中 華 大 學 碩 士 論 文
題目：卵黃低密度脂蛋白抽出物之萃取條件對公猪 新鮮、冷藏及冷凍精液活力之影響
Effects of egg-derived low density lipoprotein extracts on the quality of fresh, chilled, and frozen
boar semen
系 所 別：資訊工程學系 碩士班
學號姓名：M09502006 謝立德 指導教授：張慧玫 博士
劉世華 博士
中華民國 九十七 年 七 月
中文摘要
公猪冷凍稀釋精液的推廣因精子的冷休克和冷凍解凍傷害而受到限制。雞卵黃 為冷凍液必備的成分之ㄧ，卵黃添加公猪冷凍精液中，可以適度保護精子，減少其 之冷凍傷害。卵黃中的低密度脂蛋白(low-density lipoproteins，LDL)被認為是其中的 主要有效成份。近年國外曾發表自雞卵卵黃抽取LDL 抽出物的方法，本研究目的在 重建此一萃取技術，探討最適萃取LDL 抽出物之條件，並探討將此萃取出之 LDL 抽出物用於添加至新鮮、冷藏及冷凍精液中，對精液品質造成的效應。
本研究是利用高速離心、硫酸銨沉澱及透析等流程先將大部分之HDL、phosvitin 以及β-livetin 除去。經上述過程處理後，每 100 ml 蛋黃可獲得之 LDL 抽出物約為 47.6 g。此抽出物之水份、粗脂肪以及粗蛋白％分別是 82.5、13.9 及 3.4。抽出物經 SDS-PAGE 及 Coomassie blue 染色，發現與 LDL 之 apoprotein 分子量相當之紋帶均 明顯增厚，而非LDL apoprotein 之紋帶則消失或減弱。雞蛋之新鮮度儲存溫度、透 析時卵黃在透析膜內之容積以及硫酸銨濃度等因素均會影響到LDL 抽出物。新鮮(生 下12 小時以內)、低溫、低透析容積以及適量濃度(40％)硫酸銨等條件均有利 LDL 抽出物之萃取。經由最佳條件化萃取之LDL 抽出物即用於添加在冷凍、冷藏及新鮮 精液的實驗。原精液樣本採自藍瑞斯公猪，每個原精均分成5 份。每份以固定配方 稀釋液稀釋，此外並額外添加0、4、6、8 或 10% LDL 抽出物。稀釋精液再分別儲 存在16 (℃ 新鮮稀釋精液)、4 (℃ 冷藏精液)，或是製備成冷凍精液(-196 )℃ 。之後，在 0 至 5 日(120 小時)每天觀察精子活力 1 至 2 次。冷凍精液則是儲放後 24~48 小時，
再予解凍觀察解凍後精子的活存率。精子活存率資料經Arcsin 轉型後，以線性模式 統計法分析LDL 抽出物添加量與儲存時間的效應。結果顯示，新鮮及冷藏精液之活 力在不同LDL 抽出物濃度及不同時間下皆達顯著差異(P＜0.05)，其中添加 6％LDL 抽出物可以延緩儲存期間精子活力下降的速度，使儲存期增加12 小時。在冷凍精液 方面，精子活存率對LDL 抽出物添加量之效應呈二次曲線變化 (P<0.05)，在添加量 為0 與 6%之間，活力隨添加量增加而增加，在 6~10%之間則隨添加量增加反降。
綜合上述，最適的LDL 抽出物添加量為 6％。本研究顯示，添加適度雞蛋之 LDL 抽出物於新鮮、冷藏及冷凍精液中可改善其精子活存率。
關鍵語：低密度脂蛋白、冷藏精液、冷凍精液、公猪
Abstract
The potential of cryopreserved boar semen has been limited since its development due to the cold shock effect and the freezing-thawing process that damage sperm membrane. Egg yolk is commonly included in cryopreservative formula to protect sperm from damage. Low density lipoproteins (LDL) in egg yolk are thought to be the key component responsible for the protection. Recent reports demonstrated that supplement of LDL-enriched extracts (LEE) from egg yolk using a simplified method could improve the quality of frozen semen. This study was to reestablish the method to extract LEE and to assess its effect in fresh, chilled, and frozen boar semen
Egg yolks were collected and subjected to processes of high-speed centrifugation, ammonium sulfate precipitation, and dialysis to remove the useless constituents such as high density lipoproteins, phosvitin and β-livetin. The recovery rate for LEE is 47.6%. Chemical analysis reveals that LEE contains 82.5% water, 13.9% crude fat, and 3.4% crude protein. Coomassie bule staining of the SDS-PAGE displayed intensified bands corresponding to the LDL apoproteins and diminished or vanished to other proteins. Both the conditions of eggs (freshness and storing temperature) and processing (concentrations of ammonium sulfate, dialysis time, and dialysis volume) affected recover rate and protective capability of LEE. Only the batches of LEE obtained from optimum condition were used in the proceeded experiments. Raw semen sample were collected from Landrace boars and each of the samples was partitioned into 5 parts. Those semen parts were extended with the regular formula plus 0, 4, 6, 8, or 10% of LEE. The diluted semen was stored at 16°C (fresh semen), 4°C (chilled semen) or prepared into frozen semen (-196°C). Sperm motility was microscopically determined at 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, and 120 hour for the fresh and chilled extended semen, and right after 1-2 days storing and thawing for the frozen semen samples. Data were arcsin-transformed and underwent statistical analysis using a general linear model to evaluate the effects of LEE and storage time.
Result shows that addition of LEE and storage time significantly affected motility (P<0.05). Specifically, addition of 6% LEE significantly (P<0.05) improves motility of both fresh and chilled extended semen after being stored 12 hour longer. In frozen semen, sperm survival showed a secondary does response to LEE supplement (P<0.05), reflecting an upward protection effect by LEE from 0% to 6% and a downward effect thereafter. Synthesize above-mentioned, most right LEE adding amount 6%. It is concluded that that moderate supplement of the LDL-enriched extracts from egg yolk may be beneficial to the fresh, chilled, and frozen boar semen.
