將載玻片置於 Olympus AX70 螢光顯微鏡下觀察。觀察時，照 射波長 355 nm 的激發光，可見 DAPI 放出 450 nm 的藍色螢光；照 射波長 495 nm 的激發光，Texas red 放出 615 nm 紅色螢光，而 fluorescein 放出 515 nm 綠色螢光。以 Fujicolor Superia 200彩色底片 照相，並利用冷卻 CCD (cooled charged-coupled device) 照相，將影 像數位化後輸入電腦，再以軟體 Adobe Photoshop 處理。
參、結果
ㄧ、染色體的觀察
三種蝴蝶蘭原生種 P. fasciata、P. mariae 和 P. pallens 皆具 38 條染色體，其中 P. fasciata 具 28 條小型染色體及 10 條中型 染色體；P. mariae 具 30 條小型染色體及 8 條中型染色體；而 P.
pallens 則具 26 條小型染色體及 12 條中型染色體。它們的染色
體 大 都 屬 於 中 位 中 節 (metacentric) 或 次 中 位 中 節 (submetacentric)，且均未觀察到具衛星體的染色體 ( 圖 2)。綜合 整理如表 2。二、螢光原位雜交
5S rDNA 以 digoxigenin-11-dUTP 標定，與蝴蝶蘭的根尖細 胞進行原位雜交，以與 fluorescein 結合的 anti-digoxigenin 偵 測，在照射波長 495 nm 的激發光下，標定部位發出綠色螢光；
而 45S rDNA 以 biotin-16-dUTP 標定，以有 Texas red 結合的 avidin 偵測，在照射波長 495 nm 的激發光下，標定部位發出紅 色螢光；染色體則以 DAPI 對比染色，在照射波長 355 nm 的激 發光下，染色體呈現藍色螢光。P. fasciata 之 5S rDNA 在一對 小型染色體的末端呈現訊號，強度相同，而 45S rDNA 則位於 另 外 一 對 小 型 染 色 體 的 末 端 ， 但 訊 號 強 度 呈 現 多 型 性 (polymorphism) (圖 3A)；P. mariae 與 P. pallens 之 5S rDNA 均
圖 2：三種蝴蝶蘭原生種的核型。(A) P. fasciata；(B) P. mariae；(C)
P. pallens 。 箭 頭 所 指 為 中 型 染 色 體 。 比 例 尺 為 10 μm 。
B
C
A
表 2：三種蝴蝶蘭原生種的染色體數目、大小及 DNA 含量。
Taxona 2n Chromosome size (µm)b Nuclear DNA contentc
< 2.0 2.0~2.5 > 2.5 (pg/2C) Phalaenopsis
Subgenus Polychilos Section Amboinenses
P. fasciata 38 28 10 0 6.56±0.07
P. mariae 38 30 8 0 6.48±0.11
P. pallens 38 26 12 0 －
a: Christenson (2001) b: Kao et al. (2001)
c: Lin et al. (2001)
圖 3：以 5S 及 45S rDNA 為探針，與三種蝴蝶蘭原生種有絲分裂中 期染色體進行雙標的螢光原位雜交的結果。(A) P. fasciata；(B) P.
mariae；(C) P. pallens。其中 5S rDNA 呈現綠色訊號 ( 以箭頭標
示 )，45S rDNA 呈現紅色訊號 ( 以箭號標示 )，染色體以 DAPI 對比 染色，呈現藍色。比例尺為 10 μm。A
B
C
在一對小型染色體的末端呈現訊號，而 45S rDNA 則位於另外 一對小型染色體的末端，兩種 rDNA 的訊號強度皆無差異 (圖 3B, 3C)。綜合整理如表 3。
表 3：三種蝴蝶蘭原生種 5S 及 45S rDNA 基因座的數目及位置。
5S rDNA loci 45S rDNA loci
Taxona Chromosome size (µm) Polymorphism Chromosome size (µm) Polymorphism
< 2.0 2.0-2.5 > 2.5 < 2.0 2.0-2.5 > 2.5
Phalaenopsis
subgenus Polychilos
section Amboinenses
P. fasciata 2Tb － 2T ＋
P. mariae 2T － 2T －
P. pallens 2T － 2T －
a: Christenson (2001)
b: T, terminal site
肆、討論
蝴蝶蘭 Amboinensis 節共包含 22 個原生種 (Christenson, 2001)，
本 研 究 室 至 目 前 為 止 共 探 討 了 9 個物種，包括 P. fasciata、P.
mariae、P. pallens、P. lueddemanniana、P. bastianii、P. pulchra、P.
amboinensis、P. venosa 和 P. violace
a，皆具 38 條染色體 (Kao et al., 2001； 陳, 2009； 本實驗 )。其中 P. fasciata、P. mariae、P.pallens、P. lueddemanniana、P. bastianii 及 P. pulchra 均含有中型與
小型染色體，且大都屬於中位中節或次中位中節，核型較對稱，DNA 含量介於 6.37 ~ 6.56 pg/2C 之間；然而其它三個物種 P.
