肉毒桿菌神經毒素作用之機轉

肉毒桿菌神經毒素(Botulinum Neurotoxin)是由肉毒桿菌(Clostridium Botulinum)此菌種所分離出的一種神經毒素，依血清特性分類為七種亞型：

A、B、C、D、E、F、G(Hatheway 1995)。每一種有其不同的分子大小、結構、

以及不同的強度。其中類型A 及類型B 在臨床實驗上已證實其毒性達到安全 而有效的可使用範圍(Naumann, Albanese et al. 2006)。

肉毒桿菌最早用於醫學治療是在 1977 年。美國眼科醫師 Alan B. Scott，

首次用Ａ型毒素來治療斜眼(Strabismus)病人，此後也逐漸運用在臨床上，

如：肌張力異常疾病 (Dystonic spasms)、肌纖維顫動(Myokymia)、下顎關 節病變之肌肉痙攣 (Temporomandibular joint associated muscle spasm)、

顫抖症(Tremor)、眼瞼痙攣、半面痙攣、斜視、小兒腦性麻痺及美容醫學、除

ㄧ、肉毒桿菌神經毒素之藥理作用 heavy chain (100KDa) (amino acids 449-1280)藉由一個雙硫鍵(disulfide) 接著一條輕鏈 light chain (50KDa) (amino acids 1-448)的結構，此輕鏈 light chain 上會連接有一鋅原子（zinc atom）。(Turton, Chaddock et al.

2002)(參見圖 1)。

重鏈扮演的角色則是負責去附著在神經細胞膜上，讓輕鏈可以經「胞飲作 用」進入細胞內。輕鏈具有蛋白質酶(protease)的功能（zinc endopeptidase），

其功能為連接並分解一種接合蛋白SNARE(soluble N-ethyl-maleimide

sensitive factor attachment protein receptor) complex。其中，B、D、F、

G型肉毒桿菌素會去連接並分解VAMP（vesicle-associated membrane protein）

synaptobrevin 蛋白質；而A、C、E型肉毒桿菌素則會分解SNAP－25 (25 kDa

synaptosome-associated protein) 蛋白質；此外C型肉毒桿菌素還可以分解 syntaxin蛋白質。這些蛋白質均會參與乙醯膽鹼囊泡（acetylcholine

containing vesicles）和突觸前神經細胞膜融合的過程。(Turton, Chaddock et al. 2002)（參見圖2）。 (Hay 2001; Setler 2002) (Billante, Zealear et al. 2002) 。

二、肉毒桿菌神經毒素的作用機轉

肉毒桿菌作用時會有三個階段：(1)internalization (2) disulfide reduction and translocation (3) inhibition of neurotransmitter release 要 了 解 肉 毒 桿 菌 素 的 作 用 原 理 ， 則 必 須 先 了 解 神 經 肌 肉 接 合 處 (neuromuscular junction)的生理作用。神經終板藉由動作電位的傳導形成 電位差而造成突觸前細胞膜上的鈣離子通道開啟，釋放出儲存在膜內囊泡內

vesicle pathway。肉毒桿菌神經毒素附著在神經突觸終端的細胞膜上，可藉 由胞飲作用(endocytosis)將雙鏈的多肽形式（重鏈＋輕鏈）帶入神經細胞膜 內。接著雙硫鍵結會瓦解，重鏈中的N-terminal half會幫助輕鏈結構穿過 endosomal membrane進入細胞液(cytosol)中，然後輕鏈會去連接VAMP

（vesicle-associated membrane protein）蛋白質（B、D、F、G型肉毒桿菌）、

SNAP－25 (25 kDa synaptosome-associated protein) 蛋白質（A、C、E型 肉毒桿菌），以及syntaxin蛋白質（C型肉毒桿菌）。並藉由zinc endopeptidase 將蛋白質分解，使乙醯膽鹼囊泡無法附著在神經細胞膜上與細胞膜融合進行 exocytosis，進而阻斷末梢神經中的膽鹼性神經終端(cholinergic nerve ending)鈣離子通道的正常釋放與回收作用，造成突觸前神經之乙醯膽鹼素 間聯繫，使肌肉放鬆無法收縮，導致肌肉久而不用自然地萎縮(Setler 2002)。

三、肉毒桿菌素的作用時間

肉毒桿菌神經毒素所造成麻痺效果的作用時間長短，與神經末端類 型及肉毒桿菌神經毒素的種類有關。 在人體肌肉神經交接處的作用，恢 復期約需 2 至 4 個月；自律神經系統的恢復期則較長(Naumann, Jost et al. 1999)。而肉毒桿菌神經毒素 A 型在動物實驗中的作用時間是最長。

