奈米粒子與蛋白質的互相影響

國 立 交 通 大 學

奈 米 科 技 研 究 所

碩 士 論 文

奈米粒子與蛋白質的互相影響

Interaction between Nanoparticles and Protein

研究生: 陳永昌 Yung-Chang Chen

學 號: 9452518

指導教授: 黃國華 博士 Dr.Guewha Steven Huang

中 文 摘 要

實驗一: 蠶絲是蠶在變態過程中重要的產物，蠶絲蛋白質是一種具有 良好透氣與透濕性、無毒、無刺激與人體相容性強的生物材料，所以蠶絲 蛋白已經開始被開發成為醫學材料如：人造皮膚、血管、肌腱、韌帶、骨 骼和牙齒等人造組織。在本實驗中，我們將利用分子生物的技術來分析蠶 絲蛋白的生物、物理及化學特性，之後，導入奈米尺度的微觀模式，以自 組裝結構成型技術，在不外加任何能量的方式，讓蠶絲蛋白質在適當的環 境條件下，進行自組裝程序，使其從無序狀態轉化成有序狀態，組成奈米 尺度的絲線狀結構，而後，可以發展新的高效能的純化方法，得到純度更 高的蠶絲蛋白質奈米絲狀結構，並將這些高純度的自組裝奈米結構，作導 電度、熱導性、光學性質等分析，例如若其導電性質跟半導體的元件相當 或更好的話，就可以將奈米蠶絲蛋白自組裝絲線應用在元件上，以提高元 件效能等的相關發展應用。 關鍵詞：蠶絲蛋白質；自組裝結構

實驗二： 現今具有奈米科技技術的商品不斷被開發出來，其應用的領域 相當廣泛，當使用這些奈米化技術商品所帶來的好處同時，它也有可能會 帶來危害，所以為了探討奈米科技化技術的議題，實驗二將以不同的奈米 粒子注入老鼠體內，觀察其免疫反應，利用酵素免疫分析法（Enzyme-linked

immunoassay, 簡稱 ELISA），再以結合含有量子點（quantum dot）的二級

誌 謝

回想起在奈米所不長不短的兩年時間裡，發現自己成長許多，不論 是實驗上的真功夫，或者是心態上的成長，都有著明顯的轉變，在此真的 要感謝許多人的幫忙，首先要感謝是我的指導老師 黃國華 博士，從老 師對實驗上嚴謹的要求、簡報的設計、數據的分析以及報告的方式、技巧 都不厭其煩的一一親自指導，非常感謝老師的耐心教導。 接下來要感謝是師母對實驗室的付出，除了三不五時的準備餐點給大 家享用之外，也對大家在生活上的問題給予大力的幫助，而且師母也是實 驗室的心靈導師，當有問題的時候，師母總是在第一時間就毫不客氣的給 予指正，真的是實驗室重要幕後推手，非常感謝師母對我以及大家照顧。 實驗室就是一個團隊，雖然每個人都有各自的實驗進行，也因此每個 人都各具本領，先感謝凱明學長，當實驗遇到狀況時，凱明學長總會適時 出現幫忙技術指導一番，生活上也扮演著大哥哥的腳色，照應我們這群小 弟，還要感謝大勳學長，雖然他是辛苦的扮演著黑臉的腳色幫忙管理實驗 室，在實驗研究成果上，他是大家學習的好榜樣，在來最要感謝的是志杰、 禮閣和嘉偉，大家總會互相鼓勵求進步，我喜歡這種感覺，當有問題發生 或是狀況出現的時候，大家總是會好心的伸出援手，還要感謝學弟們高超 和新堯，在實驗上的幫忙，謝謝高超提供你的汽車，帶我去拿實驗用的樣 品，還有新堯熱心的擔任化學小老師，由衷的感謝大家。

目 錄

中文摘要 ……… I 誌 謝 ……… III 目 錄 ……… IV 圖目錄 ……… VI 表目錄 ……… VIII 第一章 介紹 ……… 1 第二章 實驗設計、步驟與方法 ……… 18 實驗一： 一. 2.1 蠶絲絲囊的取得 ……… 19 2.2 蠶絲蛋白質保存溶液的配置 ……… 19 2.3 蠶絲蛋白質的性質分析 ……… 20 2.3.1 SDS-PAGE 蛋白質電泳分離技術 ……… 20 2.3.2 高效能液相層析儀( HPLC ) 分析 ……… 26 2.4 蠶絲蛋白質自組裝結構成型 ……… 26 實驗二： 二. 2.1 抗體製備 ……… 28 2.2 酵素免疫分析法……… 28

