梯度，可得到另一純的 蛋白質 fraction 5
2. 纖維水解酵素的純化與活性測試:
(a) 利用 Q-sepharose 以不同的鹽(NaCl)梯度純化出一個主要的蛋白 (p1)
在 200 mM 和 250 mM NaCl 鹽濃度可以得到一個主要的蛋白質‚收集較 純的 fractions 和濃縮後‚可看到分子量大約 65kD 的蛋白‚如下圖:
“p 1”
pro tei n:
“C
”為 初始
樣品、”1””2”分別為 buffer+200mM 與 250mM NaCl 沖提收集的 SDS PAGE。
純化到的單一蛋白將進行活性測試。
(b) 收取(a)的 flowthrough‚利用 FPLC 做 Heparin sepharose 管柱層 析:
p2
protein p3 protein
出現 peaks 的 fractions 跑 SDS PAGE:
可以看到有兩個較純的蛋白 p2 與 p3 蛋白‚未來將測定其活性與大量純 化以利養晶。
(c)收取(b)的 flowthrough,利用 FPLC 作 DEAE sepharose 管柱層析:
p4 protein
p5 protein
p6 protein
出現 peaks 的 fractions 跑 SDS PAGE:
p4 與 p5 蛋白將利用其他性質的管柱層析(ex: phenyl sepharose)進一 步純化‚p6 蛋白將大量純化並測定其活性。
2. (A) p1 蛋白的活性測試:
(a)利用 2% carboxymethylcellulose(CMC)為受質去測量此 p1 蛋白是 否有內切酶酵素活性‚活性測試方法如下:
利 用 di ni tr os al ic yl ic ac id (DNS)可與還原糖反應在 540nm 有吸收質測得 cellulase 活性‚吸收 質 data 如下:
CMC 活性測試結果得知‚p1 蛋白具有內切酶活性
(b)利用 cotton 為受質去測量此 p1 蛋白是否有外切酶酵素活性‚活性 測試方法同(a):
Cotton 活性測試結果得知‚p1 蛋白具有外切酶活性
(c) 利 用 cel lob ios e 為 受 質 去 測 量 此 p1 蛋白是否有可水解纖維雙糖的酵素活性‚活性測試方法同(a):
受質
cellobiose 加入 en1 酵素反應後所測得的吸收質與受質位加入 p1 酵素 的吸收質無差異‚故 en1 蛋白無水解纖維雙糖的活性
(B) p3 蛋 白 的 活 性 測試:
(a)利用 2%
carboxymethylcellulose(CMC)為受質去測量此 p3 蛋白是否有內切酶 酵素活性:
CMC 活性測試結果得知‚p3 蛋白具有內切酶活性
(b)利用 cotton 為受質去測量此 p3 蛋白是否有外切酶酵素活性‚活性 測試方法同(a):
Substrate : CMC 1.200 ul Tris buffer
2.100 ul buffer + 100 ul substrate 3.100 ul buffer + 100 ul protein 4.100 ul substrate + 100 ul protein
Cotton 活性測試結果得知, p3 蛋白具有外切酶活性
(c) 利用雙糖 cellobiose 為受質去測量此 p3 蛋白是否有可水解纖維 雙糖的酵素活性‚活性測試方法同(a):
受質 cellobiose 加入 p3 酵素反應後所測得的吸收質與受質加入 p3 酵 素的吸收質無差異‚故 p3 蛋白無水解纖維雙糖的活性
** 在此,我們成功的從 Novazyme crude enzyme 分離出 p1 與 p3 protein, 並已大量純化,得到 約 15mg, 20 mg 的蛋白,濃縮至 12mg/ml(p1), 22mg/ml(p3)各 1ml 左右,目前已塞選各種條件培養蛋白 質晶體中.
Substrate : cotton 1.200 ul Tris buffer
2.100 ul buffer + 1 mg substrate 3. 1 mg substrate + 100 ul protein
Substrate : cellobios 1.200 ul Tris buffer
2.100 ul buffer + 100 ul substrate 3.100 ul substrate + 100 ul protein
3.增加 Novazyme cellulose mix crude protein 中 p3 protein 的濃 度, 希望增加水解 cellulose 的速度:
(a) 先 利 用 BCA 定 量 Novazyme cellulose mix crude protein and p3 protein 的蛋白濃度, 之後將兩種樣品都 調成 2 mg/ml 的蛋白濃度.
(b) 以 Whatman filter paper 作為 substrate,固定 mix 的蛋白量,提高 p3 protein 的濃度, 每 5 分鐘測一次活性, 測量一個小時, 觀察是否有效果.
The protein concentration of “crude protein” and “p3” are all 2 mg/ml.
“S” is substrate (Whatman filter paper, every S weight are the same).
“Buffer” is 20 mM Tris, pH 6.8
cellulase substrate (Whatman filter paper)
Mix well and incubate for 0-60 mins at 50 deg..
Add 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) reagent to stop reaction
Determine reducing sugar as glucose Place tubes in
boiling water for 5 min
此圖我們觀察到,當 mix protein 中增加 p3 protein 濃度時,並不會 200 ul crude protein + S 180ul crude + 20ul p3 + S 160ul crude + 40ul p3 +S 200ul p3 protein + S
0 5 10 20 40 60 time (min) 200 ul crude protein + S 180ul crude + 20ul p3 + S 160ul crude + 40ul p3 +S 200ul p3 protein + S
0 5 10 20 40 60 time (min)
纖維素水解酵素晶體 纖維素水解酵素晶體 纖維素水解酵素晶體
纖維素水解酵素晶體培養培養培養培養：：：：
上述純化後之纖維素水解酵素已進行長晶，結果如下列各圖：
The image of salt crystal.