Key Words: Low-density lipoproteins, Chilled semen, Frozen semen, Boar
誌謝
轉眼間為期二年的碩士班求學階段已經結束，終於要寫誌謝詞了。首先要感 謝我的指導教授劉世華和張慧玫兩位老師，在這段時間以來對我的指導與照顧。
再者，還要特別感謝台灣動物科技研究所的郭有海老師，他在我實驗上遇到瓶頸 時，不斷地給我鼓勵且幫忙我構思實驗設計，使論文得以順利進行。雖然這段期 間原指導教授劉世華老師至屏東科技大學畜產系任教，為了實驗之完整性我選擇 隨同老師至屏科大繼續進行，並因此學習到許多畜產相關知識，這都要感謝劉老 師在屏科大的指導與照顧。此外，他們在論文口試時提供的寶貴意見與觀念上的 指正，我的論文始能較完整呈現，在此謹對三位老師致上最誠摯的謝意。
要感謝的人還有動物科技研究所的許華珊小姐，華珊姐常不厭其繁地為我解 釋許多我不懂之處，並代為跑繁雜的行政流程。也謝謝陸勤小姐協助化學分析使 得實驗得以順利進行。此外，還要感謝屏科大畜產系繁殖育種研究室的學弟盈 翔，在實驗期間他提供了許多必要的協助，並適時給予鼓勵。另外也感謝屏科大 營養生理研究室與機械所機器視覺研究室的學弟佳佑、健榮，在我日常生活中給 予適時幫助。中華大學生物資訊系系統生物生理實驗室同學文斌、嘉慈以及學弟 妹育欣、國慶、紹宇、統文、柏妮，你們平時的幫忙和所帶來的歡樂氣氛，我都 點滴在心，銘感五內。
最後要感謝父母及家人，他們在我的求學過程中，無怨無悔付出與關心，使 我得以順利完成求學生涯之路。很慶幸遇到這麼多關心我的老師、學長、同學及 朋友。畢業之後就要邁向人生另ㄧ個階段，誠摯的祝福每位在我身邊的人平安順 心，諸事如意。
謝立德 謹上 2008 年 7 月
目錄
中文摘要………2
Abstract ……… 3
誌謝………4
目錄………5
圖表目錄………7
壹、前言………9
貳、文獻回顧………11
ㄧ、雄性生殖系統………..11
(一)睪丸……….11
(二)陰囊……….11
(三)附睪……….12
(四)輸精管……….12
(五)储精囊……….12
(六)前列腺……….13
(七)尿道球腺……….13
(八)尿道……….13
(九)陰莖……….13
二、精子之形成………13
三、精漿………14
四、精子之脆弱性………16
五、精液檢查……….16
六、精液稀釋………..17
七、精液冷凍………...20
八、公猪冷凍精液新鮮精液化 ………20
九、雞卵黃中低密度脂蛋白(LDL)………...20
十、低密度脂蛋白(LDL)對精子的保護 ………22
参、材料與方法………24
ㄧ、卵黃 LDL 萃取………24
(一)卵黃之收集.………24
(二)LDL 萃取分離………24
二、透析膜(Dialysis membranes)製備 ………27
三、硫酸銨(Ammonium sulfate)殘留檢測………28
四、LDL 抽出物之成份分析………28
(一)蛋白質分析……….28
(二)SDS-PAGE 膠體電泳分析 ………30
五、試驗猪隻………32
六、公猪採精方法………32
七、精液濃度檢測方法………33
八、精液稀釋………35
九、冷凍精液製備………35
十、試驗處理………37
十一、統計分析………39
肆、結果與討論………40
一、LDL 抽出物回收率及成分………40
二、硫酸銨殘留量之檢測………41
三、蛋白質分析………41
四、精液稀釋………44
五、試驗結果………45
伍、結論………56
參考文獻 ………57
圖表目錄
圖1. 公猪精子之形態 ……… 17
圖2. 卵黃與卵白於濾紙上做分離 ……… .25
圖3. 在 4℃環境添加 0.17 M NaCl 溶液於卵黃並混合情形………25
圖4. 於 0℃添加 40％硫酸銨並攪拌下混合………26
圖5. 透析膜與透析夾 ……… .27
圖6. 透析過程於 4℃下 ………...28
圖7. 光譜分析儀 (Jasco V-530 Spectrophotometer) ………...30
圖8. SDS-PAGE 電泳槽套組、電源供應器 ………31
圖9. SDS-PAGE 電泳裝置套組架設 ………31
圖10. 衛生採精(聚乙烯材質無粉手套) ………..32
圖11. 手握法採精………...33
圖12. 檢測公猪精液精子濃度之血球計數盤………..34
圖13. 檢測精子之位像差顯微鏡 (OLYMPUS CX41)..………..34
圖14. 顯微鏡下之血球計數盤觀察精子數量………..35
圖15. 稀釋液加溫至 35℃……….36
圖16. 稀釋液沿著容器內壁緩緩倒入原精的容器內………..36
圖17. 精子活力分析儀 NucleoCounter® (SP-100TM)………...39
圖18. LDL 抽出物(包含水分、粗脂肪、粗蛋白) ………40
圖19. BSA 標準濃度吸光值相關分析圖 ………42
圖20. SDS-PAGE 膠體電泳圖 ……….43
圖21. SDS-PAGE 膠體電泳圖 ……….43
圖22. 稀釋精液保存於 16℃與 4℃對精子保存期間活力之影響 ………45
圖23. SDS-PAGE 膠體電泳圖………48
圖24. 添加 LDL 抽出物對儲存 16℃稀釋精液精子活力之影響……… 51
圖25. 添加 LDL 抽出物對儲存 16℃稀釋精液精子活力之影響……… 51
圖26. 不同 LDL 抽出物含量與儲存溫度對稀釋精液精子活力之影響…………..52
圖27. 添加 0％和 6％之 LDL 抽出物對儲存 16℃和 4℃稀釋精液精子活力之影 響………..52
圖28. LDL 之蛋黃萃取物添加量對公猪精子冷凍及解凍後存活率之影響……..55
表1.公猪精子之生化組成、特性及精漿中主要之游離胺基酸 ………15
表2.目前較有名之稀釋液品牌………..18
表3. Lactose egg yolk 公猪冷凍精液稀釋液配方 ………..19
表4.公猪新鮮精液稀釋液配方………..19
表5. 蛋黃蛋白質之組成 ………. 22
表6. 各類家畜精漿中皆有同源性的 BSP 蛋白之含量與百分比………23
表7. 百分飽和濃度硫酸銨之添加量……… ...26
表8. Reagent C 溶液與 BSA 溶液添加量 ………29
表9. 新鮮雞卵黃 LDL 成份………40
表10. 卵黃水溶液透析後硫酸銨殘留量之影響………..41
表11. 儲存對雞蛋 LDL 抽出物含量之影響………..…46
表12. 透析袋內卵黃水溶液含量之多寡與 LDL 抽出物收集量之影響…………..46
表13. 硫酸銨添加之濃度對透析時間與 LDL 抽出物含量之影響………..47
表14. 透析法與鹽析法對 LDL 抽出物收集量之影響………..49
表15. 在 16℃下不同 LDL 抽出物含量與在不同時間上之精子活力………50
表16. 在 4℃下不同 LDL 抽出物含量與在不同時間上之精子活力………..50
表17. 影響精子存活率變因之變方分析表………..54
壹、 前言
由於多年持續的推廣，猪隻人工授精(AI)技術在國內養猪界已甚為普遍。使 用冷凍精液除可用於保種和引種之外，尚可有效紓解供需在時空上限制。然而冷 凍精液用於母猪配種的效果並不佳，其原因在於冷凍與解凍過程中會傷害精子。
另外，新鮮稀釋精液運送和儲存時的保溫是另一個推廣稀釋精液的瓶頸。稀釋精 液在運送時要維持特定溫度16 (℃ 範圍15-18 )℃ 。此一溫度並非習用的溫度，室 溫(25 )℃ 、冷藏(4-8 )℃ 或是冷凍(-196 )℃ 溫度。在作法上，為配合達成此一需求 溫度，AI 站必須自備電子控溫的 16℃儲存櫃，而購買稀釋精液的客戶大抵亦是 如此。至於在中間的包裝、儲存及運送，則必須依賴水袋、冰寶、紙板及保麗龍 盒等材料，將稀釋精液連同注精軟瓶容器妥善包裝，之後再交由宅配或是其他交 通工具，送達客戶手中。在此運送過程中要長時間維持均勻的16℃控溫並不容 易，因而造成客戶收到的稀釋精液的品質均頗為勘慮。因此如能設法使精子儲存 在習用的4-8℃的冷藏溫度，則無論是包裝、運送及儲存，將是很方便且節省成 本之舉，有助於稀釋精液推廣和調節其供需。
然而，在冷凍精液冷凍與解凍時容易造成精子的損傷，在稀釋精液在 4-8℃
