我們以本土的木黴菌株 T. koningii TK32 中選殖出β-1,4-gluclosidase 類似基因，從
T. reesei
中選殖出 Cellobiohydrolase II 等兩類基因，並經進一步以 DNA 定序確定無誤。我們將應用 InFusion 套組，從
T.
reesei
中選殖出 Cellobiohydrolase I 及 Endo-β-1,4-glucanase 等剩 下的兩類基因。β-1,4-glucosidase 及 Cellobiohydrolase II 等兩類 基因在 pET28a 上的表現質體(pET28/glucosidas 及 pET28/CBH-II)已 建構完成。我們已嘗試將 T. koningii TK32 中選殖出之β-1,4-gluclosidase 在大腸桿菌中表現。我們分別在 37 ºC, 28 ºC 及 22 ºC 等溫度下，以 250 或 500 µg/mL 之 IPTG 刺激下震盪培養 10 小時，然而我們發現 β-glucosidase 可在大腸桿菌中表現，但是卻形成了包涵體(inclusion body)。(1)(1)
(1)(1)、、、、纖維素水解酵素蛋白序列比對纖維素水解酵素蛋白序列比對纖維素水解酵素蛋白序列比對 纖維素水解酵素蛋白序列比對
纖 維 素 水 解 酵 素 基 因 如 ， β-1,4-glucosidase, endo-β-1,4-glucanase [1,2]及 cellobiohydrolase [3]等已在木黴菌 株(
Trichoderma reesei
)中發現並選殖出，因此我們希望利用已知的 基因序列來設計 PCR 引子，希望藉此從本土的木黴菌株（Trichoderma
koningii TK23）中選殖出 endo-β-1,4-glucanase, cellobiohydrolase 及 β-1,4-glucosidase 的類似基因。我 們 首 先 將 在 β-1,4-glucosidase, endo-β-1,4-glucanase 及 cellobiohydrolase
I 在 T. harzianum
,T. koningii, T. reesei
及 T.viride 等菌種中的蛋白質序列加以進行比對，並希望利用比對之結果 來設計 DNA 引子，以用於後續之 PCR 基因放大反應。其結果如圖一至 三所示：
比對的結果顯示 endo-β-1,4-glucanase 在
T. reesei
及T. koningii
中的蛋白質序列有約 96%的相似度。而T. koningii
與T. viride
中 的 endo-β-1,4-glucanase 則在蛋白質序列上只有約 84%的相似度。圖一 圖一圖一
圖一、、、、Endo-β-1,4-glucanase 在T. reesei、T. koningii及 T. viride 等菌 種中的蛋白質序列比對結果。
圖二、Cellobiohydrolase I 在T. harzanumgi、T. koningii及 T. viride 等菌
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表一、Cellobiohydrolase I 蛋白質序列相似度比較表
T. harzianum T. koningii T. viide
T. harzianum
100 81 80T. koningii
100 99T. viide
100比對的結果顯示 Cellobiohydrolase I 在
T. harzianum
及T. koningii
中的蛋白質序列有約 81%的相似度。而T. koningii
與T. viride
中 的 Cellobiohydrolase I 則在蛋白質序列上只有約 99%的相似度(表 一)。比對的結果顯示β-1,4-glucosidase 在
T. reesei
及T. lixii
中的蛋 白質序列有約 87.1%的相似度。目前則尚無T. koningii
之β-1,4-glucosidase 蛋白質序列報導。
(
T. koningii Cellobio-
hydrolase I
T. reesei Forward primer :
5’–GCGGAATTCATGTATCGGAAGTTGGCCG-3’
Reverse primer :
5’–GCGAAGCTTTTACAGGCACTGAGAGTAGTAAGGG-3’
T. koningii Forward primer :
5’–GCGGAATTCATGTATCGGAAGTTGGCCG-3’
Reverse primer :
