蠶絲蛋白質的性質分析

2. 3. 1 ──分子量分析

由於蠶絲蛋白質具有多種蛋白質成分組合而成，所以必須先將蠶絲蛋白 質製成帶電分子，再經電泳原理將蛋白質做分離，帶電分子在電場中會被電 流移動，是為泳動；其泳動的大小程度稱為泳動率 (mobility)。蛋白質的相 對泳動率(R_f )與分子上電荷密度(q)，所施加的電壓(E) 成正比，而與其分子 摩擦力成反比，電泳即是利用各種蛋白質在電場中不同的移動速率來達到分 離的目的。

Polyacrylamide gel 組成：主成份是 acrylamide 組成網狀直鏈結構與 BIS (N,N-methylene bisacrylamide)組成網狀的支鏈結構，在加入 APS (ammonium persulfate)與 TEMED (N,N,N,N-tertramethyl-ethylenediamine) ，產生氧化自 由基與開始聚合(polymerization)反應，膠體孔洞大小取決於 acrylamide 總濃 度，濃度越大，孔洞越小。 其聚合反應如圖 2-1 與圖 2-2

A . P oly m e riz a tion of a c ry la m ide

在膠體中加入一種 detergent 為 sodium dodecyl sulfate(SDS)用來使蛋白質變 性(denature)，SDS 會與蛋白質結合使一有摺疊構形蛋白質拉成直鏈狀之一 級結構，此複合體均帶負電，所以在膠體中移動率僅與蛋白質分子量有關。

電泳的裝置在本實驗中為 slab gel(如下圖 2-3)，利用兩片玻璃白板組成的空 隙形成膠體，膠體分為兩層，上層為 stacking gel 孔洞較大，目的是讓樣品 中的蛋白質在進入 separating gel 前被壓縮成一直線(在 stacking gel 中為

pH6.8，此時緩衝液中 glycine 不帶電跑最慢，而氯離子跑最快，蛋白質被夾

2-3 跑膠的裝置

中間)，下層為 separating gel，pH 值為 8.8，此時 glycine 變為帶負電移動

來偵測蛋白質 bands 的方法是利用一染劑 Coomassie Brilliant Blue

所需器材及試劑

R-250，使得 gel 上的蛋白質 bands 會被固定，而大部分 dodecyl sulfate 會被 buffer 中的甲醇與醋酸洗去。所以跑 SDS-PAGE 是一種最常使用來分析蛋白 質純度與定量的方法，尤其是在進行蛋白質純化時，若此酵素沒有一個適當

Separating gel ８%

Acrylamide-Bis 2.67 ml 10% SDS 100 ul 0.5M Tris-HCl (pH=6.8) 1.25ml

30% Acrylamide-Bis 650 ul 10% SDS 50 ul 10% APS 25 ul TEMED 10 ul 5X Sample buffer

ddH₂O ml dillute the sample at least 1:4 with sample buffer store in –20~-70℃

Gel stock solution

All gel stock solution filtered through millipore 0.45

μm

(N,N’-methylene bis-acrylamide) 300g acrylamide dissolved in ddH₂O, add ddH₂O to 1 liter Store at 4℃ in dark

1% Bis-Acrylamide g bis-acrylamide dissolved in ddH₂O, add ddH₂O to 0.5 liter 5

M Tris pH8.8,

Stacking Buffer---1M Tris pH6.8

Make to 1 liter ddH₂O adjust pH to 6.8 Store at 4℃

20% SDS Store at room temperature

20 g SDS dissolved in ddH₂O , add final H₂O to 100 ml

10X Electrode Buffer Stock, pH8.3

2O Store at 4℃

) 30g Tris-base

10g SDS make to 1 liter ddH

1X Electrode Buffer (made from 10X ute to 1X electrode buffer when used Dil

Gel Stain-Coomassie Blue

1.5 g coomassie Blue Dissolve dye in methanol first Store at room temperature

·10%APS and TEMED

·Satured Tert-butanol in dd

·Protein Marker

用水先試驗會不會漏)。

2. 依上述配方的順序依次加入，配製下層膠(separating gel)加到整片 gel 的 2/3 的地方(當 APS 與 TEMED 加入時聚合反應即開始，混合均勻後

11. Coomassie brilliant Blue R250 染色 20 分鐘。

12. 用 destain buffer I 去染色 20 分鐘。

13. 用 destain buffer II 去染至隔天。

14. 用玻璃紙封膠，把膠放於燒杯頂上，先放一片玻璃片，放上弄濕的玻璃 紙並倒上一些水，再把膠放上去，用另一玻璃紙蓋上(小心儘量不要有 (

2.3.2 高效能液相層析儀分析 ( HPLC ) 針對各個小分子進行定量或定性的分析，HPLC 系統包含 L-2100 pump、

L-2200 Autosampler、L-2450 diode array detector，實驗中所用的管柱(colum 型號為 BioSep-SEC-S4000，在注入蠶絲蛋白質溶液之前，必須先用 0.2μm

filter 進行過濾，以除去多餘雜質，移動相( mobile phase)用蠶絲蛋白質保存 溶液 (即 buffer I )，流速(flow rate)設定為 1mL/min，觀測波長為 280nm，時