運送與儲存時，也會有冷休克(cold shock)的問題待克服。冷休克造成精子細胞膜 磷脂質排列改變，進而被氧化和產生連串後續反應，包括精子活力衰退、提早老 化而失去使卵受精之能力(White, 1993)。研究指出，蛋黃中的低密度脂蛋白 (low-density lipoprotein, LDL)含有豐富磷脂質與膽固醇，可在精子細胞膜外形成 一個保護膜，保護精子並提升精液品質(Hu et al., 2005)。一般精液冷凍配方亦有 添加卵黃(Hu et al., 2005)，雖然卵黃中 LDL 為主要有效成分，但卵黃中之其他成 分則是無益，甚至可能有害。傳統上雞卵中之LDL 萃取有其困難，並不實用 (Moussa et al., 2002)。近年來國外報告提及簡易的 LDL 抽出技術，所抽出之 LDL 抽出物應用在牛和猪之冷凍精液(Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)，初步結果顯 示效果良好。然而在實驗材料、萃取條件等細節方面，這些文獻並未多做敘述。
此外，雞卵在取用上亦有新鮮度和儲存期等的不同，是否這些細節和雞卵條件會 影響到LDL 之萃取效率，這些都有待深入探討。故本研究目的在建立有效的雞 卵卵黃LDL 抽取方法，並將依改良方法取得之 LDL 抽出物分別添加於新鮮 (16 )℃ 、冷藏(4 )℃ 稀釋精液及冷凍精液(-196 )℃ ，以評估LDL 抽出物是否可以有 效降低冷凍或是冷藏對精子造成的傷害。
貳、 文獻回顧
新鮮精液和冷凍精液的保存是人工授精重要ㄧ環，欲有良好保存工作，需對 精子及稀釋液有所了解，本文獻探討先針對這部份作ㄧ陳述。
ㄧ、 雄性生殖器官
雄性生殖器官可分為性腺(睪丸)、附屬生殖器官(附睪、輸精管、儲精囊、前 列腺、及尿道球腺)及外生殖器官(陰莖、包皮、陰囊)等三部份，各部份之構造及 功用略述如後。
(一) 睪丸 (Testis)
睪丸成對，在陰囊內為中間分開成兩顆，懸於體腔外面。睪丸內有盤曲的曲 細精管(seminiferous tubules)。精子經由在這些管內進行的一連串的細胞分裂而產 生，這一過程叫做精子生成(spermatogenesis)。睪丸亦有內分泌的功能，分泌睪 固酮等雄性素，這種內分泌素對公猪性行為及第二性徵如暴牙和魁偉的前軀具有 作用。睪固酮對各生殖器官的發育及維持亦為需要(吳與郭，2001)。公猪睪丸重 量約佔體重的0.2–0.4％，大約是 400 公克。睪丸大小與精子產量成正相關(Foote, 2003)，而睪丸大小與激濾泡素(follicle-stimulating hormone, FSH)成負相關(Ford et al., 2001)。伴隨此關係是睪丸實質組織(parenchymal tissue)顏色的改變，較大睪
丸(300-400 公克)為粉紅到微紅色，小睪丸(100 公克)則是暗褐紅色。顏色變化被 認為是小的睪丸中含有較高的鐵和鐵質蛋白混合物(ferritin)，當 FSH 濃度上升，
刺激鐵的運送，因而提高睪丸中鐵的濃度，同時也伴隨每日精子產量下降(Wise, 2003)。較大的睪丸被視為有助提升公猪生育力和母猪繁殖性能(Huang, 1996)。
(二) 陰囊 (Scrotum)
猪的陰囊位於肛門之下，睪丸在其中幾乎呈水平的位置。睪丸如果不下降陰
囊裡，則不能生產正常比率的精子。在猪偶有一個或二個睪丸保留在腹腔內，這 情形叫做隱睪(cryptorchidism)。假使兩個睪丸都為隱睪，因雄性激素的分泌不受 妨礙，性行為也許正常，但這公猪將不能生育(吳與郭，2001)。
(三) 附睪 (Epididymis)
附睪密接於睪丸，分為頭、體、尾三部。頭部在下，尾部在上。附睪基本上 由彎曲單一管道組成，緊密捲曲和由被膜包覆，且堅實的附著在整個睪丸背側表 面。附睪為精子從睪丸到輸精管之通道，精子在附睪成熟和儲存。附睪分成頭 (caput)、體(corpus)和尾(cauda)三部份。附睪頭位於睪丸的近端，與從睪丸輸出 精子之輸出管(efferent ducts)連接，細長的附睪體終止於睪丸遠端的附睪尾部。
附睪可大量吸收從睪丸釋出的液體，同時精子進入附睪後活動力漸增，也逐漸具 有受精能力(Nagai et al., 1988)。Burkin and Miller (2000)報告指出公猪附睪尾精子 具有受精的能力，此時精子具有透明帶結合蛋白(zona pellucida protein binding) 覆蓋於頭帽脊部(acrosomal ridge)。
(四) 輸精管 (Vas deferens)
為一細長之索狀管，起自附睪尾部與血管，神經形成精索經鼠蹊管入腹腔；
左右兩條輸精管會合後與尿道相接。輸精管內有纖毛細胞，此有助於精子朝向尿 道方向移動(吳與郭，2001)。
(五) 貯精囊 (Seminal vesicular)
貯精囊成對，位於膀胱後背方，輸精管壺腹之外側。貯精囊外被漿膜及纖維 膜，中層為肌肉層，內層為黏膜，呈薄皺壁狀，有管泡狀腺體，其分泌物與輸精 管分泌物均進入尿道。公猪的貯精囊特別發達，可分泌白色或淡黃色膠狀液體和 營養物，形成精漿的一部份(Potts et al., 2000)。雖名為貯精囊，而實際上精子並 非儲存於此。
(六) 前列腺 (Prostate gland)
又稱攝護腺，其底部以 16-18 支小管開口於尿道，攝護腺分泌物由此小管進 入尿道。攝護腺之分泌物有特殊臭味，導致精液有異味產生。分泌物主要功用為 移去精子活動時所產生之二氧化碳，避免精液趨於酸性，確保精子活力。此分泌 物與儲精囊分泌物相接觸，可在陰道內凝成塊狀，防止精液外流，有助於授精。
由於分泌物富含蛋白質及離子之鹼性分泌液，故具有在射精前清洗尿道的功用，
並且提供精子易於活動的液體。
(七) 尿道球腺 (Bulbo-Urethral gland)
又稱考氏腺(Cowper，s gland)，位於骨盆部尿道兩側，直徑長達約 4 公分，
接於坐骨弓。此小管與尿道相通，分泌鹼性液與貯精囊分泌之膠狀物質起反應而 成凝膠狀物質。
(八) 尿道 (Urethra)
為尿液排出之孔道，亦為精液射出之通道；長管狀起自膀胱而達陰莖尖端，
其間有輸精管及貯精囊開口於其起點部位(吳與郭，2001)。
(九) 陰莖 (Penis)
為公猪交配之性器官，並為排尿之功用。勃起形細長，尖端螺旋狀。以左右 陰莖腳(crura penis)始於坐骨下面，向前下方形成陰莖根(radix penis)。陰莖之中 央部為陰莖體(corpus penis)，其上面為陰莖背(dorsum penis)，尖端膨大部位為龜 頭(glans penis)。
二、 精子之形成
精子形成的過程，是從睪丸內未分化生殖細胞(germ cells)衍生出精子，然後
成 熟 和 儲 存 於 附 睪 。 在 發 育 過 程 開 始 時 ， 位 於 上 皮 組 成 之 精 原 細 胞 (spermatogonium)先是分裂成初級精母細胞(primary spermatocyte)，之後再經ㄧ次 減數分裂形成次級精母細胞(secondary spermatocyte)，次級精母細胞再裂成精細 胞(spermatid)，最後經細胞分化成為精子(sperm)。形似蝌蚪的精子這時還不具備 授精能力，須再於附睪繼續停留7 至 14 天，才發育成具運動能力和授精能力的 成熟精子。當精細胞初形成時，它們仍具有上皮細胞的ㄧ般特徵，但很快地大部 分的細胞質消失了，而每個精細胞開始伸長為精蟲。成熟的公猪精子可分為頭、
頸和尾等部份，頭寬約4.20±0.46μm，厚度為 1.52±0.18μm，長為 8.49±0.41μm，
而頸長約為11μm，尾長 38μm(吳與郭，2001)。
三、 精漿
精漿主要是附睪及貯精囊、攝護腺、尿道球腺等輔性腺分泌所組成的混合 物。精漿含有豐富的有機物質，包括檸檬酸(critic acid)、肌醇(inositol)、麥角組 織 胺 基 硫 、 果 糖 、 甘 油 磷 酸 化 膽 鹼(glycerylphosphorylcholine)、山梨聚糖醇 (sorbitol)、維生素 C (ascorbic acid)、胺基酸(amino acid)、胜肽(peptides)、蛋白質、
脂質、脂肪酸和一些酵素。其中果糖在大多數動物為提供精子活動時作能量之來 源。血糖為精液中果糖之前身，山梨聚糖醇可能為葡萄糖轉變為果糖之中間產 物。猪精子在缺乏氧的情形下，轉變果糖為乳酸較牛羊為慢，因此，其活力較低 (Rozeboom et al., 2000)。但在有氧之情況下其活力較高，此可能由於其能氧化乳 酸之效率高，並可利用甘油、丙酸及醋酸等物質所致。精漿為運輸媒介，且含有 抗氧化劑，能保護精子，避免氧化衝擊(Potts et al., 2000)，並藉由刺激子宮收縮 增加精子的運輸以及提供子宮內免疫調節。Rozeboom et al. (2000)報告中指出含 有精漿的第一次人工授精能改善子宮內環境，有利於之後的授精，因此可提高母 畜的繁殖能力。精漿並不會影響LH 潮湧(surge)時間，但能夠縮短 LH 潮湧到排 卵的間隔時間，因此可能具有促進排卵的作用(Soede et al., 1998)。公猪精液之組 成份及特性列於(表 1)。
表1.公猪精子之生化組成、特性及精漿中主要之游離胺基酸
Table 1. Characteristics, chemical components, free amino acid for boar semen and semen plasma
