一、 LDL 抽出物回收率及成分
自 100 ml 卵黃所獲得之 LDL 抽出物約為 47.6g (回收率 47.6%)。化學分析顯 示，此抽出物(圖 18)含水份、粗脂肪以及粗蛋白分別是 82.5％、13.9％及 3.4％。
經充分乾燥後之粗脂肪與粗蛋白含量則分別是80.4％和 17.9％。烘乾前、後之粗 脂肪/粗蛋白比值分別是 4.07 和 4.60，即脂肪與蛋白質比值因烘乾而提升(表 9)。
表 9. 新鮮雞卵黃 LDL 抽出物成份(%)
X±SD (n=4)為新鮮雞卵黃 LDL 抽出物成份之含量 成份 新鮮收集 烘乾後
水份 82.5±3.31 － 粗脂肪 13.9±3.5 80.4±2.8 粗蛋白 3.4±0.8 17.9±3.1 粗脂肪/粗蛋白 4.07±0.07 4.60±0.64
圖 18. LDL 抽出物(包含水分、粗脂肪、粗蛋白)
二、 硫酸銨殘留量之檢測
卵黃中的 β-livetin 會對精子造成傷害。因此，添加硫酸銨之目的，是為了將 卵黃中的β-livetin 沉澱。而透析後，可將透析袋中的硫酸銨析出，使袋中只留下 可保護精子之LDL 抽出物。
由於硫酸銨會對精子造成傷害。透析完成後，為了得知透析袋中的卵黃水溶 液是否仍有硫酸銨之殘留，為測定此卵黃水溶液之pH 值，作為硫酸銨殘留量之 指標。未添加硫酸銨之新鮮卵黃水溶液pH 值為 6.0，當添加 40％硫酸銨後，pH 值降為5.3。因此，經過透析後卵黃水溶液 pH 值若為 6.0 時，則可視為絕大多數 硫酸銨皆析出，此時的 LDL 抽出物方得用於本研究公猪稀釋精液中。經過透析 後卵黃水溶液pH 值若低於 6.0 時，則利用 0.1N NaOH 滴定，將之滴定為 pH 值 6.0，並以 0.1N NaOH 的滴定 ml 數多寡作為硫酸銨殘留量高低之指標。透析袋 內卵黃水溶液體積為50~55 ml 時，pH 值較低，代表其內有硫酸銨殘留，而透析 袋內卵黃水溶液體積為20~25 ml 時，則 pH 接近 6.0，視為硫酸銨殘留量可忽略，
此時之LDL 抽出物可添加於公猪精液中(表 10)。
表10. 卵黃水溶液透析後硫酸銨殘留量之影響
卵黃水溶液體積(ml) n pH 值 0.1N NaOH 量(ml) 添加於公猪精液 50~55 2 5.67±0.05 0.25±0.02 否
20~25 2 6.00±0.01 0.0±0.0 可 註：硫酸銨添加濃度與透析時間皆為40％與 24 小時
三、 蛋白質分析
(一) Lowry method assay 測定溶液中蛋白質之濃度
在 LDL 抽出物的萃取過程中之蛋白質樣品經過 Lowry assay 方法測定蛋白質 濃度後，將所測定之樣品一一紀錄。所測定樣品之吸光值觀察是否落在 BSA 標 準曲線之吸光值範圍中(圖 19)。若是未落於標準曲線內，代表此一樣品須先以
10 倍無菌蒸餾水稀釋後再予測定，若仍未落於標準曲線內，則須另以 20 倍濃度 稀釋，以此類推，直至蛋白質 sample 稀釋落於標準曲線內。將所稀釋之倍數記 錄下來，用於之後SDS-PAGE 膠體電泳實驗。
吸光值
(660nm)
BSA 濃度 (mg/ml) Y=0.2302X－0.0501
R2=0.9972 圖19. BSA 標準濃度吸光值相關分析圖
(二) SDS-PAGE 膠體電泳分析
LDL 抽出物樣品經過 Lowry assay 法測得之蛋白質濃度後，每個樣本檢體皆 取含有0.1 mg/ml 總蛋白的體積，然後與 1:1 等量之 sample buffer 混合後以 95℃
加熱4 分鐘，再將之注入至膠上預鑄之孔中，蛋白質樣品泳動完成後，將 gel 經 染劑Coomassie Brilliant Blue R-250 染色與甲醇與醋酸退染後，觀察依分子量分 離出不同大小的蛋白質成分，確實發現內含有與 LDL 分子量相當之分子。根據 Moussa et al. (2002)報告提出指出 140、80、65、60、15 kD 所呈現的 band 相當 於LDL 的主要 apoprotein，而 LDL 抽出物之分子量主要為 60~65 kD，在 40 kD 的 band 為被 β-livetin 少量污染(圖 20、21)。代表卵黃經過高速離心透析過後，