第三章 結果與討論 ……… 31 一. 3.1 蠶絲絲囊的取得 ……… 31 3.2 蠶絲蛋白質保存溶液的配置 ……… 32 3.3 SDS-PAGE 蛋白質電泳分離技術 ……… 34 3.4 高效能液相層析儀分析 ( HPLC ) ……… 36 3.5 蠶絲蛋白質自組裝結構成型 ……… 37 二. 3.1 酵素免疫分析法 ……… 40 3.2 接合含有量子點(Quantum-dots)的二級抗體作顯色觀察 …… 40 第四章 結論 ……… 44 參考文獻 ……… 47

圖 目 錄

圖1.1 蠶絲絲囊的分段方式 ……… 6 圖1.2 分段絲囊的2D膠結果 ……… 6 圖1.3 被成功標認出的93個蠶絲蛋白質點 ……… 6 圖 1.5-1 pS(4+1)蛋白質結構示意圖 ……… 11 圖 1.5-2 類蜘蛛絲合成蛋白自組裝結構之AFM圖 ……… 12 圖 1.5-3 類蜘蛛絲合成蛋白自組裝之結構分析 ……… 12 圖 1.5-4 液體狀態蜘蛛絲蛋白質之二級結構預測圖 ……… 13 圖 1.6 KFE8在保存溶液中形成自組裝結構的介穩定狀態(AFM) … 14 圖 1.7-1 自組裝結構奈米管辨認金粒子實驗流程 ……… 15 圖 1.7-2 金粒子與自組裝奈米管接合的TEM圖 ……… 16 圖 2-1 丙烯醯胺聚合反應 ……… 21 圖 2-2 丙烯醯胺聚合成網狀結構 ……… 21 圖 2-3 跑膠的裝置 ……… 22 圖 2.4 抗體反應示意圖 ……… 30 圖 3-1 家蠶的蠶絲絲囊 ……… 31 圖 3-2 蠶絲蛋白質保存溶液穩定區域 ……… 33 圖 3-3 蠶絲絲囊在 4℃與-80℃保存的結果比較 ……… 34

圖 3-5 蠶絲蛋白質在 280nm 的 elution time ……… 36

圖 3-6 蠶絲蛋白質的奈米自組裝結構 ……… 38

圖 3-7 不同奈米粒子的 ELISA 結果 ……… 40

表 目 錄

表格 1.4-1 被標認出的93個蠶絲蛋白質點的資訊 ……… 6

表格 1.4-2 被標認出的93個蠶絲蛋白質點的資訊 ……… 6

表格 1.4-3 被標認出的93個蠶絲蛋白質點的資訊 ……… 6

第一章 介 紹

1.1 蠶絲在蠶轉變成蛹的變態過程，扮演著保護蛹的重要腳色，蠶絲是 天然蛋白質所產生的絲線，蠶絲本身質量輕，但卻可保護蛹免去許多外來 的破壞；因為蠶絲是蠶藉由吃桑葉後，將桑葉在體內經由絲囊做蛋白質的 轉變過程，所以蠶絲蛋白質是一種天然蛋白質，對人體而言，它無毒、無 害、無刺激性而且其與生物的相容性極佳，也因此蠶絲蛋白質被開發出成 為有用的醫學材料，如：人造皮膚、血管、肌腱、韌帶、骨骼和牙齒等人 造組織。蠶絲蛋白質還有良好的透氣性與保濕能力、抗 UV 的保護作用以 及促進膠原蛋白分泌等效果，蠶絲蛋白質也發展成為化妝和美容的用品。 蠶絲質地輕，但其保護與保暖的功能極佳，可將其開發成為軍事上和民生 用品的保護用途的工具，亦可以做為環保領域上的應用。 綜合上述的了解，可知蠶絲蛋白質的應用領域相當廣泛，本實驗將以 奈米尺度的微觀模式來研發蠶絲蛋白質的功能性，以自組裝成型的方式形 成奈米生物材料，量測當其形成奈米尺度的生物結構時，其量子效應所主 導的物性行為，如：導電性、熱傳性、光學特性等分析，並可針對性質發 揮其應用之外，可再進一步了解蠶絲蛋白質形成奈米自組裝結構的機制， 從中可以學習並模凝蛋白質分子自體組合的系統模式，以應用於多維的構 造控制，並進而以高效率和低耗能的方法，加速發展分子光電元件、奈米 級感測陣列晶片等的製造與分析方法。