5’–GCGAAGCTTTTACAGGCACTGAGAGTAGTAAGGG-3’
β-1,4- glucosidase
T. reesei Forward primer :
5’-GCTGAATTCATGTTGCCCAAGGACTTTCAG-3’
Reverse primer :
5’-TATAAGCTTTCACGCCGCCGCAATC-3’
T. koningii Forward primer :
5’-GCTGAATTCATGTTGCCCAAGGACTTTCAG-3’
Reverse primer :
5’-TATAAGCTTTCACGCCGCCGCAATC-3’
在引子的 5’-端各加了一組限制酵素切位，即 EcoR I 切位(Forward primer)和 Hind III 切 位(Reverse primer)
(
cellobiohydrolase I 及及及及 endoglucanaseendoglucanaseendoglucanaseendoglucanase 之之之之 基因基因 β-1,4-gluclosidase 引子經 PCR 放大 反應後各得到一約 1.5 kb 之 DNA 片段 (圖五)，經進一步 DNA 定序後確定其為 β-1,4-gluclosidase 全基因片段。
T. reesei
RNA 以 Cellobiohydrolase I 引子經 PCR 放大反應後得一約 1.7 kb 之 DNA 片段 (圖六)，經 DNA 定序後發 現確為T. reesei
之Cellobiohydrolase I 基因(如圖七所 示)，但發現其 DNA 片段中尚夾有兩小 段之 intron。此一發現證明所設計之引子沒問題，但問題可能是所抽 取之
RNA 中 Cellobiohydrolase I 之 mRNA 含量太少的緣故。
圖四、RNA 瓊酯膠電泳示意
圖六、Cellobiohydrolase II 基因 之 PCR 產物。
圖五、PCR 選殖之β-1,4- glucosidase DNA 片段。
要增加 RNA 中 Cellobiohydrolase I 之 mRNA 含量，可藉由 Trichoderma 培養方法的改良加以改善，如在 RNA 抽取前先將 Trichoderma 培養於 含 2% cellulose 的基本培養基中 48~72 小時中 ，可能 大量引 發 cellulase 相關基因的大量表現。然而經過我們反復測試皆無法有效 的以 PCR 選殖出所需之 Cellobiohydrolase I 基因片段，因此我們推 論 Cellobiohydrolase I 的 mRNA 並不穩定，導致在抽取 RNA 的過程中 便已經破損斷裂，無法反轉錄成完整的 cDNA。而此一現象亦發生於 endoglucanase 基 因 的 選 殖 過 程 中 。 另 一 可 能 的 狀 況 為
圖七、選殖出之T. reesei Cellobiohydrolase I 基因序列
Cellobiohydrolase I 及 endoglucanase 基因在
T. reesei
及T.
koningii
中 RNA 剪接(RNA splicing)作用發生問題。為解決此一問題，我們決定利用分生套組 InFusion 來移除上述的全長 基因中的 introns。
1. 首先將帶有 introns 的全長基因置入一轉移質體中，本研究中採用 pGEMT easy vector (3015 bp)作為轉移質體(圖八)。
2. 接著設計 Exon II(藍色箭號)及 Exon III(粉紅箭號)的引子，同時 所設計 Exon II 的正向引子(forward primer)的 5’-端帶有 Exon I 片段 3’-端 15 個鹼基的序列，而反向引子(reverse primer)的 5’-端帶有 Exon III 片段 3’-端 15 個鹼基的序列。相對的，所 設計 Exon III 的正向引子(forward primer)的 5’-端帶有 Exon II 片段 3’-端 15 個鹼基的序列，而反向引子(reverse primer)的 5’-端帶有 Exon IV 片段 3’-端 15 個鹼基的序列。
圖八、去除全長基因中 introns 的 步驟示意圖。
含 intron 基
3. 以 PCR 放大基因中的 Exon II 及 Exon III。
4. 以核酸外切酵素將 PCR 放大後的基因片段的 3’-端部份序列，使之 產生黏性末端(sticky end)。
5. 將黏合好的質體轉殖入大腸桿菌 DH5D勝任細包中，以挑選帶有質 體的細菌菌落，並進一步抽取質體做 DNA 定序確認無突變發生。