組成份及特性 濃度 Characteristic on component Concertration 射精量；(Ejaculation volume, ml) 150-120 精子濃度(百萬/ml) 200-300 (Sperm contraction, million/ml)
精子/射出(億)；(sperm/ejaculate, billion) 30-60 活動力精子數(％)；(Motile sperm, ％) 50-80 型態正常的精子比率(％) 70-90 (Morphologically normal sperm, ％)
蛋白質；(protein, g/100ml) 3.7 pH 7.3-7.8
果糖；(Fructose, mg/100ml) 9
山梨聚糖醇；(Sorbitol, mg/100ml) 6-18 檸檬酸；(Citric acid, mg/100ml) 173
肌醇；(Inostiol, mg/100ml) 380-630 甘油磷酸化膽鹼 110-240 (Glyceryl phosphoryl choline (GPC), mg/100ml) 麥角組織胺基酸；(Ergothioneine, mg/100ml) 17
鈉；(Sodium, mg/100ml) 587
鉀；(Potassium, mg/100ml) 197
鈣；(Calcium, mg/100ml) 6 鎂；(Magnesium, mg/100ml) 5-14 氯；(Chloride, mg/100ml) 260-430 精漿中游離胺基酸種類
麩胺酸；(glutamic acid, mM) 2.04 丙胺酸；(alanine, mM) 0.24 甘胺酸；(glycine, mM) 1.48 精胺酸；(arginine, mM) 0.01 離胺酸；(lysine, mM) 0.03 天門冬胺酸；(aspartic acid, mM) 0.18 絲胺酸；(serine, mM) 0.14
(Mann and Lutwak-Mann, 1981)
四、 精子之脆弱性 精液冷凍與解凍導致精子頭帽受損、活力下降並使配種率隨之變差。而另一
個原因為低溫而引起的冷休克(cold shock)現象則是指精子經過低溫處理後，其活 力、頭帽反應和精卵結合能力均明顯下降的一種現象。此現象除出現在猪之外，
在人、鼠、牛、羊、馬和低等動物也很普遍。
公猪精子對於溫度非常敏感(Johnson et al., 2000)。當新鮮精液射出後，外界 溫度若低於15℃，即會造成精子存活率下降，尤其是當快速降溫至 1-2℃時，更 會造成精子的大量死亡。在細胞學角度來看，精子的冷休克敏感特性是因為不可 逆的失去胞膜選擇性滲透能力、細胞膜完整性、頭帽外膜以及粒線體，這些結果 造成細胞的死亡(Park and Lynch, 1992)。低溫傷害主要發生在精子的細胞膜，使 精子細胞膜產生縫隙(membrane leakiness)，細胞膜通透性隨之提高。細胞膜通透 性增加同時導致細胞外液的成分(包含稀釋液和抗凍液)流入細胞內(Waston, 1990)。其中某些進入細胞的成分具有毒性。細胞外液的流入也改變了精子內部 滲透壓，不利於精子的生存。研究報告指出，低溫形成的傷害不只是改變細胞膜 磷脂質的理化特性而已，其對細胞膜表面蛋白質也造成破壞(Waston, 1990)。這 些蛋白質是成熟精子所特有的，為精子維持其內外滲透壓恆定(例如離子通道 ion channel 蛋白)、頭帽反應和精卵識別性融合等過程是不可或缺。因此如果遭 到破壞，自然也就失去精子的活力和使卵授精的能力。
冷休克造成磷脂的釋出(Darn-Bennett et al., 1973; Park and Lynch, 1992)。精 子對冷休克敏感與磷脂內的不飽和(unsaturated)與飽和(saturated)脂肪酸比例和膽 固醇含量有關，精子之高不飽和脂肪酸含量亦受過氧化物作用(peroxidation)而傷 害，因而影響精子之活力、代謝、超微結構與生育力(White, 1993)。另外，其它 的因素如pH 值、滲透壓的變化等，也容易對精子造成嚴重的傷害。
五、 精液檢查
公猪精液之檢查項目包括精子濃度、活力、形態、精液的量、pH 值、滲透
壓、顏色、氣味以及其中的含菌數等等。其中最為重要的為精子濃度、活力、形 態(圖 1)，目前為猪隻人工授精站的例行檢查項目(郭與劉，2005)。
精液檢查的目的是在檢驗精液的品質，包括了活力、形態和精子數。在此階 段，精液溫度要盡量維持在 35℃，避開日光照射。檢查過程愈快完成愈好，全 程最好不要超過 5 分鐘。為了準確分析精子性狀，顯微鏡要附上可加溫到 37℃
的加熱板。
圖 1. 公猪精子之形態(郭，2005)
精液稀釋
，因此必須加入適當之稀釋液，以延長精
。此外，藉由添加外來液體，以擴充原精體積，使得 一次採得之原精可供多隻母猪授精，這也是精液稀釋的目的之ㄧ。故稀釋液應用 應當包含下列目的： 增加精液量，可提供更多母猪配種使用。 供給精子代 謝的營養物質，保護精子防止遭受冷休克。 維持滲透壓，緩衝不良物質的危 害。 抑制細菌的繁衍，延長精子存活時間。 便利於精液的有效保存與運輸 六、
精漿本身無法提供精子的長期保存 子的存活和維持授精的能力
(1) (2)
(3)
(4) (5)
(Levis, 2000)。
為達到對精子具有保護的目的，稀釋液本身必須對精子無任何損害、且其成
2.目前較有名之稀釋液品牌
長期儲存稀釋液(3-5 天) 本要低，效果要好。稀釋液的滲透壓必須與精液的滲透壓相等。如果滲透壓低，
水分吸入精子體內，會造成精子膨脹死亡；過高時，水份從精子體內滲出，致使 精子萎縮，造成死亡。稀釋液之pH 值要求呈微鹼性或中性(7.0 左右)為宜，以對 精子原生質膜有保護作用。目前在業界常用之稀釋液配方列於表2。表 2 中這些 稀釋液可分為短期(1-3 天)和長期(3-5 天)之儲存液。常用之公猪新鮮精液稀釋液 配方列於表4，冷凍精液常用之稀釋液配方列於表 3。
表
短期儲存稀釋液(1-3 天)
Egg yolk/Glucose Androhep
IVT SCK7 (Modified IVT)
郭與劉，2003) (Illinois Variable Temperature) Zorlesco
Kiev Modena Kharkov MR-A BTS 威兒精 長生精
(
3. Lactose egg yolk 公猪冷凍精液稀釋液配方
釋液別 組成份 重量 表
稀
Lactose egg yolk 11％ Lactose solution 80.0 毫升 升
2006) Egg yolk 20.0 毫
Lactose egg yolk 11％ Lactose solution 80.0 毫升 ＋Glycerol Egg yolk 20.0 毫升 Glycerol 7.2 毫升 O. E. P. 1.6 毫升 (郭，
表4.公猪新鮮精液稀釋液配方
組成份 Kiev BTS IVTmod Zorlesco Modena Butschwil monohydrate 60.0 - 3.0 11.5 27.5 35.5 anhydrous -
bicab nate
m
6 5. 5 5
- - - 4.1 2.9 3.15
S e
3 3 29 2 2
7 6 9
37.15 - - - - Sodium citrate 3.7 6.0 24.8 11.65 6.9 6.9
Sodium 1.2 1.25 2.4 1.75 1.0 1.0
EDTA, disodium
3.7 1.25 - 2.35 0.35 0.35
Potassiu Chloride
- 0.75 0.3 - - -
Tris, buffer Citric acid
- - - .5 65 .6
Cystein - - - 0.07 - 0.054
BSA - - - 5.0 - 3.0
MOPS - - - - - -
HEPE - - - - - -
Trehalos - - - - - -
滲透壓 80 30 0 240 40 84
pH 6.8 .2 - - .9 -
(郭與劉，2003)
七、 精液冷凍
以人工授精觀點來看公猪精液明顯不同於其他家畜的精液之處有三，第1：
容量之精液；第2：採集後之精液對突然的降溫極為敏感，也就
如前所述，做人工授精配種之精液可分為新鮮精液與冷凍精液兩種，新鮮
肉猪，而冷凍精液目前因配種效果差，雖然其儲
tein, LDL)
哺乳動物精子冷凍時不可缺少的成分為卵黃(egg yolk)，將之添加於冷凍液
害。在冷凍解凍過程，
rotein)及磷醣脂蛋白質(phosphoglyco- 公猪可以生產大
是冷休克問題；第3：接受低溫處理精液的母猪是一胎多生，低溫效應至精液品 質下降，連帶造成母猪ㄧ胎的產仔數大幅減少。由於一般儲存溫度(15-20 )℃ ，只 能保存稀釋精液數日，而冷凍精液(-196 )℃ 則可長期保存。為了讓公猪精液在冷 凍和解凍後仍可使精子保持其生育能力，必須應用適當的冷凍過程，以及改變冷 凍精液稀釋液的配方以提升冷凍精液在解凍後的精液品質(郭，2006)。
八、 公猪冷凍精液新鮮精液化
精液可作為種猪改良和繁殖上市