1.2 從文獻回顧中來了解蠶絲蛋白質，先對蠶絲蛋白質的成份認識說

起，在2001年時，日本科學家1_{利用作出cDNA的方式，來分析蠶絲蛋白質}

中小分子量的胺基酸排序的結果，被分析到的小分子量蛋白質分別為seroin 1 和 seroin 2 (9.9KDa 和 10.3KDa) 以 及 BmSPI 1 和 BmSPI 2 (6KDa 和 4.7KDa)，這些只有對少部份的蠶絲蛋白分析結果。 在2002年時，美國國家研究機構6_{，以蜘蛛絲蛋白質作分析(蜘蛛絲蛋} 白在固化後跟蠶絲蛋白質一樣會形成絲線結構)，先在蜘蛛絲上用C13_做同 位素標定，接著用酸解的方式將蜘蛛絲蛋白做分解，並且以HPLC和 Mass-Spectrometry分析其成分，發現成分中Glycine佔58%和Alanine佔31% 為最主要的兩種胺基酸，對成分的了解有助於之後solid –state NMR的結構 分析。 到2006年，日本國家研究團隊與中國的研究團隊共同合作2_{，將蠶絲蛋} 白質做整體的分析，將蠶絲絲囊分段的蛋白質以西方墨點法(Western Blotting)的2D膠上做整體分析，2D膠的實驗結果發現大約有400個蛋白質 點，並且用抗體接合的方法來辨認各個蛋白質點，結果總共有93個蛋白質 點被成功的標認出來，其實驗結果如下圖表所示：圖1.1 蠶絲絲囊的分段 方式：圖1.2 分段絲囊的2D膠結果；圖1.3 被成功標認出的93個蠶絲蛋白 質點；表格1.1 被標認出的93個蠶絲蛋白質點的資訊

圖1.1 蠶絲絲囊的分段方式

1.3 就蛋白質的結構分析而言，在參考文獻28中有實驗設計是利用高解 析度固態C13_{同位素NMR來分析蠶絲的胜肽鍵結結構，蠶絲蛋白質結構大} 致上分成3種形式：(i)由高度重覆的AGSGAG單體(共有432複製品)組成的 結晶區域，(ii)由重複性較低的GAGAGY和/或GAGAGVGY單體(分別有120 個和11個複製品)共同組合成的半結晶的區域，(iii)第三種形式是類型i的衍 生物，如AGSGAGAAS所形成的非結晶區域，此非結晶區域通常帶負電、 具有極性且是體積較大的親水性區域，結合這三種形式的結構後，這也是 蠶絲蛋白質具有超級二級結構的主要原因。

Silk I和silk II是兩種結晶形式，經由X-ray繞射方法、Infra-red觀察和13

C 加15

N同位素固態NMR光譜儀的結果發現到是同種二形物，silk I是液態的 蠶絲蛋白質在形成絲之前的固體結構，silk II則是液態的蠶絲蛋白質形成絲 之後的固體結構，可藉由化學方法讓silk I轉變成silk II，例如：將液體狀態 的蠶絲蛋白質或其胜肽鍵結構溶解在9 M LiBr溶液裡，接著用去離子水作 透析，這樣就可以得到silk I的結晶結構，若繼續將silk I結構泡在甲酸溶液 中(formic acid)，之後進行乾燥，就會形成silk II的結構，結構的轉變可藉 由chemical shift和碳鍵的共振模式作很明顯的區分和辨別。這是蠶絲蛋白 質所擁有的特殊性質。

跟蠶絲蛋白質具有類似特性的蜘蛛絲蛋白質，在結構的研究上有顯著 的進步，例如：使用高解析度的原子力顯微鏡 (atomic force microscopy

AFM)10，將類似蜘蛛絲蛋白的成分和結構的單分子結構合成類蜘蛛絲蛋白 作掃描分析，此結構由兩種單分子聚合而成，為SPI和SPII序列，SPI序列 為poly(A)[poly-(alanine)]和poly(GA)[poly-(glycy-alanine)]所組成的16個胺 基酸排列，側鍊再加上22個胺基酸所組成的富含glycine的GGX單體，SPII 序列則為12個胺基酸所構成的2個GPGGX單體，之後藉由基因選植表現之 後，蛋白質組成結果為[(SPI)4 + SPII]4的重複排列結構，可以形成奈米纖維 狀的結構，作者將此結構稱為pS(4+1)，結果的如下圖所示： 圖 1.5-1 pS(4+1)蛋白質結構示意圖