可以將高密度脂蛋白(HDL)、卵黃球蛋白、卵黃磷醣蛋白、這些對精子有害的物 質去除(Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)，只留下可以保護精子之 LDL 抽出物。
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
140 kD 80 kD 65 kD 60 kD
β-livetin LDL apoprotein
40 kD 97.4 kD
66.2 kD 45 kD 29 kD
20.1 kD
圖20. SDS-PAGE 膠體電泳圖：(1)protein marker；(2)、(3)及(4) 樣本 1.2.3.為原始雞卵黃；(5)、(6)及(7) 樣本 1.2.3.為添加 40％ ammonium sulfate 沉澱物；(8)、(9)及(10) 樣本 1.2.3.之 LDL 抽出物
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
140 kD 80 kD 65 kD
LDL apoprotein
60 kD
β-livetin 40 kD
97.4 kD 66.2 kD 45 kD 29 kD 20.1 kD
圖21. SDS-PAGE 膠體電泳圖：(1)protein marker；(2)、(3)及(4) 樣本 1.2.3.為鹽析法之 LDL 抽出物；(5)、(6)及(7) 樣本 1.2.3.為透析後上 清液；(8)、(9)及(10) 樣本 1.2.3.之 LDL 抽出物
圖 20，SDS-PAGE 膠體電泳圖中，(2)、(3)及(4)為原始雞卵黃之蛋白質樣品 經過離心透析之後，在(8)、(9)及(10)為 LDL 抽出物樣品所呈現之紋帶較原始雞 卵黃之蛋白質樣品清晰，代表原始雞卵黃經離心透析後可去除對精子有害的物 質，只留下可以保護精子之LDL 抽出物。
圖 21 中，由於加入硫酸銨之後，需要進行長時間透析(24 小時)，且顧慮到，
若有殘留之硫酸銨，會對精子造成外源性傷害，因此在本試驗中另外試做只有氯 化鈉的鹽析組，以期能減除後續長時間透析和殘留硫酸銨之顧慮。經試驗比較單 純鹽析(不加硫酸銨)與合併添加硫酸銨對雞卵黃 LDL 抽出物之影響。經蛋白質 SDS-PAGE 膠體電泳分析，發現鹽析法者 LDL 抽出物中相對上含有較低的 LDL apoproteins(或是相對上較高的 β-livetin) (圖 21)；而合併硫酸銨法，其 β-livetin 含量相對較低。故雖然鹽析法有較高的回收率，但品質上不能符合，故仍以鹽析 合併硫酸銨法較佳。
四、 精液稀釋
原精液經稀釋後，分別存放於 16℃和 4℃，每 24 小時加溫至 37℃後觀察稀 釋精液精子活力ㄧ次，比較兩者不同溫度對稀釋精液中精子之活力。
結果顯示，溫度效應顯著(P＜0.05)，存放時間效應亦顯著(P＜0.05)。儲放於 16℃之稀釋精液較保存於 4℃之稀釋精液更能保有精子活力(圖 22)。由於儲放溫 度與儲存天數之間的交感效應達顯著水準(P＜0.05)，此顯示，保存於 4℃之稀釋 精液較其保存於16℃的，精子其活力隨存放時間增加而有較大幅的下降。
精子活力不低於 70％為稀釋精液的基本要求，則顯示，儲放於 16℃溫度的 稀釋精液，其保存可達3 天，而存放於 4℃者僅能放置 2 天。至於存放在 4℃的 稀釋精液，在儲放 2 天期間的配種效果是否如儲放 16℃達 3 天之稀釋精液有相 同結果，此仍有待後續田間試驗測試，方能知曉。
精子活力
( ％ )
16℃
4℃
0 1 2 3 4 5 天
圖22. 稀釋精液保存於 16℃與 4℃對精子保存期間活力之影響