amboinensis、P. venosa 和 P. violacea 則具大、中、小型染色體，且
大都屬於次末端中節 (subtelocentric) 或近端中節 (acrocentric)，核型 較不對稱，三者 DNA 含量介於 9.52 ~ 15.03 pg/2C 之間 (Kao et al., 2001； Lin et al., 2001； 陳, 2009； 表 4)。因此，藉由染色體形態 和 DNA 含量，可將此 9 個物種分為兩群。一般利用傳統染色法可觀察具衛星體的染色體，藉以判斷 45S rDNA 在染色體的位置，然而本實驗的三種蝴蝶蘭 P. fasciata、P.
mariae 及 P. pallens，均未觀察到具衛星體的染色體 ( 圖 2)，利用 5S
及 45S rDNA 進行雙標的螢光原位雜交，則可偵測到 rDNA 的訊號 ( 圖 3)。Srisuwan 等人 (2006) 利用傳統染色法觀察 5 種蕃薯屬 (Ipomoea) 的植物 I. triloba、I. trifida (2n = 2x = 30)、I. setosa、I.tabascana 及 I. trifida (2n = 4x = 60)，發現它們分別只有 2、2、1、1
表 4：22 種蝴蝶蘭原生種之染色體大小及 DNA 含量。
和 4 對的染色體具有衛星體，但利用螢光原位雜交卻偵測到各具 3、3、2、5 和 5 對 45S rDNA 的基因座，顯示螢光原位雜交較靈 敏，可以解決傳統染色法無法偵測的問題。
除少數物種外，絕大部份的真核生物 5S 及 45S rDNA 位於不同 的染色體上 (Lapitan, 1992)。本實驗之 3 種蝴蝶蘭，李 (2002) 探討的 7 種蝴蝶蘭，李 (2007) 進行的 7 種蝴蝶蘭，彭 (2007) 觀察的朵麗 蘭，以及陳 (2009) 研究的 4 種蝴蝶蘭，兩種 rDNA 在這 22 個物種 皆位於不同的染色體上 ( 表 5)。
螢光原位雜交除了可偵測目標序列的位置外，亦可依訊號強弱 定量出序列拷貝數 (copy number) 的多寡。rDNA 屬於頭尾相接型之 重複性序列，拷貝數的差異是由不均等交換作用 (unequal crossing over) 所造成的 (Flavell, 1985)。本研究室已探討的 22 種蝴蝶蘭中，
其中 45S rDNA 在 P. fasciata、P. mannii、P. celebensis 和 P. amabilis 以及 5S rDNA 在 P. aphrodite、P. philippinensis 和 P. equestris 均呈 現多型性，顯示 rDNA 的拷貝數有差異 ( 表 5)。
rDNA 的實質分佈，可用來分析物種間的親緣關係。Singh 等人 (2001) 利用螢光原位雜交將 rDNA 定 位 於 16 種二倍體大豆屬 (Glycine) 的植物 (2n = 40)，發現莢果呈彎曲型的兩個物種 G. curvata 及 G. cyrtoloba 具兩對 45S rDNA 基因座，而其餘莢果呈筆直狀的 14 個物種，僅具ㄧ對 45S rDNA 基因座，且此兩群的植物雜交後產生 的 子 代 均 為 不 孕 性 ， 顯 示 兩 群 的 植 物 親 缘 關 係 疏 遠 。
表 5：兩種 rDNA 在 22 種蝴蝶蘭原生種染色體上的分佈。
b: T, terminal site; I, interstitial site
c: 1: 本研究； 2: 陳 (2009)； 3: 李 (2002)； 4: 李 (2007)； 5: 彭 (2007)
* polymorphism
九種蝴蝶蘭原生種進行 rDNA 實質定位的結果，P. fasciata、P.
mariae、P. pallens、P. lueddemanniana、P. bastianii 及 P. pulchra 各
具一對 5S rDNA 及 45S rDNA 基因座，且均位於小型染色體的末 端；然而 P. amboinensis、P. venosa 和 P. violacea 卻各具有 1、1、2 對 5S rDNA 基因座及 7、5、4 對 45S rDNA 基因座，且 5S rDNA 皆 位於大型染色體，而 45S rDNA 則大都位於小型染色體的末端，僅 少部份出現在中型染色體的末端 ( 表 5)，顯示兩群植物有明顯差 異。過去高 (2001) 曾利用 5S rDNA 之 IGS 序列分析 28 種蝴蝶蘭原 生種，結果 P. fasciata、P. mariae、P. pallens、P. lueddemanniana 及P. pulchra 歸為一群，而 P. amboinensis、P. venosa 與 P. violacea 則
屬於另一群。Tsai 等人 (2006) 利用 45S rDNA 的 ITS 序列建立親缘 關係樹亦將此九物種分為兩群。再綜合 rDNA 實質定位、染色體形 態以及 DNA 的含量，均有助於此 9 種蝴蝶蘭在親緣關係上的確 認。Amboinenses 節的 22 個蝴蝶蘭原生種，Tsai 等人 (2006) 共探討
了 19 個 物 種 ， 並 依 ITS 序 列 將 其 分 為 7 群 ， 因 此 並 不 支 持 Christenson (2001) 的分類結果。目前本研究室僅探討其中 9 個物 種，未來如果有更多物種的研究來佐證，則更能釐清蝴蝶蘭物種的 親緣關係，將有利於更進一步的分類。伍、參考文獻
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