之後將此合成的類蜘蛛絲蛋白質結構進行AFM掃描，可發現結構的結 果跟蛋白質排列示意圖中所描述的幾乎相近，蛋白質結構掃描後的AFM 圖：

圖 1.5-3 類蜘蛛絲合成蛋白自組裝之結構分析

從圖中，我們可以明顯發現結構的形狀是螺旋狀以及摺板狀一起組成 的，呈現整齊而且重複出現的奈米纖維結構，與之前預測的原始蜘蛛絲蛋

圖 1.5-4 液體狀態蜘蛛絲蛋白質之二級結構預測圖 此研究團隊也利用了AFM的探針對奈米纖維作細微的機械性質量 測，而且有實驗顯示蠶絲蛋白質與蜘蛛絲蛋白質性質相近，所以相信這些 方法都值得去學習跟利用。 對於蠶絲蛋白質二級結構的認識非常重要，因為我們可以預測當蠶絲 蛋白質作自組裝結構之後，所會形成的形狀，我們預測會形成奈米纖維狀 或者是管狀的形式。同樣的，可以參考不同種類蛋白質會形成自組裝結構 的方式以及應用。

候，隨時間改變的結構變化情形，藉由AFM作為觀測的工具，觀察每個時 間點的介穩定狀態結構，實驗方法為先將KFE8溶解在穩定的保存溶液當 中，讓保存溶液能夠在室溫中作保存，並且藉由控制保存溶液的濃度和酸 鹼值(pH值)，來避免因為溶液中的離子不穩定而造成有析出物產生，接著 將這個含有KFE8的溶液在雲母片上形成自組裝結構，並且設定觀測的時間 點來看介穩定的結構狀態，實驗結果如下圖： 圖 1.6 KFE8在保存溶液中形成自組裝結構的介穩定狀態(AFM)

時，用電子顯微鏡觀察到的結果；ｂ.35分鐘之後的結果；ｃ.2小時後的結 果；ｄ.30小時後的結果，由此可見，自組裝結構會隨時間慢慢轉變成更複 雜的結構，了解蛋白質形成自組裝結構的機制是非常重要的，這有助於作 蠶絲蛋白質的自組裝結構的條件設定。 除了了解自組裝的機制之外，自組裝結構的應用變得更令人感興趣 了，例如：使用利用有機胜肽鍵所形成的自組裝結構來辨認奈米金粒子12_， 用diphenylalanine做自組裝，最後會形成共軸的奈米管狀結構，第二步是加 入銀離子，讓銀離子填滿奈米管的中空部份，並且將銀離子做還原，第三 步再將奈米管接合含有硫氫鍵(-SH)的diphenylalanine，接著第四步就是加 入金粒子，這樣金粒子就會被奈米管表面的硫氫鍵接合。實驗的流程圖如 下： 圖 1.7-1 自組裝結構奈米管辨認金粒子實驗流程

圖 1.7-2 金粒子與自組裝奈米管接合的TEM圖 從上圖的結果可以清楚看出，自組裝奈米管的表面有修飾硫氫鍵跟沒 有硫氫鍵，對於金粒子在表面上的接合，會有很明顯的差異，在上圖的左 圖當中，c圖表示奈米結構表面無修飾硫氫鍵，所以幾乎沒有金粒子接合上 去，而d圖表示結構表面有修飾硫氫鍵，所以就很容易與金粒子接合，上 圖的右圖是d圖放大的結果，從圖中更可以明顯的看出，金粒子也會隨著 表面修飾的硫氫鍵做具有方向性的接合。 1.5 在選作此實驗之前，搜尋到幾篇的相關研究論文，其中的一篇11是 將選用的鞭毛狀蛋白質做自組裝的奈米結構成型，並且針對這種特殊形狀 的奈米結構作分析，利用螢光顯微鏡、transmission electron microscopy (TEM)以及光學性質的量測，希望藉由此種新式的奈米結構，讓它發展成 為具功能性的蛋白質，而本實驗將學習這些觀念並朝著此方向來做。

主要原因有二，一. 蠶絲蛋白質可藉由一定程度的培養，來獲得較大量而 且品質較佳的蠶絲蛋白質，這對於實驗的進行相當有利，可排除掉很多的 失敗因素，第二. 截至目前為止，大家對蠶絲蛋白質的研究僅停留在分析 其組成成分和探討其分子量大小的地步，並未做更進一步深入探討和發 展，而在本實驗中除了做成分分析以及分子量定量之外，將朝著在上面所 論述的方向來進行研究，以更微觀的角度，再結合生物分子自組裝的觀念 和模式導入實驗方法，讓蠶絲蛋白質形成奈米結構構型，分析其在奈米尺 度中所具有的量子物性行為、光學性質、導電性和熱傳度等，讓蠶絲蛋白 的應用更多元且更加強化其功能性。