肉毒桿菌神經毒素並不會造成神經元死亡，只是對膽鹼性神經的傳 導造成短暫性且可逆性的抑制。受肉毒桿菌神經毒素影響處，仍有自發 性的突觸活動，但功效降低，神經傳導物質釋放較少，傳導過程緩慢。

神經終端功能的復原速度與毒素經由神經末端代謝的速度，及神經細胞 替換受傷害的 SNARE 蛋白質的速度有關。而復原的機制則包括了：神經 軸索終端出芽生長（axon sprouting）、神經終板（additional motor endplate）的生長，以及被分解的 SNARE 蛋白質的再生。

(Jurasinski, Lieth et al. 2001)。

四、神經軸索終端的修復

施打肉毒桿菌後，肌肉功能的復原需要神經出芽生長(nerve

sprouting) 。新的運動神經軸索終端在肉毒桿菌神經毒素施打後約2至4天開 始出芽生長noncollateral sprouting，1至2周內形成新的突觸，5至10周達 到高峰。 4周後，出芽生長的神經終端可使肌肉產生活動力。 8周後，母體 神經終端開始復原，出芽生長的神經終端活動慢慢降低。 3個月後，母體神 經終端即可恢復正常功能。

第六節 肉毒桿菌神經毒素作用於肌肉後肌肉組織的變化 索外觀並未改變(Porter, Strebeck et al. 1991)。

施打肉毒桿菌神經毒素於兔子肌肉的實驗中發現，肌纖維直徑變 小 ， 乙 醯 膽 鹼 酶 (acetylcholinesterase) 的 染 色 強 度 增 加 (Borodic 1994)。 神經元及神經束的大小及數目並未改變，亦無發炎現象產生 (Langer, Birnbaum et al. 1997)。

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型於大白鼠腓腸肌的實驗發現，肌肉之濕 量(muscle wet mass)顯著低於未施打側肌肉之濕量。 施打肉毒桿菌神 經毒素之肌肉有明顯萎縮情形，且平均肌肉纖維橫斷面積(mean fiber cross-sectional area)較小 (Chen, Stott et al. 2002)。

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型與 F 型於大白鼠腓腸肌的實驗發現：注射肉 毒桿菌經過 22 週後，F 型注射側肌肉重量和控制組無顯著差異；而 A 型注射 側肌肉之重量則顯著低於未施打側肌肉之重量。施打 A 型肉毒桿菌 10u 之肌 肉有明顯萎縮情形，肌纖維直徑、密度均明顯變小；其中，type II fiber 肌 纖維直徑減小的情形尤為明顯(Billante, Zealear et al. 2002)。

在施打肉毒桿菌神經毒素於猴子眼外肌肉 42 至 56 天後的觀察則發現肌 纖維的形態趨於正常(Spencer and McNeer 1987)。 施打肉毒桿菌神經毒素 於猴子眼瞼肌肉後 63 天的觀察中則發現，肌纖維的大小有顯著的恢復，但仍 比未施打肉毒桿菌神經毒素的肌纖維小(Porter, Strebeck et al. 1991) 。

第七節 肌電圖的基本原理

肌電圖（electromyographt，簡稱 EMG）可用在肌肉動作的研究，透過顯 示肌電訊號可用來描述與分析肌肉的狀況。 許多肌細胞稱為一個運動單位（motor unit）(參見圖 3)。位於軸突末端接觸 的肌肉細胞膜具有特化的性質，稱為運動終板（motor endplate），而軸突 末端與運動終板的連結稱為神經肌肉連結（neuromuscular junction）。

當刺激電位抵達軸突的末鞘造成運動終板的去極化，引發可被電極偵測 到的肌肉細胞動作電位（muscle fiber action potential），進而產生肌肉 的收縮（參見圖 4）。假設在時間等於 0 的時候產生一動作電位刺激肌肉，電 位發出刺激與肌肉產生收縮之間會有一段時間差，大約是 10ms。骨骼肌肌細 胞上的刺激電位持續時間在 1-2ms，在還沒有機械活性開始前就已經結束。一 旦啟動，接在電位後產生的機械活性可持續 100ms 或更長的時間。

收縮的肌肉施加於外界的力量俗稱--張力（tension）。運動神經元所產 生肌肉刺激電位稱為—運動單元動作電位（motor unit action potential）。

固定單元的肌肉細胞在張力活性進行中，對接踵而來的電位刺激會增加其張

1.時域分析（Time domain analysis）

時域分析的評估方法包括均方根值（Root Mean Square，RMS）與全波整 流（full-wave rectification）的肌電活動（electrical activity，EA）。