註：觀察精子活力前皆加溫至37℃再做觀察
五、 試驗結果
試驗1. 生鮮雞蛋與陳蛋對 LDL 抽出物收集量之影響
比較生鮮雞蛋(剛生產 12 小時內)、儲放 4℃及室溫之陳蛋(放置ㄧ週)之 LDL 抽出物回收量每一處理組各作二重覆，每重覆各使用7 顆雞蛋，其最初收集之卵 黃體積均為100 ml，離心透析之後，發現三組之 LDL 抽出物之含量有極顯著差 異(P＜0.01)。其中生鮮雞蛋之 LDL 抽出物回收量為 48.0±0.4 ml，而 4℃陳蛋組 為11.0±0.6 ml，室溫陳蛋組為 5.1±0.5 ml，三組平均值之差異均達極顯著水準(表 11)。顯然儲放一週導致 LDL 抽出物大幅降低，而低溫儲存有其延緩因儲存而導 致降低LDL 抽出物的效果。故本試驗結果可證明生鮮雞蛋絕對富含豐富的 LDL 萃取物。因此本研究採用生鮮雞蛋之 LDL 抽出物添加於公猪精液中，以改善公 猪冷凍精液之品質。
表 11. 儲存對雞蛋 LDL 抽出物含量之影響
雞蛋來源 n LDL 抽出物(ml) 生鮮雞蛋 2 48.0±0.4a 存放於 4℃之陳蛋 11.0±0.62 b 存放於室溫之陳蛋 2 5.1±0.5c
(陳蛋為存放一週內)
註：表中數字有a,b,c 不同上標者代表差異極顯著 (P＜0.01)
試驗2. 透析袋卵黃水溶液含量之多寡對 LDL 抽出物收集量之影響
本 試 驗 所 用 之 透 析 膜 是 默 克 公 司 所 生 產 之 Spectra/Por®1-7 Dialysis Membranes(圖 5)，透析前須將透析膜剪成適當長度約 15 cm，透析袋內卵黃水 溶液約可裝90~100 ml。在預備試驗中曾觀察到，若是透析袋內卵黃水溶液添裝 50~55 ml 或裝 20~25 ml 時，經過透析離心實驗後，裝 50~55 ml 者 LDL 抽出物 含量為25.6 ml；裝 20~25 ml 者 LDL 抽出物含量為 47 ml。本試驗目的即在比較 這兩種添加量對透析袋中卵黃水溶液的pH 值影響(pH 值可反映硫酸銨殘留量之 狀態，見本論文前述p.41)。經二重複試驗後發現，透析袋內裝 50~55 ml 卵黃水 溶液者較裝20~25 ml 者，透析離心後 LDL 抽出物收集量來得少(表 12)。此可能 因為透析袋內裝50~55 ml 卵黃水溶液者在透析過程中，由於透析袋會過度膨脹 無法達到透析袋內與袋外之平衡，造成透析袋內的硫酸銨也無法完全透析於袋 外。因此，本試驗結果顯示，在透析袋內裝25 ml 卵黃水溶液要較裝 50 ml 者有 較多的LDL 抽出物和較低的硫酸銨殘留量。
表12. 透析袋內卵黃水溶液含量之多寡與 LDL 抽出物收集量之影響
毎袋卵黃水溶液(ml) n LDL 抽出物(ml) pH 值 硫酸銨殘留判定 50 2 25.6±1.8b 5.7±0.0b 有 25 2 47.0±0.6a 6.0±0.0a 無
註：表中數字有a,b 不同上標者代表差異顯著(P＜0.05)
試驗3. 硫酸銨添加方式、透析時間長短對 LDL 抽出物收集量之影響
硫酸銨加入的多寡以及加入的快慢方式皆會影響到其沉澱蛋白的效果，並對 所要收集的蛋白抽出物造成影響。此外，硫酸銨之最終濃度亦會對影響透析結 果。故本試驗特別針對硫酸銨添加方式對透析時間以及 LDL 抽出物回收率之影 響作ㄧ比較。試驗中分別添加 30％、40％、50％的硫酸銨，經二重覆透析離心 實驗後，發現不同濃度的硫酸銨添加量，對於透析所需之時間與 LDL 抽出物呈 現明顯不同之差異(表 13)。試驗結果中，發現 40％硫酸銨添加量之濃度，經硫 酸銨殘留量檢測時並無硫酸銨殘留，最適的透析時間為24 小時。然而，添加 30
％硫酸銨者有較多的 LDL 抽出物含量，經透析離心後檢測雖無硫酸銨殘留，但 是仍有一些β-livetin 和其他未明紋帶未被完全沉澱(參圖 23)。由於 β-livetin 會對 公猪精子造成傷害，所以暫不考慮採用此硫酸銨之濃度。在添加50％硫酸銨者，