第二章 實驗設計、步驟與方法

實驗一: ▲ 實驗設計流程圖： 1. 取得蠶絲絲囊與萃取蠶絲蛋白 2. 蠶絲蛋白質保存溶液的測試與配置 3. 蠶絲蛋白性質分析 3-1 SDS-PAGE 蛋白質 電泳分離技術 3-2 HPLC 高效能液 相層析儀 4. 蠶絲蛋白質自組裝奈米結構成型

▲ 實驗方法與步驟： 一. 2.1 蠶絲絲囊的取得 蠶在成蟲時期，每隔七天會脫皮一次，脫皮一次稱二齡蠶，脫皮二次 稱三齡蠶，成蟲到結蛹前總共會脫皮四次，所以欲取得大量的蠶絲蛋白質 必須解剖五齡蠶的蠶絲絲囊，本實驗所用的蠶的種類是家蠶(Bombyx mori)，取得蠶絲蛋白之後，必須將蠶絲蛋白保存在能夠讓蛋白質穩定又不 變性的化學溶液中，以利之後的自組裝結構形成。 一. 2.2 蠶絲蛋白質保存溶液的配置 蠶絲蛋白質也是蛋白質的一種，蛋白質容易在空氣中氧化且變性，所 以保持蠶絲蛋白質的活性變的相當重要，利用製作相圖的方式來找出能夠 讓蠶絲蛋白質穩定存在的保存溶液。相圖的條件設計分別有溶液中的鹽類 溶度、酸鹼度以及保存溫度，條件範圍如下： 1. KCl (鹽類)濃度： 0~600mM 2. 加入磷酸根(NaH2PO4)來調整溶液酸鹼度： pH= 2.0~10.0 3. 加入尿素(Urea)濃度：0~4M 4. 保存溫度有3種：4℃、-30℃、-80℃ 溶液的配置均必須用二次水（milli Q water）以避免水溶劑中不必要的離子 雜質干擾蛋白質，並且須經過0.25μm的filter過濾，以確保溶液的潔淨度。

在這些條件之內，找出最適合蠶絲蛋白質穩定存在的條件範圍。 一. 2.3 蠶絲蛋白質的性質分析 2. 3. 1 ──分子量分析 由於蠶絲蛋白質具有多種蛋白質成分組合而成，所以必須先將蠶絲蛋白 質製成帶電分子，再經電泳原理將蛋白質做分離，帶電分子在電場中會被電 流移動，是為泳動；其泳動的大小程度稱為泳動率 (mobility)。蛋白質的相 對泳動率(Rf )與分子上電荷密度(q)，所施加的電壓(E) 成正比，而與其分子 摩擦力成反比，電泳即是利用各種蛋白質在電場中不同的移動速率來達到分 離的目的。

Polyacrylamide gel 組成：主成份是 acrylamide 組成網狀直鏈結構與 BIS (N,N-methylene bisacrylamide)組成網狀的支鏈結構，在加入 APS (ammonium persulfate)與 TEMED (N,N,N,N-tertramethyl-ethylenediamine) ，產生氧化自 由基與開始聚合(polymerization)反應，膠體孔洞大小取決於 acrylamide 總濃

A . P oly m e riz a tion of a c ry la m ide SO4 nCH2 CH CONH 2 n H2C CH CONH 2 CH2 CH CONH 2 nCH3 CH CONH 2 S2O8 + T E M E D

B . R e a ction in v olv e d in cr oss-lin kin g a cr y la m ide ch a in s SO4- + nCH2 C CONH ₂ + H2C CH C O NH ) CH2 2 CH2 CH CH2 CH CONH 2 CH2 CH O _NH CH2 CH C O C O NH CH2 NH C O NH CH2 NH C O CH H2C CH2 CH CONH ₂ H2 C HC CH H₂ C CH CONH 2 C H2 C O NH CH2 H N O CH H2 C H2 C CH H2 C CH CONH 2 C O _NH CH CONH 2 H2 C H C C O _NH H₂C ( 圖 2-1 丙烯醯胺聚合反應 圖 2-2 丙烯醯胺聚合成網狀結構