使用的條件為:0.2 M sodium fluoride, 20% (w/v) PEG3350
The image of salt crystal.
條件的條件為: 0.2 M di-ammouinm hydrogen citrate, 20% (w/v)PEG3350.
The image of salt crystal.
使用的條件為: 0.1 M sodium/potassium phosphate, pH 6.2 , 0.2 M sodium chloride, 20% (w/v) PEG1000.
The image of salt crystal.
使用的條件為: 0.1 M imidazole, pH 8.0, 35% (v/v) 2- ethoxyethanol, 0.05 M calcium acetate hydrate.
The image of salt crystal.
使用的條件為 : 0.1 M HEPES, pH7.3, 0.2 M CaCl2, 5% PEG8000.
The image of protein crystal.
使用的條件為 : 0.1 M sodium acetate trihydrate, 1.0 M sodium formate, pH 4.6.
參考文獻 參考文獻 參考文獻 參考文獻
1. Jarvis, M. (2003). Chemistry—cellulose stacks up. Nature 426:611–612 2. Zhang, Y.-H. P., Lynd, L. R. (2004). Kinetics and Relative Importance
of Phosphorolytic and Hydrolytic Cleavage of Cellodextrins and
Cellobiose in Cell Extracts of Clostridium thermocellum. Appl. Environ.
Microbiol. 70: 1563-1569
3. Mounteer, A. H., R. O. Pereira, et al. (2007). "Advanced oxidation of bleached eucalypt kraft pulp mill effluent." Water Sci Technol 55(6):
109-16
4. Gnansounou, E., A. Dauriat, et al. (2005). "Refining sweet sorghum to ethanol and sugar: economic trade-offs in the context of North China."
Bioresour Technol 96(9): 985-1002
6. Chen, Y., R. R. Sharma-Shivappa, et al. (2007). "Potential of
agricultural residues and hay for bioethanol production." Appl Biochem Biotechnol 142(3): 276-90.
5. Jamai, L., K. Ettayebi, et al. (2007). "Production of ethanol from starch by free and immobilized Candida tropicalis in the presence of
alpha-amylase." Bioresour Technol 98(14): 2765-70
7. Chen, Y., R. R. Sharma-Shivappa, et al. (2007). "Ensiling agricultural residues for bioethanol production." Appl Biochem Biotechnol 143(1):
80-92
8. Börjesson, P. and M. B. (2008). "Biogas as a resource-efficient vehicle fuel." Trends Biotechnol. 26(1): 7-13
9. 詹華景 (2005) 國立東華大學生物技術研究所碩士論文，〝木黴菌 纖維素酶之純化與分析〞
10. Bissett, J. (1991). "A revision of the genus Trichoderma. II.
Infrageneric classification" Can J Bot 69: 2357-2372
11. Gams, W, Bissett, J (1998) "Morphology and identification of
Trichoderma" In: Kubicek, CP, Harman, GE eds. , Trichoderma and Gliocladium, vol 1, Taylor & Francis, London, pp 3-34
12. Lee, S.-C., Guan, H.-H., Wang, C.-H., Huang, W.-N., Chen, C.-J., Wu, W. (2005) Structural basis of venom citrate-dependent heparan sulfate-mediated cell surface retention of cobra cardiotoxin A3, J. Biol.
Chem. 280: 9567-9577.
13. Yang, M.-C., Guan, H.-H., Liu, M.-Y., Lin, Y.-H., Yang, J.-M., Chen, W.-L., Chen, C.-J., Mao, S.J.T. (2007) Crystal structure of a secondary vitamin D3 binding site of milk β-lactoglobulin, Proteins, Nov. 14, Epub ahead of print.
14. Lu, L.-Y., Hsieh, Y.-C., Liu, M.-Y., Lin, Y.-H., Chen, C.-J. Yang, Y.-S.
(2007) Identification and characterization of two amino acids critical for the substrate inhibition of Human dehydroepiandrosterone
dulfotransferase, Mol. Pharmacol. Nov. 27, Epub ahead of print.
15. Saloheimo, M., Nakari-Set¨al¨a, T., et al. (1997). cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast. Eur. J. Biochem. 249:584–591 16. Ward, M., Wu, S., et al. (1993). Cloning, sequence and preliminary
structural analysis of a small high pI endoglucanase (EGIII) from Trichoderma reesei. In: Suominen, P., Reinikainen, T. (Eds.), Proceedings of the Second Tricel Symposium on Trichoderma Cellulases and Other Hydrolases, Espoo, vol. 8, Foundation for
Biotechnical and Industrial Fermentation Research, Helsinki, Finland, pp. 153–158
17. Teeri, T., Lehtovaara, P., et al. (1987). Homologous domains in
Trichoderma reesei cellulolytic enzymes: gene sequence and expression of cellobiohydrolase II. Gene 51: 43–52
18. Yan-Hong, L.I., Rui, G.U.O., et al. (2005), Purification and Characterization of Two Endo-b-1,4-glucanases from Mollusca, Ampullaria crossean. Acta Biochim. Biophys. Sin 37:702-708
19, Bhikhabhai, R., Johansson, G., et al. (1984). Isolation of cellulolytic enzymes from Trichoderma reesei QM 9414. J. Appl. Biochem.
6:336–345
20. Cândida, T., Tomaz, João A., Queiroz, (2004). Fractionation of Trichoderma reesei cellulases by hydrophobic interaction
chromatography on phenyl-Sepharose. Biotechnol. Lett. 26: 223–227.