經離心後所有卵黃中的物質包括 LDL、HDL、β-livetin 及 phosvitin 大部分皆被 沉澱下來，且對精子有用之物質LDL 也被沉澱下來，卵黃水溶液呈現澄清狀態，
所以也不建議採用此硫酸銨之濃度。
表13. 硫酸銨添加之濃度及透析時間對 LDL 抽出物含量及硫酸銨殘留量之影響 硫酸銨 LDL抽出物含量(ml) pH值 硫酸銨殘留判定 濃度(％) 22hr 24hr 26hr 22hr 24hr 26hr
30％ 48.4±0.4Ba 52.9±0.3Aa 52.9±0.3Aa 5.6±0.0Bb 6.0±0.0Aa 6.0±0.0Aa 無 40％ 44.4±0.0Bb 48.0±0.4Ab 48.2±0.4Ab 5.8±0.0Ba 6.0±0.0Aa 6.0±0.0Aa 無 50％ 0.0±0.0Ac 0.0±0.0Ac 0.0±0.0Ac NA NA NA NA
註：表中同列數字有A,B,C 不同上標者代表顯著差異(P＜0.05) 同行數字有 a,b,c 不同上標者代表顯著差異(P＜0.05)
(1) (2) (3) (4) (5)
圖 23，SDS-PAGE 膠體電泳圖中，發現(2)(3)添加 30％硫酸銨之 LDL 抽出 物之紋帶，較(4)(5)添加 40％硫酸銨之 LDL 抽出物之樣品的紋帶來得雜亂，且經 過SDS-PAGE 膠體電泳分析，代表添加 30％硫酸銨之 LDL 抽出物並無法將 40 kD 的 β-livetin 對精子造成傷害之物質給完全沉澱。因此本研究採用 40％硫酸銨濃 度來萃取LDL 抽出物。
20.1 kD
(1)protein marker；(2)(3) 為添加 30％ ammonium sulfate 之 LDL 抽出物；(4)(5) 添加 40％ ammonium sulfate 之 LDL 抽出物
圖23. SDS-PAGE 膠體電泳圖：
140 kD 80 kD 65 kD
LDL apoprotein
60 kD
β-livetin 40 kD
97.4 kD 66.2 kD 45 kD 29 kD
試驗4. 透析法與鹽析法對 LDL 抽出物收集量之影響
由於加入硫酸銨之後，需要進行長時間透析(24 小時)，且顧慮到，若有殘 留之硫酸銨，會對精子造成外源性傷害，因此在本試驗中另外試做只有氯化鈉的 鹽析組，以期能減除後續長時間透析和殘留硫酸銨之顧慮。經試驗比較單純鹽析 (不加硫酸銨)與合併添加硫酸銨對雞卵黃 LDL 抽出物之影響。結果發現，單純 鹽析法其 LDL 抽出物的含量為 60.6±1.1 ml；而透析法其 LDL 抽出物的含量為 47.0±0.6 ml (表 14)，兩者差異顯著(P＜0.05)，顯示單純鹽析法有較高的 LDL 抽 出物。經蛋白質SDS-PAGE 膠體電泳分析，發現鹽析法者 LDL 抽出物中相對上 含有較低的LDL apoproteins(或是相對上較高的 β-livetin) (圖 21)；而合併硫酸銨 法，其β-livetin 含量相對較低。故雖然鹽析法有較高的回收率，但品質上不能符 合，故仍以鹽析合併硫酸銨法較佳。
表14. 透析法與鹽析法對 LDL 抽出物收集量(X±SE)之影響 萃取方法 n LDL 抽出物(ml)
鹽析法 2 60.6±1.1b 透析法 2 47.0±0.6a
註：表中數字有a,b 不同上標者代表差異顯著(P＜0.05)
試驗5. 添加 LDL 抽出物在新鮮(16 )℃ 和冷藏(4 )℃ 精液中對精子之保護效果 將 LDL 抽出物添加至用長生精稀釋液稀釋之新鮮稀釋精液中，並將添加後 之新鮮稀釋精液分別儲放在16℃與 4℃，然後比較其在不同儲存時間之精子活力 狀態。原精液樣本採自純種藍瑞斯公猪，每個原精均分成5 份。每份以固定配方 之稀釋，此外並額外添加0、4、6、8 或 10% LDL 抽出物。之後每份再均分成兩 小份，其中一小份置放在16℃，另ㄧ小份置放在 4℃。前 48 小時每隔 12 小時，