在膠體中加入一種 detergent 為 sodium dodecyl sulfate(SDS)用來使蛋白質變 性(denature)，SDS 會與蛋白質結合使一有摺疊構形蛋白質拉成直鏈狀之一 級結構，此複合體均帶負電，所以在膠體中移動率僅與蛋白質分子量有關。 電泳的裝置在本實驗中為 slab gel(如下圖 2-3)，利用兩片玻璃白板組成的空 隙形成膠體，膠體分為兩層，上層為 stacking gel 孔洞較大，目的是讓樣品 中的蛋白質在進入 separating gel 前被壓縮成一直線(在 stacking gel 中為

pH6.8，此時緩衝液中 glycine 不帶電跑最慢，而氯離子跑最快，蛋白質被夾

2-3 跑膠的裝置

中間)，下層為 separating gel，pH 值為 8.8，此時 glycine 變為帶負電移動

來偵測蛋白質 bands 的方法是利用一染劑 Coomassie Brilliant Blue

所需器材及試劑 ；2. spacer、comb；3. 夾子兩個；4. 電泳槽；5. Power Su 圖 在 最快，再來是氯離子，而蛋白質則因其孔洞較小，為主要利用分子量大小分 離之。 而最常用

R-250，使得 gel 上的蛋白質 bands 會被固定，而大部分 dodecyl sulfate 會被 buffer 中的甲醇與醋酸洗去。所以跑 SDS-PAGE 是一種最常使用來分析蛋白 質純度與定量的方法，尤其是在進行蛋白質純化時，若此酵素沒有一個適當 的活性分析的方法時，可以利用 SDS-PAGE 來判斷之。 器材： 1. 玻璃片、白板各一片 pply；6. 塑膠盒一個；7. Incubator；8. 錐形瓶兩個；9. 塑膠吸管；10. 玻 璃紙

Separating gel ８% 8% H2O 4.68 ml 1.5M T is-HCl (p ) r H=8.8 2.5 ml 30% Acrylamide-Bis 2.67 ml 10% SDS 100 ul 10% APS 50 ul TEMED 10 ul Stacking gel ４% 4% H2O 3.05 ml 0.5M Tris-HCl (pH=6.8) 1.25ml 30% Acrylamide-Bis 650 ul 10% SDS 50 ul 10% APS 25 ul TEMED 10 ul 5X Sample buffer ddH2O ml 6.8 1.7 ml

,and heat at 95℃,5 min 4.0 0.5M Tris-HCl, pH Glycerol 5.0 ml 20%(w/v)SDS 0.5 ml 2-mercaptoethanol 2.0 ml 0.05%(w/v)bromophenol blue 4~8 mg total 10.0 ml dillute the sample at least 1:4 with sample buffer store in –20~-70℃

Gel stock solution

All gel stock solution filtered through millipore 0.45 μm 30% Acrylamide

(N,N’-methylene bis-acrylamide) 300g acrylamide dissolved in ddH2O, add ddH2O to 1 liter

Store at 4℃ in dark

1% Bis-Acrylamide

g bis-acrylamide dissolved in ddH2O, add ddH2O to 0.5 liter

M Tris pH8.8, Separation Gel Buffer--- 1

4.6 g Tris-Hcl (MW 158) 2

102.6 g Tris-base (MW 121.1) Make to 1 liter ddH2O, Store at 4℃ Stacking Buffer---1M Tris pH6.8

121.1 g Tris base + HCl

Make to 1 liter ddH2O adjust pH to 6.8 Store at 4℃

20% SDS Store at room temperature

20 g SDS dissolved in ddH2O , add final H2O to 100 ml 10X Electrode Buffer Stock, pH8.3

144g glycine 2O Store at 4℃ ) 30g Tris-base 10g SDS make to 1 liter ddH

1X Electrode Buffer (made from 10X ute to 1X electrode buffer when used Dil

Gel Stain-Coomassie Blue

1.5 g coomassie Blue Dissolve dye in methanol first )

Store at room temperature 500ml methanol(absolute

500ml ddH2O

100ml acetic acid

Destain solution I Destain solution II

Methanol 400ml Methanol 50ml acid 120ml

H2O

Acetic acid 100ml Acetic

ddH2O 500ml ddH2O 880ml

Store at room temperature ·10%APS and TEMED ·Satured Tert-butanol in dd ·Protein Marker