這兩種方法主要都是在運算一段時間內訊號的強度（amplitude）；在相對條 件下肌電訊號強度越強代表肌肉施力越多。使用 RMS 計算肌電訊號強度，多 是將肌電訊號輸入電腦中再進行軟體分析。EA 分析則是搭配於硬體中，擷取 EMG 訊號後經過全波整流與低通濾波所獲得的結果。

2.頻域分析（Frequency domain analysis）

將時域的 EMG 訊號經過快速傅利葉方法（Fast Fourier Transform， FFT）

所得到全部時間的頻譜圖形，稱為功率頻譜密度（power spectral density，

PSD）。在肌電訊號頻譜分析中，最常被使用的是中位頻率（Median Frequency，

MDF）以及平均頻率（Mean Power Frequency，MPF），此兩參數代表其功率 頻譜的平均頻率值。

由於肌電分析的一部份，是要獲得 EMG 訊號在時間上的變化，因此當擷 取下來一長串的 EMG 訊號後，多會將訊號以相同的訊號點數，分割成許多小 片段（window），並且計算每個片段訊號的 EA、RMS、MDF、MPF 等等數值。

如此便可知道在不同時間片段中肌肉的收縮強度與頻率的表現。

肌肉在持續收縮過程中，隨著時間的進行，肌肉會出現疲乏的現象，動 作電位傳導速率會下降，其功率頻率（power spectral）會向低頻位移；也 就是肌電訊號低頻部分功率密度（power spectral density）提高而高頻部 分降低。以往的研究已指出，在一些疲勞或癱瘓的肌肉，中位頻率及平均頻 率會出現向低頻位移的現象(Lee, Fu et al. 1994; Finsterer 2001; Toffola, Sparpaglione et al. 2001; Lin, Liang et al. 2004) (Roberto Merletti, Philip Parker 2004) 。

第八節 肉毒桿菌神經毒素作用後肌電圖訊號的變化

注射不同劑量的肉毒桿菌神經毒素 A 型於大白鼠 tibialis anterior muscle（0.02 ~ 20.0 units），並於腓神經（peroneal nerve）包埋電極給 予電刺激，之後觀察肌肉切片 glycogen 含量：若肉毒桿菌神經毒素阻斷神經 肌肉訊息的效果越佳，則肌肉對電刺激的反應會越差，且肌肉切片 glycogen 含量也會越高。實驗結果結果顯示：1.最有效的注射位置：注射點越接近肌 肉 motor endplate 區域，其效果越好。2.隨著注射的劑量越高，肌肉癱瘓的 程度越大；但是當劑量超過 5.0 units 時，肌肉癱瘓的程度就沒有再顯著的 增加(Shaari and Sanders 1993)。

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型於大白鼠後肢屈肌，並連續記錄肌電訊號 28 週，結果顯示：注射 botox 後 5~7 天，電位振幅 CMAP（compound muscle action potential amplitude）和肌肉力量（muscle force）均顯著下降；接著逐漸 以線性的關係逐漸地復原。電位振幅和肌肉力量下降的程度和復原的速度和 botox 注射劑量有關；且電位振幅的恢復會優先於肌肉力量的回復。對側控制 組的後肢屈肌則沒有顯著的變化發生(Cichon, McCaffrey et al. 1995)。

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型於大白鼠咽部肌肉，並於注射前及注射後三

著地下降。劑量越高（0.0007~0.7 U），聲帶運動及肌電訊號下降情形越顯 著；而當劑量超過 0.7 U（0.7 ~7U）將造成大鼠窒息死亡。肉毒桿菌神經毒 素劑量大於 0.07 U 時，藥劑也會滲透至對側咽部肌肉，並影響對側控制組肌 肉的活動(Inagi, Connor et al. 1998)。

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型與 F 型於大白鼠腓腸肌的實驗發現：在相同 劑量的條件下，A 型肉毒桿菌對於神經訊息傳遞阻斷的程度（neuromuscular blockade）與作用時間(time course)均優於 F 型肉毒桿菌。其中，A 型肉毒 桿菌對於抑制肌電訊號的作用期間平均約為 90~110 天；且劑量越高，阻斷肌 電訊號的功效越好，藥效也越長。在劑量方面：0.625~1.25 u 的 A 型肉毒桿

注射肉毒桿菌神經毒素 A 型與 F 型於大白鼠腓腸肌的實驗發現：在相同 劑量的條件下，A 型肉毒桿菌對於神經訊息傳遞阻斷的程度（neuromuscular blockade）與作用時間(time course)均優於 F 型肉毒桿菌。其中，A 型肉毒 桿菌對於抑制肌電訊號的作用期間平均約為 90~110 天；且劑量越高，阻斷肌 電訊號的功效越好，藥效也越長。在劑量方面：0.625~1.25 u 的 A 型肉毒桿