存期很長，現階段也僅能作種猪之改良或自場猪種性能比較及評估用。新鮮精液 雖然優點相對較多，但因精子在體外環境活存的時間有限，即使使用目前市面流 通之最佳的配方，亦只能保存ㄧ週，因細菌的繁殖而影響受胎或感染疾病。新鮮 精液保存的極限是3 天(短效型稀釋液)或 5 至 7 天(長效型稀釋液)。如欲保存更 久，則只有超低溫冷凍保存一途 (郭，2006)。
九、 雞卵黃中低密度脂蛋白(low density lipopro
中，可適度保護精子，減少冷凍和解凍過程對精子造成的傷
精子細胞膜和頭帽的膜皆會受損。而卵黃中的低密度脂蛋白卻可以適時保護精子 的膜(Moussa et al., 2002)，維持其染色體 DNA 的完整性(Moussa et al., 2002)，因 而降低了冷凍精子形成的傷害程度。
卵黃中主要成分除水之外，主要是醣蛋白質(glycoprotein)、磷醣蛋白質 (phosphoglycoprotein)、脂蛋白質(lipop
lipoprotein)等(Gilbert, 1971)。卵黃含有約 16％蛋白質，其大部分為磷蛋白質 (phosphoprotein)以及與脂質結合而成之脂蛋白質，包括脂蛋白質與脂卵黃磷蛋 質(lipovitellin)、卵黃磷蛋白(phosvitin)、卵黃球蛋白(livetin)及核黃素結合蛋白 (yolk riboflavin binging protein, YRBP)等(Gilbert, 1971)。這些蛋白質成分可以離心 分離、電氣泳動及色層分析等技術來分離、純化。有關的部份是低密度脂蛋白 而其他蛋白部分則與保護效果無關，有的(例如 β-livetin)還會傷害精子(Hu et al., 2005)。卵黃蛋白質、脂質及磷含量等成分列示於表 5。
卵黃中之低密度脂蛋白(LDL)為卵黃可以對抵抗精子冷休克改善精子活力
之有效成份(Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)。Moussa
白
。
et al. (2002)報告提出，
蛋黃pH 值亦會逐步上升，但變化之程度不大，如放置ㄧ週後 使用從雞卵黃中萃取 LDL 來替代卵黃，將之用於牛的冷凍精液，結果冷凍解凍 後的牛精子活力大幅改善。而在猪精子方面則在Hu et al. (2005)報告中提出，也 使用從雞卵黃萃取 LDL 替代卵黃冷凍解凍猪精子易獲得較佳之精子活力和完整 頭帽之精子率。
卵黃的 pH 值可顯示蛋的新鮮程度。新鮮雞蛋產下時，其蛋黃之 pH 值約為 6.0。蛋放愈久則其
之蛋黃 pH 值僅上升為 6.2，即使放置時間再長 pH 亦僅上升至 6.8 左右(Gilbert, 1971)。
表5. 蛋黃蛋白質之組成(％)
蛋白質 重量 固形物 蛋白質 脂質 脂質磷 蛋白質磷 低密度部分 33.7 65.0 22.0 93.0 19.0 —
2.1 4.0 12.0 － － 69.0 蛋白 8.3 16.0 36.0 7.0 12.0 12.0 結合蛋白 － － 0.4 － － －
2.6 5.0 － － － －
(Gilbert, 1971) (Low density fraction)
卵黃球蛋白 5.3 10.0 30.0 － － － (Livetin)
卵黃磷蛋白 (Phosvitin)
脂卵黃磷 (Lipovitellin) 卵黃核黃素
(Riboflavin binding protein) 其他
(Others)
十、 低密度脂蛋白(LDL)保護精子的機制
Bergeron and Manjunath (2006) 提出 LDL 對於精子保護機制之假說。依據該 與附性腺所產生的精漿混和之後再射
故LDL 對儲存中的稀
3 和 BSP-30-kD 三種。此三種蛋白質約佔牛精漿中總蛋 假說，精子於附睪中成熟後，在射精前會先
出。精漿中的精漿蛋白，例如BSP(bovine seminal plasma protein)，會有助於精子 產生獲能作用(capacitation)，增加細胞膜的流通性，以便精子行頭帽反應時，可 釋出其中的水解酵素，而這有助於精子穿透卵子之透明帶。但是細胞膜流通性增 加不利於儲存中的精子，導致精子活力下降以及死亡。
卵黃中之低密度脂蛋白(LDL)可有效包覆精子細胞膜，防止 BSP 蛋白家族對 精子細胞膜持續性的破壞(Bergeron and Manjunath, 2006)，
釋精液具有保護作用。
BSP Protein 全名為 bovine seminal plasma protein 其在牛精漿中主要的蛋白 質有BSP-A1/A2、BSP-A
白質的65% (Bergeron and Manjunath, 2006)。各類家畜精漿中皆有同源性的 BSP 蛋白，如在猪有pB1，馬有 HSP-1、HSP-2 和 HSP-12 kD 等等(表 6)。各類家畜
精漿中同源性BSP 蛋白之含量與百分比(表 6)，公牛的精漿中每 ml 中約有 39.1 mg 的BSP 蛋白，約佔總精漿蛋白的 65%。含量比例最少的則是 Bison 每 ml 中約有 0.3 mg 的 BSP 蛋白，約佔總精漿蛋白的 1.1%。猪則僅每 ml 中約有 3.0 mg 的 BSP 蛋白，約佔總精漿蛋白的25% (Bergeron and Manjunath, 2006)。
精漿中的 BSP 蛋白因為此作用，必須先與精子細胞膜上的磷脂質和膽固醇 結合，此為造成細胞膜中磷脂質和膽固醇的流失，如此將影響稀釋精液在儲存期
程中 al., 2002; Bergeron and Manjunath, 2006)。研究顯示，添加不
pecies BSP protein homologs (mg/ml) (% of total proteins)
間品質，並造成母猪配種率之下降。並也提出於稀釋精液中添加LDL，可以有 效包覆精子，並與BSP 蛋白結合，減少細胞膜被破壞的機會(Bergeron and Manjunath, 2006)。
此外，研究指出 LDL 可以直接包覆精子的細胞膜，降低精子在冷凍過 受到傷害(Moussa et
同百分比LDL 至牛與猪的冷凍精液，解凍後，精子活力較高且頭帽較為完整 (Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)。這些試驗結果顯示，添加 LDL 於稀釋精液 中，或是將之添加於冷凍精液中都能對精子產生保護效果。
本研究的目的在建立一套可行的卵黃 LDL 分離之方法，將之用於添加於公 猪新鮮，冷藏及冷凍精液中，檢視其是否可以改善精液品質。
表6. 各類家畜精漿中皆有同源性的 BSP 蛋白之含量與百分比
S
Bull BSP-A1, BSP-A2, BSP-A3, BSP-30 kDa 39.1 65 Boar pB1 3.0 25 Stallion HSP-1,HSP-2,HSP-12 kDa 15.0 30 Goat GSP-14, GSP-15, GSP-20, GSP-22 kDa 5.6 20 Ram RSP-15, RSP-16, RSP-22, RSP-24 kDa 2.0 20 Bison BiSV-16, BiSV-17, BiSV-18, BiSV-28 kDa 0.3 1.1
(Bergeron and Manjunath, 2006)
參、 材料與方法
ㄧ、 卵黃 LDL 萃取
建立最佳LDL 萃取條件。萃取雞卵黃 LDL 之方法大 2002)和 Hu et al. (2005)所述之方法，並略作修正。敘述如
收集新鮮產下雞蛋，將雞蛋之外殼用清水沖洗乾淨，在室溫下自然風乾。打
％的稀釋酒精噴灑於操作者之雙手與雞蛋外殼，做初步的殺菌
將收集的卵黃以 1：1 的方式添加 0.17M NaCl 水溶液，攪拌混合均勻(圖 3)。
5 min, 4 )℃ 。離心後收集上清液部份。然後將收集之上清液
。添加硫酸銨的量如 本研究目的之ㄧ首先是
致上依Moussa et al. ( 下：
(一) 卵黃之收集
蛋之前，需以 75
工作。打蛋時做初步之卵黃與卵白分離，亦即將卵黃完整的留滯於分裂成半的卵 殼中，並緩慢將卵白之部份流到備用之空瓶內。隨後，再將雞卵黃置於濾紙上，
以滾動的方式去除殘餘的卵白(圖 3)，將收集的卵黃置於冰浴上。
(二) LDL 萃取分離
之後離心(10,000 g, 4
再次以相同條件離心，此目的是為了充分除去其沉澱物。
收集離心後之上清液，將之連同燒杯容器置於含碎冰之水浴內，然後添加 40％硫酸銨((NH4)2SO4)於此卵黃水溶液(即上清液)中(圖 4)
表 12 所示。充份混合後離心，收集其上清液。將上清液裝入透析膜袋(dialysis membranes) 中 。 透 析 膜 是 使 用 默 克 公 司 所 生 產 之 Spectra/Por®1-7 Dialysis Membranes(圖 5)，讓裝入透析袋中上清液約為 1/3 滿，以避免透析過程中過度 膨脹而破裂。透析24 小時後，將透析袋中的卵黃水溶液收集離心，完成後上層 懸浮物即為LDL 抽出物
，
供後續化學分析及添加於冷凍液配方之用。圖 2. 卵黃與卵白於濾紙上做分離
圖 3.在 4℃環境添加 0.17 M NaCl 溶液於卵黃並混合情形
圖 4. 於 0℃添加 40％硫酸銨並攪拌下混合
表7. 百分飽和濃度硫酸銨之添加量