用水先試驗會不會漏)。

2. 依上述配方的順序依次加入，配製下層膠(separating gel)加到整片 gel 的 2/3 的地方(當 APS 與 TEMED 加入時聚合反應即開始，混合均勻後 須盡快倒入)。 3. 加入 ethanol(可蓋過一層薄薄的量即可，不需太多)壓平 gel，進行聚合 反應約 30 分鐘。 4. 倒掉 ethanol，用水輕輕沖洗。 5. 同樣依上述步驟配製上層 gel 後，插入尺梳(comb)，進行聚合約 30 分鐘。 6. 樣品配製：加入 5X sample buffer(最後稀釋成 1X)。 7. 樣品於 95 ℃，加熱 10 分鐘後待冷卻。 8. 倒入 running buffer 於電泳槽中。 9. 將樣品小心注入 well 中(注意不要讓 sample 飄起)。 10. 進行電泳(一開始用 80 伏特電壓，待 dye 跑至下層 gel 時，電壓可加大 至 100 伏特電壓，直至 dye 跑到 gel 底下還未完全跑掉時即可關掉)。 11. Coomassie brilliant Blue R250 染色 20 分鐘。

12. 用 destain buffer I 去染色 20 分鐘。 13. 用 destain buffer II 去染至隔天。

14. 用玻璃紙封膠，把膠放於燒杯頂上，先放一片玻璃片，放上弄濕的玻璃 紙並倒上一些水，再把膠放上去，用另一玻璃紙蓋上(小心儘量不要有 (

2.3.2 高效能液相層析儀分析 ( HPLC ) 相層析分離過程，主要是由各 ，利用 n) . 2.4 蠶絲蛋白質自組裝結構成型 Assembly)是存在於化學及生化系統 氣泡 )待其自然乾。 液 成分物質與固定相之間相互作用 移動相極性強度將不同成分物質沖提分離出來。利用 HPLC 分析蠶絲蛋白 的光吸收值，及了解蠶絲蛋白質的分子量大小，若有分離出小分子的話，再 針對各個小分子進行定量或定性的分析，HPLC 系統包含 L-2100 pump、 L-2200 Autosampler、L-2450 diode array detector，實驗中所用的管柱(colum 型號為 BioSep-SEC-S4000，在注入蠶絲蛋白質溶液之前，必須先用 0.2μm filter 進行過濾，以除去多餘雜質，移動相( mobile phase)用蠶絲蛋白質保存 溶液 (即 buffer I )，流速(flow rate)設定為 1mL/min，觀測波長為 280nm，時 間設為 20 分鐘。 一 自組裝奈米技術： 「自組裝」(Self-中隨處可見的一種自然現象，其主要是指多種不同組成的分子，受到分子 間非共價鍵作用力的影響，依熱力學原理以最穩定之狀態組合，而自然發 生自組裝排列的現象。其特色為以非常簡單而直接形成奈米大小的分子，

存溶液中的蠶絲蛋白質藉由參數的設定與控制來找出讓蠶 /mL。 箱。 各組的結果先進行SEM觀察前的 開發潛力。 將置於保 絲蛋白質行成自組裝結構的最佳條件，參數設定和範圍如下： (1) 蛋白質濃度(UV-OD280nm)：1.0mg/mL；0.5mg/mL；0.25mg (2) 乾燥時間：1 week；3 days；1 days 。

(3) 乾燥溫度： 25 ℃；37 ℃；50℃。 (4) 溶液 PH 值：8.0；7.0；6.0。 (5) 自組裝的環境：乾燥箱 ; 培養 依照上述的五種參數條件去進行實驗，將 固定處理，固定的步驟為加入戊二醛(GLUTARALDEHYDE)與已成型的蠶 絲蛋白質自組裝結構作用 30 分鐘，目的是讓蠶絲蛋白質的自組裝結構能 夠固定於乾淨的矽晶圓上，接著加入PBS buffer清洗，再來加入鋨酸溶液 (OsO )作用 30 分鐘，加入鋨酸的目的是利用重金屬染色的原理使我們的結 果在SEM觀察下得到更好的對比效果，緊接著在做梯度酒精的脫水動作， 酒精的梯度順序為 50%；60%；70%；80%；90%；95%；100%(無水酒精)， 每個梯度分別作用 5 分鐘，從 50%到 90%的梯度作用一次，95%作用兩次， 無水酒精作用三次，最後再加入HMDS ( 4 hexamethyldisilazane)幫助脫水，之 後用JEOL 6700 SEM (10KV，10mA，Field Emission Gun) 來觀察，並找 出如預期的絲狀或是管狀結構與最佳的實驗參數。

