第三章、 結果
3. 蛋白酶活性分析
以酶譜法(Zymography)分析醱酵上清液中的蛋白酶活性(圖二十)，透明的 條帶代表膠體中的明膠被分解，無法以 CBR 染劑染色。由條帶粗細可觀察到，
蛋白酶活性隨誘導天數上升，並隨著甲醇添加速率上升有增加的趨勢。
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圖 十二、轉形株 His11 以 BSM 進行甲醇誘導之醱酵槽參數圖-
His11 以含 4%甘油的 BSM 培養，再以 50%甘油批次饋料 5 到 6 小時，總誘導時間 120 小時，甲醇添加速率 2.5 mL/L/h。
Figure 12. His11 transformant induced by methanol fed with fermenter control. The batch culture is 2 L BSM medium.
圖 十三、BSM 培養基醱酵上清液 SDS-PAGE 分析
總誘導時間 120 小時，以 15%SDS-PAGE 進行蛋白質電泳，每個樣品槽加入 20 µl 不 同誘導時間之胞外上清液，再以 CBR 染色。M 為 Protein marker，P 為搖瓶誘導第 5 天之上清液。
Figure 13. SDS-PAGE of fermentation culture supernatant of transformant His11. M:
protein marker; P: flask culture supernatant of transformant His11.
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圖 十四、轉形株 His11 以 BMMY 進行甲醇誘導之醱酵參數圖
His11 以含 4%甘油的 BMGY 培養，再以 50%甘油批次饋料 5 到 6 小時，回收菌體 並置換成 BMMY 培養基，總誘導時間 120 小時。甲醇添加速率(a) 1.3 mL/L/h，(b) 1.7 mL/L/h，(c) 2.6 mL/L/h。
Figure 14. His11 transformant induced by methanol fed with fermenter control. The batch culture is 2 L BMGY . After glycerol fed-batch, harvest the cells by centrifugation, resuspend cell pellet in 2 L BMMY. Methanol induction rate: (a) 1.3 mL/L/h, (b) 1.7 mL/L/h, (c) 2.6 mL/L/h.
圖 十五、轉形株 His11 以 BMMY 進行甲醇誘導之生菌數及吸光值
His11 以含 4%甘油的 BMGY 培養，回收菌體並置換成 BMMY 培養基，分別以(a) 2.6 (b) 1.7 (c) 1.3 mL/L/h 的速率添加甲醇，每 24 小時取樣測定生菌數、OD600、
胞外培養液總可溶蛋白質濃度。
Figure 15. His11 transformant induced by methanol fed with fermenter control. The batch culture is 2 L BMGY . After glycerol fed-batch, harvest the cells by centrifugation, resuspend cell pellet in 2 L BMMY. Methanol induction rate: (a) 1.3 mL/L/h, (b) 1.7 mL/L/h, (c) 2.6 mL/L/h.
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圖 十六、BMMY 培養基醱酵上清液 SDS-PAGE 及西方墨點法分析
總誘導時間 120 小時，每個樣品槽加入 20 µl 不同誘導時間之胞外上清液進 行蛋白質電泳及西方墨點分析，1 次抗體為 anti-his 5000 倍稀釋，2 次抗體為 anti-rabbit 5000 倍稀釋。(a)誘導 0-60 小時上清液以 15% SDS-PAGE 進行 CBR 染色 (b)西方墨點分析
Figure 16. SDS-PAGE of fermentation culture supernatant of transformant His11 after methanol induction 0-60 h (a) and Western blot analysis (b). SDS-PAGE of supernatant after methanol induction 0-60 h
圖 十七、不同甲醇添加速率醱酵上清液 SDS-PAGE 分析
分別以 2.6、1.7、1.3 mL/L/h 的速率添加甲醇，並在誘導後第 3~5 天每 24 小時 取樣進行 SDS-PAGE 分析，P 為搖瓶誘導第 5 天之上清液。
Figure 17. SDS-PAGE of fermentation culture supernatant of transformant His11 in different methanol induction rate: 1.3, 1.7, 2.6 mL/L/h. M: protein marker; P: flask culture supernatant of transformant His11.
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圖 十八、降溫誘導醱酵參數圖
His11 以含 4%甘油的 BMGY 培養，再以 50%甘油批次饋料 5 到 6 小時，回收菌體 並置換成 BMMY 培養基，同時將培養溫度由 30oC 降至 23oC，總誘導時間 120 小 時，甲醇添加速率 2.5 mL/L/h。
Figure 18. His11 transformant induced by methanol fed with fermenter control. The batch culture is 2 L BMGY . After glycerol fed-batch, harvest the cells by centrifugation, resuspend cell pellet in 2 L BMMY, culture at 23oC. Methanol induction rate: 2.5 mL/L/h.
圖 十九、降溫誘導醱酵上清液 SDS-PAGE 分析
His11 以含 4%甘油的 BMGY 培養，回收菌體並置換成 BMMY 培養基，以 23oC，
甲醇添加速率 2.5 mL/L/h 進行誘導，總誘導時間 120 小時，每個樣品槽加入 20 µl 不同誘導時間之胞外上清液進行 SDS-PAGE 分析。
Figure 19. SDS-PAGE of fermentation culture supernatant of transformant His11, methanol induction rate: 2.5 mL/L/h, culture at 23oC. M: protein marker; P: flask culture supernatant of transformant His11.
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圖 二十、醱酵槽上清液蛋白酶活性分析
以酶譜法測試培養基上清液中的蛋白酶活性，透明條帶即代表礁體內的明膠被蛋 白酶分解。比較(a)醱酵槽培養基(甲醇添加速率 2.6 mL/L/h)與搖瓶培養基，(b)醱酵 槽甲醇添加速率 2.6 mL/L/h 與 1.3 mL/L/h，(c)醱酵槽甲醇添加速率 2.6 mL/L/h，誘 導溫度 30oC 與 23oC 的蛋白酶活性差異。
Figure 20. Zymography analysis of proteolytic activity in supernatant. Comparing of (a) fermenter and flask, (b) methanol feeding rate 2.6 mL/L/h and 1.3 mL/L/h, (c) induction temperature 30oC and 23oC at methanol feeding rate 2.6 mL/L/h.