說明:(1)此表是在
0℃下的百分濃度表。若在其它溫度，則有不同的數字；溫度
越高，所需的硫酸銨越多(2)若卵黃水容液為 100 ml，要配秤 40%硫酸銨溶液時，須查表中的硫酸銨 起使百分飽和濃度為 0%及最終硫酸銨百分飽和濃度 20%兩者交替之量為 106
本研究透析過程是使用的是 Spectra/Por®1-7 (Merck)(圖 9)。透析前須將透析
％ sodium bicarbonate 與 1 mM EDTA (pH
g/L，由於卵黃水溶液只有 100 ml，故硫酸銨秤 10.6 g。秤取之硫酸銨然後加入 卵黃水溶液，經充分混和溶解。溶解後由於體積會增加，須定量卵黃水溶液增加 之毫升數。若溶解後毫升數增為110 ml (0.11 L)，須再查表中的硫酸銨起使百分 飽和濃度20%最終硫酸銨百分飽和濃度 40%為 113 g，即卵黃水溶液再加入 113 g×0.11=12.43 g 的硫酸銨。此時卵黃水溶液中之硫酸銨濃度即為 40%。
二、 透析膜(Dialysis membranes)製備
膜剪成適當長度(約 15 cm)，置入含有 2
8.0)的溶液中沸騰 10 分鐘。之後，再用蒸餾水沖洗透析膜。之後，再將透析膜置 入含有1 mM EDTA (pH 8.0)的溶液中沸騰 10 分鐘。冷卻後，將透析膜置於 4℃
中保存。使用前，將透析膜置於蒸餾水中浸泡約30 分鐘，即可使用並進行透析 實驗(圖 6)。
圖5. 透析膜與透析夾
(透析夾即為在透析液體中固定透析膜之用)
圖 6. 透析過程於4℃下進行
三、 硫酸銨(Ammonium sulfate)殘留檢測
硫酸銨為兩價離子，在溶液中搶走附在蛋白質表面(非極性部分)的水分子，
使得非極性部分相互吸引而聚集沉澱(Kunkel et al., 1985)。其原理是因於蛋白質 分子表面電荷的改變，或者分子上極性或非極性區域與水分子間作用結果。透析 法可分離出樣本中的蛋白質。蛋白質在水溶液中的溶解度，會因溶液中其它鹽類 濃度的改變而增減，一般多為加入硫酸銨，利用它來沉澱蛋白質。
經沉澱和透析之後，仍殘留在透析膜內的硫酸銨檢測經沉澱和透析之後，透 析袋中的卵黃水溶液中是否仍有殘留硫酸銨仍須檢驗可利用酸鹼滴定法測知(王 等，2004)。因此本研究利用此法檢驗透析離心後之 LDL 抽出物是否已將殘存之 硫酸銨降至最低，並以此標準作為LDL 抽出物是否適合添加於精液中的門檻。
四、 LDL 抽出物之成份分析 (一) 蛋白質分析
LDL 抽出物在進行 SDS-PAGE 檢測蛋白質樣式(profile)之前，須先進行定量 分析。本研究利用Lowry 法分析鑑定蛋白質的濃度。
Lowry 法其實是雙縮尿（biuret）步驟的延伸。第一步驟乃在鹼性溶液中形
成銅-蛋白質複合物，之後複合物會把磷鉬酸（phosphomolybdic）-磷鎢酸
（phosphotungstate）試劑、斐林試劑（Folin′s reagent）還原成深藍色。在磷鉬酸 化複合物（Folin-Ciocalteu′s 試劑）中，苯酚（phenol）可以還原鉬（molybdenum）。
蛋白質的酪氨酸（tyrosine）殘基可提供酚基，而銅離子可提高反應靈敏性。因 此，當用Folin-Ciocalteu′s 試劑處理後，蛋白質會有藍色反應，顏色深淺則依酪 胺酸之含量而定，一般而言，此法可測20~200 mg/ml 之蛋白質。
步驟中，首先須配製 BSA (bovine serum albumin)標準溶液：0.2, 0.4, 0.6, 0.8 及1.0 mg/ml。取 7 支試管，按下列各項次序添加(體積為 μl)(表 8)：之後，配製 Reagent A (2.0％ Na2CO3, 0.4％ NaOH, 0.16％ sodium tartrate, 1％ SDS)與 Reagent B (4.0％ CuSO4‧5H2O)及 Reagent C (100 ml Reagent A + 1 ml Reagent B)。在 7 支試管中依序添加 BSA 與 Reagent C 溶液後，須在室溫下靜置 10 分鐘。
各加入100 μl 1N Folin-Ciocalteu′s 試劑混合均勻後，在室溫下靜置 30 分鐘。即 以波長為660 nm 之光譜儀進行測定，使用儀器為尚偉公司所生產之 Jasco V-530 Spectrophotometer 來檢測(圖 7)。利用 BSA 標準曲線來算出未知濃度之蛋白質。
表8. Reagent C 溶液與 BSA 溶液添加量(μl)
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 Reagent C 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
BSA 100(0) 100(0.2) 100(0.4) 100(0.6) 100(0.8) 100(1) 100(unknown)
圖 7. 光譜分析儀 (Jasco V-530 Spectrophotometer)
(二) SDS-PAGE 膠體電泳分析
利用蛋白質在電場中不同移動速率依分子量的大小來達到分離的目的。
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis 為變性 (denature)的蛋白質電泳，可依分子量分離出不同大小的蛋白質成分，其後以 CBR (Coomassie Brilliant Blue R-250)染色判讀結果。
藥劑：Acrylamide + bis-acrylamide ( 37.5 : 1 )、APS (ammonium persulfate)、
TEMED、Protein marker、Running buffer 及 Sample buffer。
儀器：SDS-PAGE 電泳槽套組、電源供應器(圖 8 )。
實驗步驟：實驗前須先鑄膠，在下層製膠 Running gel 中，組合置膠器後，
於下層膠體溶液中迅速加入 APS 及 TEMED 混合均勻，注入玻璃板間空隙達孔 梳下1 cm 左右，再注入少量去離子水隔離空氣，靜置凝膠約 30 min。在上層製 膠（Stacking gel）中，將下層膠上方的水分倒掉，同樣於上層膠體溶液中迅速加 入 APS 及 TEMED 混合均勻，注入玻璃板間至上緣，並插入孔梳，靜置凝膠約 30 min。然後，將樣品做前處理，取樣品與 sample buffer 等量混合，水浴 100℃
三分鐘後快速離心取上層液。在電泳操作中，架設電泳裝置套組，將running buffer 倒入電泳槽中，取下孔梳。先將protein marker 取 3~4 μl 注入第一個 wall 中，之
後，分別將處理好的樣品各20 μl 注入 well 內。蓋上電泳槽，連接電極線於電源 供應器，調整電壓至80 V 開始跑電泳約 30 min，至上下膠體間集膠，後電壓調 至120 V 由追蹤染劑觀察蛋白質泳動情形，接近膠體底部時停止電泳(圖 9)。最 後做染色與退染，最常用來偵測蛋白質紋帶的方法是利用染劑Coomassie Brilliant Blue R-250，使得 gel 上的蛋白質紋帶會被固定住(染色約 50 分鐘) ；退染時大部 分dodecyl sulfate 會被 buffer 中的甲醇與醋酸洗去(退染約 15~20 分鐘)。
圖 8. SDS-PAGE 電泳槽套組、電源供應器
圖 9. SDS-PAGE 電泳裝置套組架設
(web.chemistry.gatech.edu/.../page_protein.html)
五、 試驗猪隻
試驗公猪為藍瑞斯純種公猪。猪齡約在 10 月至 36 月齡。所有公猪皆分別圈 養於3.5×2 m2水泥地板之公猪欄內。公猪每日餵食2.5～3.0 公斤含粗蛋白質 17
％及可消化能3,232 仟卡/每公斤之公猪飼料，飲水採任食。
六、 公猪採精方法
精液採集採手握法(圖 11)，採集時手戴拋棄式乳膠(latex)無粉手套(圖 10)。
公猪最初所射出約5 ml 之精液不予採集，因含膠狀物，且只含有少量精子，其 餘精液則使用有刻度之採精瓶(廣口瓶、保溫杯)收集。收集時瓶口覆蓋消毒紗 布，以過濾精液之膠質。採集完畢送回實驗室進行檢驗。
圖 10. 衛生採精(拋棄式乳膠無粉手套)
圖 11. 手握法採精(郭，2002)
精液濃度檢測方法
(2003)所述之方法計算。先用 3％ NaCl 對
稀釋之後，再利用血球計數盤計算精子數 圖 。 ，
在將 稀釋後之公猪稀釋液以 ％ 進行 稀釋。若濃度依然過高時，
則重複以上步驟，直至血球計數盤在顯微鏡下檢測面積內的精子數量大約在 隻時 圖 、 ，即可利用血球計數盤濃度換算公式來計算，以求得原 七、
利用血球計數盤法，係依郭與劉
公猪精液進行1:1 ( 12) 如濃度過高
1:1 3 NaCl 1:1
100~150 ( 13 14) 精液之精子濃度。
圖 12. 檢測公猪精液精子濃度之血球計數盤
圖 13. 檢測精子之位相差顯微鏡 (OLYMPUS CX41)
圖 14. 顯微鏡下之血球計數盤觀察精子數量
八、 精液稀釋