與48 小時之後每隔 24 小時，再回溫至 37℃後分別自各小份取樣測其精子活力(表 15、16)。結果顯示，發現 LDL 抽出物之適度添加量在 4%與 8%範圍之間(圖 24、
25)，且與對照組之精子活力相接近。雖然保存在 4℃下活力稍顯偏低，但在添加 LDL 抽出物後 2~3 日時，有明顯改善精子活力，而最適合之 LDL 抽出物添加量
當在 6％。表示添加 LDL 之適度添加量確實可以改善精子活力。不考慮時間，
只考慮 LDL 抽出物添加量對不同儲存溫度之影響(圖 26)，經冷藏處理後，精子 活力平均下降6.3±0.3 (P＜0.05)，6％添加量雖然有最高的平均精子活力值，但是 與對照組(0％)之差異不顯著。
表15. 在 16℃下不同 LDL 抽出物含量與在不同時間上之精子活力(％) LDL 抽出物添加量
儲存時間(小時) 0％ 4％ 6％ 8％ 10％
0 85.8±1.6Aa 83.5±1.7Aa 86.6±0.8Aa 84.6±0.7Aa 79.5±1.3Ba 12 88.0±1.7Aa 84.6±1.5ABa 86.6±0.8ABa 83.6±1.5Ba 78.1±1.4Ca 24 87.8±1.5Aa 81.8±0.9Bab 87.0±1.0Aa 83.0±1.5Ba 75.5±1.1Cab 36 84.1±2.1ABa 76.3±1.6CDbc 86.3±1.6Aa 80.6±1.9BCab 72.8±1.1Dbc 48 78.5±1.6Bb 73.8±1.7BCcd 84.0±2.2Aab 76.0±2.1Bbc 69.5±1.6Ccd 60 74.3±1.5ABbc 69.1±1.8BCde 79.8±2.3Abc 73.8±3.0ABc 66.0±2.3Cd 72 71.0±2.3ABc 65.1±2.9BCe 74.6±2.6Ac 69.6±3.0ABc 60.1±2.7Ce 96 60.8±1.8ABd 58.0±2.6BCf 65.8±2.2Ad 59.0±2.6BCd 52.6±2.2Cf 120 47.3±2.3ABe 47.5±3.1ABg 55.1±2.6Ae 49.1±3.7ABe 41.8±2.0Bg
X±SE, n=6
A,B,C：同列數字有不同上標者代表顯著差異(P＜0.05) a-g：同行數字有不同上標者代表顯著差異(P＜0.05)
表16. 在 4℃下不同 LDL 抽出物含量與在不同時間上之精子活力(％) LDL 抽出物添加量
儲存時間(小時) 0％ 4％ 6％ 8％ 10％
0 85.8±1.5Aa 82.1±1.1Ba 86.8±0.5Aa 84.8±0.5ABa 79.3±0.7Ca 12 78.6±0.5BCb 78.5±0.6Bca 83.0±0.4Aa 80.8±1.0ABab 77.3±1.4Ca 24 73.8±1.1BCd 74.1±0.6Bb 80.1±1.3Aab 77.5±1.4Ab 70.6±0.8Cb 36 69.5±1.3BCc 68.8±1.0BCc 74.8±1.6Abc 71.5±1.2ABc 66.0±1.0Cc 48 62.8±2.4Bd 62.6±1.7Bd 70.8±2.3Acd 65.6±2.1ABd 61.6±1.2Bd 60 57.6±2.4ABd 55.8±2.1Be 64.6±3.4Ad 61.1±3.0ABd 54.5±1.7Be 72 49.3±2.6ABe 47.3±1.3BCf 55.5±3.1Ae 52.0±2.7ABe 42.1±0.7Cf 96 37.6±2.3BCf 35.0±2.0BCg 46.6±2.9Af 40.6±1.3Bf 34.0±0.9Cg 120 27.6±3.4ABg 25.8±2.0Bh 33.8±3.0Ag 30.1±1.5ABg 25.0±1.5Bh
X±SE, n=6
A,B,C：同列數字有不同上標者代表顯著差異(P＜0.05) a-h：同行數字有不同上標者代表顯著差異(P＜0.05) 註：以上資料觀察精子活力前皆加溫至37℃