總精子數由精子濃度和精液體積估算，然後添加長生精稀釋液。用大型量筒 量取該體積的稀釋液。稀釋液全程預溫在 35 (℃ 圖 15)。在盛裝原精和稀釋液的 容器內，各置入ㄧ根溫度計，確定原精溫度維持在34~35℃，而稀釋液的溫度為 原精溫度±1℃的範圍之內。將稀釋液沿著容器內壁緩緩倒入盛裝原精的容器內 (圖 16)，輕輕搖勻，使兩者充分混合後，外層以水浴保存(水溫保持在 34~35℃之 間)。靜置待溫度降至室溫(25 )℃ 後，再移入到15~18℃的恆溫箱或 4~6℃冰箱內 儲放。儲存期間每隔24 小時取稀釋精液樣本一個，檢測該樣本之精子活力。
九、 冷凍精液製備
將稀釋精液放入 15℃冷房約 3 小時，並在 15℃遠心分離(800 g, 10 min)。分 離過後棄除上清液，僅取下層之精子部分。然後，將下層精子部分懸浮於 11％
乳糖冷卻稀釋液中，並放入5℃冰箱靜置 2 小時。精子在冷凍前需再添加 11％乳 糖含抗凍劑之冷凍稀釋液(表 3)，將精液添裝入 6 ml 之麥管中，將麥管移入液態
氮上層霧氣中，冷凍20 分鐘。最後，再將之移入液態桶內儲存。(郭，2006)
圖 15. 稀釋液加溫至 35℃
圖 16. 稀釋液沿著容器內壁緩緩倒入原精的容器內
十、 試驗處理
試驗1. 生鮮雞蛋與陳蛋對 LDL 抽出物收集量之影響
一般冷凍精液製作處理過程中所添加之卵黃皆取自農場新鮮採集之雞蛋，而 少用市場販售之雞蛋，因不易掌握其新鮮度之故。且自農場購得之新鮮雞蛋如未 用完，也一定要小心存放於4℃環境中供後續有需要再度製備冷凍精液時之用。
雞蛋之新鮮程度可能會影響 LDL 抽出物的萃取回收率以及品質，故本研究擬比 較新鮮雞蛋(生產 12 小時以內)與陳蛋(儲存一週)儲存以及儲存 4℃雞蛋之 LDL 抽 出物的萃取回收率。新鮮蛋由屏東科技大學畜產系牧場提供。所收取之雞蛋為剛 生產不到12 小時者。攜回實驗室後，這些雞蛋分成三份。一份立即打破，萃取 LDL 抽出物；另ㄧ份則是至於 4℃冰箱冷藏ㄧ週：最後一份置放於室溫下ㄧ週。
放置七天後，分別將蛋打破，收取蛋黃，並萃取其 LDL 抽出物。本實驗各組均 重複兩次，每次均有卵黃100 ml。
試驗2. 透析袋卵黃水溶液含量之多寡對 LDL 抽出物收集量之影響
透析之目的在去除硫酸銨，殘留之硫酸銨可能因會傷害精子而會干擾實驗結 果。由於透析帶內卵黃水溶液之體積多寡可能會影響透析效果，故本試驗使用相 同容積之透析袋，但內裝兩種不同量的卵黃水溶液，其量分別為22.5 ml 和 52.5 ml。兩種內容量之透析袋依相同條件透析 24 小時。最後檢測透析完後之內容物 的pH 值，以最接近原始卵黃的 pH 值(約為 6.0)為殘留硫酸銨最少，而愈低者(40
％硫酸銨之pH 值為 5.31)代表殘留量越多。
試驗3. 硫酸銨添加方式、透析時間長短對 LDL 抽出物收集量之影響
硫酸銨加入的快慢以及多寡(表 12)，會影響到其沉澱非 LDL 蛋白的效果 (Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)，並可能會對 LDL 抽出物之回收率造成影 響。此外，硫酸銨添加之方式和最終濃度也會影響到之後透析所需時間。故本研 究擬比較硫酸銨添加方式和濃度對LDL 抽出物之回收率的影響作一探討。
試驗4. 透析法與鹽析法對 LDL 抽出物收集量之影響
由於硫酸銨加入卵黃水溶液之後的離心和透析所費人力和時間甚繁，而且殘 留的硫酸銨若未能充分去除，添加於精液中將會傷害精子，因此本試驗目的在測 試是否可以不用硫酸銨，而只用NaCl 鹽析即能收取到足夠的 LDL 抽出物。本試 驗共重複兩次，每次樣品使用新鮮的雞蛋卵黃100 ml 除比較 LDL 抽出物的回收 率之外，也以SDS-PAGE 分析蛋白質紋帶。
試驗5. 添加 LDL 抽出物在新鮮(16 )℃ 和冷藏(4 )℃ 精液中對精子之保護效果 本試驗分別添加 LDL 0、4、6、8、10％抽出物至新鮮精液中，原精液採至 純種藍瑞斯公猪，每份原精先均分成兩大份，每一大份再分成5 小份，這 5 小份 分別添加(0、4、6、8、10％)，經充份混和，分別儲存在 16℃和 4℃。前 48 小 時每隔12 小時，與 48 小時之後每隔 24 小時各觀察樣品精子活力ㄧ次。此試驗 目的在測試LDL 抽出物是否具有保護新鮮精液之效果，此外，也了解 LDL 抽出 物之添加是否有助延緩冷休克之效應，且評估最適當之LDL 抽出物添加比例。
試驗6. 添加 LDL 抽出物於冷凍液中對公猪精子冷凍解凍後性狀之影響
本試驗在評估添加 LDL 抽出物至冷凍精液中，對精子經冷凍解凍過程後精 子活力的影響。原精液(raw semen)樣本採自純種藍瑞斯公猪，每個精液樣本再均 分成5 小份。每小份以固定配方之冷凍液稀釋，此外並分別額外添加 LDL 抽出 物 0、4、6、8 或 10%。所有小份之精液經依郭等(1981)所述方法進行超低溫冷 凍。冷凍之精液經解凍後，再以精子活力分析儀NucleoCounter® (SP-100TM)測定 精子之存活率(圖 17)。
圖17. 精子活力分析儀 NucleoCounter® (SP-100TM)
十一、 統計分析
蛋白質濃度測定與精液檢測之差異性，利用 Excel 軟體進行回歸相關分析。
精子存活率資料經 Arcsin 轉型後，以線性模式統計法分析公猪個體效應和 LDL 抽出物添加量之效應，以上資料分析方法均採用SAS 統計套裝軟體(SAS, 2003) 進行分析。
肆、 結果與討論
一、 LDL 抽出物回收率及成分
自 100 ml 卵黃所獲得之 LDL 抽出物約為 47.6g (回收率 47.6%)。化學分析顯 示，此抽出物(圖 18)含水份、粗脂肪以及粗蛋白分別是 82.5％、13.9％及 3.4％。
經充分乾燥後之粗脂肪與粗蛋白含量則分別是80.4％和 17.9％。烘乾前、後之粗 脂肪/粗蛋白比值分別是 4.07 和 4.60，即脂肪與蛋白質比值因烘乾而提升(表 9)。
表 9. 新鮮雞卵黃 LDL 抽出物成份(%)
X±SD (n=4)為新鮮雞卵黃 LDL 抽出物成份之含量 成份 新鮮收集 烘乾後
水份 82.5±3.31 － 粗脂肪 13.9±3.5 80.4±2.8 粗蛋白 3.4±0.8 17.9±3.1 粗脂肪/粗蛋白 4.07±0.07 4.60±0.64
圖 18. LDL 抽出物(包含水分、粗脂肪、粗蛋白)
二、 硫酸銨殘留量之檢測
卵黃中的 β-livetin 會對精子造成傷害。因此，添加硫酸銨之目的，是為了將 卵黃中的β-livetin 沉澱。而透析後，可將透析袋中的硫酸銨析出，使袋中只留下 可保護精子之LDL 抽出物。
由於硫酸銨會對精子造成傷害。透析完成後，為了得知透析袋中的卵黃水溶 液是否仍有硫酸銨之殘留，為測定此卵黃水溶液之pH 值，作為硫酸銨殘留量之 指標。未添加硫酸銨之新鮮卵黃水溶液pH 值為 6.0，當添加 40％硫酸銨後，pH 值降為5.3。因此，經過透析後卵黃水溶液 pH 值若為 6.0 時，則可視為絕大多數 硫酸銨皆析出，此時的 LDL 抽出物方得用於本研究公猪稀釋精液中。經過透析 後卵黃水溶液pH 值若低於 6.0 時，則利用 0.1N NaOH 滴定，將之滴定為 pH 值 6.0，並以 0.1N NaOH 的滴定 ml 數多寡作為硫酸銨殘留量高低之指標。透析袋 內卵黃水溶液體積為50~55 ml 時，pH 值較低，代表其內有硫酸銨殘留，而透析 袋內卵黃水溶液體積為20~25 ml 時，則 pH 接近 6.0，視為硫酸銨殘留量可忽略，
此時之LDL 抽出物可添加於公猪精液中(表 10)。
表10. 卵黃水溶液透析後硫酸銨殘留量之影響
卵黃水溶液體積(ml) n pH 值 0.1N NaOH 量(ml) 添加於公猪精液 50~55 2 5.67±0.05 0.25±0.02 否
20~25 2 6.00±0.01 0.0±0.0 可 註：硫酸銨添加濃度與透析時間皆為40％與 24 小時
三、 蛋白質分析
(一) Lowry method assay 測定溶液中蛋白質之濃度
在 LDL 抽出物的萃取過程中之蛋白質樣品經過 Lowry assay 方法測定蛋白質 濃度後，將所測定之樣品一一紀錄。所測定樣品之吸光值觀察是否落在 BSA 標 準曲線之吸光值範圍中(圖 19)。若是未落於標準曲線內，代表此一樣品須先以
10 倍無菌蒸餾水稀釋後再予測定，若仍未落於標準曲線內，則須另以 20 倍濃度 稀釋，以此類推，直至蛋白質 sample 稀釋落於標準曲線內。將所稀釋之倍數記 錄下來，用於之後SDS-PAGE 膠體電泳實驗。
吸光值
(660nm)
BSA 濃度 (mg/ml) Y=0.2302X－0.0501
R2=0.9972 圖19. BSA 標準濃度吸光值相關分析圖
(二) SDS-PAGE 膠體電泳分析
LDL 抽出物樣品經過 Lowry assay 法測得之蛋白質濃度後，每個樣本檢體皆 取含有0.1 mg/ml 總蛋白的體積，然後與 1:1 等量之 sample buffer 混合後以 95℃
加熱4 分鐘，再將之注入至膠上預鑄之孔中，蛋白質樣品泳動完成後，將 gel 經 染劑Coomassie Brilliant Blue R-250 染色與甲醇與醋酸退染後，觀察依分子量分 離出不同大小的蛋白質成分，確實發現內含有與 LDL 分子量相當之分子。根據 Moussa et al. (2002)報告提出指出 140、80、65、60、15 kD 所呈現的 band 相當 於LDL 的主要 apoprotein，而 LDL 抽出物之分子量主要為 60~65 kD，在 40 kD 的 band 為被 β-livetin 少量污染(圖 20、21)。代表卵黃經過高速離心透析過後，
可以將高密度脂蛋白(HDL)、卵黃球蛋白、卵黃磷醣蛋白、這些對精子有害的物 質去除(Moussa et al., 2002; Hu et al., 2005)，只留下可以保護精子之 LDL 抽出物。
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
140 kD 80 kD 65 kD 60 kD
β-livetin LDL apoprotein
40 kD 97.4 kD
66.2 kD 45 kD 29 kD
20.1 kD
圖20. SDS-PAGE 膠體電泳圖：(1)protein marker；(2)、(3)及(4) 樣本 1.2.3.為原始雞卵黃；(5)、(6)及(7) 樣本 1.2.3.為添加 40％ ammonium sulfate 沉澱物；(8)、(9)及(10) 樣本 1.2.3.之 LDL 抽出物
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)
140 kD 80 kD 65 kD
LDL apoprotein
60 kD
β-livetin 40 kD
97.4 kD 66.2 kD 45 kD 29 kD 20.1 kD
圖21. SDS-PAGE 膠體電泳圖：(1)protein marker；(2)、(3)及(4) 樣本 1.2.3.為鹽析法之 LDL 抽出物；(5)、(6)及(7) 樣本 1.2.3.為透析後上 清液；(8)、(9)及(10) 樣本 1.2.3.之 LDL 抽出物
圖 20，SDS-PAGE 膠體電泳圖中，(2)、(3)及(4)為原始雞卵黃之蛋白質樣品 經過離心透析之後，在(8)、(9)及(10)為 LDL 抽出物樣品所呈現之紋帶較原始雞 卵黃之蛋白質樣品清晰，代表原始雞卵黃經離心透析後可去除對精子有害的物 質，只留下可以保護精子之LDL 抽出物。
圖 21 中，由於加入硫酸銨之後，需要進行長時間透析(24 小時)，且顧慮到，
若有殘留之硫酸銨，會對精子造成外源性傷害，因此在本試驗中另外試做只有氯 化鈉的鹽析組，以期能減除後續長時間透析和殘留硫酸銨之顧慮。經試驗比較單 純鹽析(不加硫酸銨)與合併添加硫酸銨對雞卵黃 LDL 抽出物之影響。經蛋白質 SDS-PAGE 膠體電泳分析，發現鹽析法者 LDL 抽出物中相對上含有較低的 LDL apoproteins(或是相對上較高的 β-livetin) (圖 21)；而合併硫酸銨法，其 β-livetin 含量相對較低。故雖然鹽析法有較高的回收率，但品質上不能符合，故仍以鹽析 合併硫酸銨法較佳。
四、 精液稀釋
原精液經稀釋後，分別存放於 16℃和 4℃，每 24 小時加溫至 37℃後觀察稀 釋精液精子活力ㄧ次，比較兩者不同溫度對稀釋精液中精子之活力。
結果顯示，溫度效應顯著(P＜0.05)，存放時間效應亦顯著(P＜0.05)。儲放於 16℃之稀釋精液較保存於 4℃之稀釋精液更能保有精子活力(圖 22)。由於儲放溫 度與儲存天數之間的交感效應達顯著水準(P＜0.05)，此顯示，保存於 4℃之稀釋 精液較其保存於16℃的，精子其活力隨存放時間增加而有較大幅的下降。
精子活力不低於 70％為稀釋精液的基本要求，則顯示，儲放於 16℃溫度的 稀釋精液，其保存可達3 天，而存放於 4℃者僅能放置 2 天。至於存放在 4℃的 稀釋精液，在儲放 2 天期間的配種效果是否如儲放 16℃達 3 天之稀釋精液有相 同結果，此仍有待後續田間試驗測試，方能知曉。
精子活力
( ％ )
16℃
4℃
0 1 2 3 4 5 天
圖22. 稀釋精液保存於 16℃與 4℃對精子保存期間活力之影響
註：觀察精子活力前皆加溫至37℃再做觀察
五、 試驗結果
試驗1. 生鮮雞蛋與陳蛋對 LDL 抽出物收集量之影響
比較生鮮雞蛋(剛生產 12 小時內)、儲放 4℃及室溫之陳蛋(放置ㄧ週)之 LDL 抽出物回收量每一處理組各作二重覆，每重覆各使用7 顆雞蛋，其最初收集之卵 黃體積均為100 ml，離心透析之後，發現三組之 LDL 抽出物之含量有極顯著差 異(P＜0.01)。其中生鮮雞蛋之 LDL 抽出物回收量為 48.0±0.4 ml，而 4℃陳蛋組 為11.0±0.6 ml，室溫陳蛋組為 5.1±0.5 ml，三組平均值之差異均達極顯著水準(表 11)。顯然儲放一週導致 LDL 抽出物大幅降低，而低溫儲存有其延緩因儲存而導 致降低LDL 抽出物的效果。故本試驗結果可證明生鮮雞蛋絕對富含豐富的 LDL 萃取物。因此本研究採用生鮮雞蛋之 LDL 抽出物添加於公猪精液中，以改善公 猪冷凍精液之品質。
表 11. 儲存對雞蛋 LDL 抽出物含量之影響
雞蛋來源 n LDL 抽出物(ml) 生鮮雞蛋 2 48.0±0.4a 存放於 4℃之陳蛋 11.0±0.62 b 存放於室溫之陳蛋 2 5.1±0.5c
(陳蛋為存放一週內)
註：表中數字有a,b,c 不同上標者代表差異極顯著 (P＜0.01)
試驗2. 透析袋卵黃水溶液含量之多寡對 LDL 抽出物收集量之影響
本 試 驗 所 用 之 透 析 膜 是 默 克 公 司 所 生 產 之 Spectra/Por®1-7 Dialysis Membranes(圖 5)，透析前須將透析膜剪成適當長度約 15 cm，透析袋內卵黃水 溶液約可裝90~100 ml。在預備試驗中曾觀察到，若是透析袋內卵黃水溶液添裝 50~55 ml 或裝 20~25 ml 時，經過透析離心實驗後，裝 50~55 ml 者 LDL 抽出物 含量為25.6 ml；裝 20~25 ml 者 LDL 抽出物含量為 47 ml。本試驗目的即在比較 這兩種添加量對透析袋中卵黃水溶液的pH 值影響(pH 值可反映硫酸銨殘留量之 狀態，見本論文前述p.41)。經二重複試驗後發現，透析袋內裝 50~55 ml 卵黃水 溶液者較裝20~25 ml 者，透析離心後 LDL 抽出物收集量來得少(表 12)。此可能 因為透析袋內裝50~55 ml 卵黃水溶液者在透析過程中，由於透析袋會過度膨脹 無法達到透析袋內與袋外之平衡，造成透析袋內的硫酸銨也無法完全透析於袋 外。因此，本試驗結果顯示，在透析袋內裝25 ml 卵黃水溶液要較裝 50 ml 者有 較多的LDL 抽出物和較低的硫酸銨殘留量。
表12. 透析袋內卵黃水溶液含量之多寡與 LDL 抽出物收集量之影響
毎袋卵黃水溶液(ml) n LDL 抽出物(ml) pH 值 硫酸銨殘留判定 50 2 25.6±1.8b 5.7±0.0b 有 25 2 47.0±0.6a 6.0±0.0a 無
註：表中數字有a,b 不同上標者代表差異顯著(P＜0.05)
試驗3. 硫酸銨添加方式、透析時間長短對 LDL 抽出物收集量之影響
硫酸銨加入的多寡以及加入的快慢方式皆會影響到其沉澱蛋白的效果，並對 所要收集的蛋白抽出物造成影響。此外，硫酸銨之最終濃度亦會對影響透析結 果。故本試驗特別針對硫酸銨添加方式對透析時間以及 LDL 抽出物回收率之影 響作ㄧ比較。試驗中分別添加 30％、40％、50％的硫酸銨，經二重覆透析離心 實驗後，發現不同濃度的硫酸銨添加量，對於透析所需之時間與 LDL 抽出物呈 現明顯不同之差異(表 13)。試驗結果中，發現 40％硫酸銨添加量之濃度，經硫 酸銨殘留量檢測時並無硫酸銨殘留，最適的透析時間為24 小時。然而，添加 30
％硫酸銨者有較多的 LDL 抽出物含量，經透析離心後檢測雖無硫酸銨殘留，但 是仍有一些β-livetin 和其他未明紋帶未被完全沉澱(參圖 23)。由於 β-livetin 會對 公猪精子造成傷害，所以暫不考慮採用此硫酸銨之濃度。在添加50％硫酸銨者，
經離心後所有卵黃中的物質包括 LDL、HDL、β-livetin 及 phosvitin 大部分皆被 沉澱下來，且對精子有用之物質LDL 也被沉澱下來，卵黃水溶液呈現澄清狀態，
所以也不建議採用此硫酸銨之濃度。
表13. 硫酸銨添加之濃度及透析時間對 LDL 抽出物含量及硫酸銨殘留量之影響 硫酸銨 LDL抽出物含量(ml) pH值 硫酸銨殘留判定 濃度(％) 22hr 24hr 26hr 22hr 24hr 26hr
30％ 48.4±0.4Ba 52.9±0.3Aa 52.9±0.3Aa 5.6±0.0Bb 6.0±0.0Aa 6.0±0.0Aa 無 40％ 44.4±0.0Bb 48.0±0.4Ab 48.2±0.4Ab 5.8±0.0Ba 6.0±0.0Aa 6.0±0.0Aa 無 50％ 0.0±0.0Ac 0.0±0.0Ac 0.0±0.0Ac NA NA NA NA
註：表中同列數字有A,B,C 不同上標者代表顯著差異(P＜0.05) 同行數字有 a,b,c 不同上標者代表顯著差異(P＜0.05)