成分和不同大小的奈米粒子注入老鼠體內，奈米粒子的種類 small size 實驗二: 抗體製備 二. 2.1 將不同 有ZnO和TiO2，各有兩種尺寸，如下方表格所示： large size ZnO 90~220 nm 20 nm TiO2 10~40 nm 5 nm 用的老鼠品系為 BALB/c，並分別先將這四種奈米粒子抗原跟乳化劑結 行解剖，進行取血與取內臟，取的內臟部分包含有腦、 選 合之後，再注入老鼠體內，實驗時間為 21 天：第一天(第一周)是將抗原以 100μL 與 Complete adjuvant（100μL）作等體積混合之後，同時施打於腹 腔、肌肉及背部；第八天(第二周)是將抗原以 100μL 與 Incomplete adjuvant （100μL）作等體積混合之後，進行施打；至第十五天(第三周)與第二十 一天(第四周)時，重複第八天的實驗步驟，實驗進行的同時也同時記錄老 鼠的行為狀況。 接著將老鼠進 心、肺、肝、脾、腎六種

塑膠孔盤上，完成後用 BSA 洗去多餘之抗原 利用抗原抗體之間專一性鍵結之特性，對檢體進行檢測；由於結合於 固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設 計其鍵結機制後，配合酵素呈色反應，即可顯示特定抗原或抗體是否存 在，並可利用呈色之深淺進行定量分析。 一般之操作步驟為： (1) 將四種抗原固著於 (2) 加入待測的抗體，並做梯度的濃度實驗，抗體中若含有待測之一次抗 體(primary antibody)，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行專一性鍵結 用 PBS 洗去多餘待測抗體，加入含有螢光酵素之二次抗體［secondary (3)

antibody：Goat polyclonal to Mouse IgG H&L (HRP) Pre-Adsorbed］ 與待測之一次抗體（primary antibody）鍵結 (4) 用 PBS 洗去多餘未鍵結二次抗體(secondary antibody)，加入酵素受質使 酵素呈色，用 ELISA reader 儀器讀取呈色結果 二. 2.3 接合含有量子點(Quantum-dots)的二級抗體作顯色觀察 利用量子點(Quantum-dots)被特定波長的光激發後，可發出螢光的特 性，實驗中使用含有量子點的二級抗體，並且使用酵素免疫分析法（ELISA）

的表面修飾一層 APTES (3-aminopropyltriethoxysilane，3-氨基丙基三甲氧 基甲矽烷)，作為抗原與矽晶圓的連接劑，之後接合待測的一級抗體，再來 讓一級抗體與有接合量子點的二級抗體作專一性的鍵結，在觀察的時候， 利用綠色的螢光（波長約為 550nm）作為激發光源，在螢光顯微鏡下的視 野擷取發螢光的結果；另一個觀察工具為 JEOL 6700 SEM (Scanning Electron Microscopy：10KV，10mA，Field Emission Gun)，試片在進入 SEM 觀測之前，同樣的，必須將試片作前固定與脫水的的步驟，以避免破壞 SEM 內部的真空度，預期能看到一級抗體與含有量子點的二級抗體結合的影 像。

第三章 結果與討論

一. 3.1 蠶絲絲囊 先了解家蠶的內部構造，了解蠶絲絲囊的形 的取得 欲取得蠶絲蛋白質必須 狀，藉由查閱相關書籍和參考論文，來確認我們所取得部位的就是蠶絲絲 囊，就如同第三章實驗中所提到的，取的蠶絲絲囊必須是家蠶為五齡蠶到 形成繭的階段，這樣的蠶絲絲囊才會飽滿，所取得的蠶絲蛋白質的量也會 相對的比較多；在取得蠶絲絲囊之後，必須馬上將蠶絲絲囊放入以測試好 的穩定保存溶液 (此將保存溶液稱為 buffer I) ，讓蠶絲蛋白質具繼續保有 其原來的蛋白質活性，以利之後實驗的進行，所取得的絲囊如圖 4-1 所示， 圖 3-1 家蠶的蠶絲絲囊 簡單的將蠶絲絲囊分成 4 部分，分別為 ASG、MSG-1、MSG-2、PSG (ASG= anterior silk gland；MSG=middle silk gland；PSG=posterior silk gland)。

. 3.2 蠶絲蛋白質保存溶液的配置 蛋白質自組裝結構時相當重要， 試， 一 保存溶液的配置對於之後實驗進行 必須避免因為接觸空氣而氧化或者溫度的效應所造成的蛋白質變性，如此 一來自組裝結構就無法形成了，保存溶液的配置就根據第三章實驗中所提 到的四種條件進行測試，1. KCl鹽類濃度；2. 溶液的pH值[以磷酸根 (NaH2PO4)來調整溶液酸鹼度]；3. 尿素(Urea)的濃度；4. 保存溫度的測 將這四種條件用相圖的方式找出能夠讓蛋白質穩定存在的範圍，鹽類的濃 度以 50mM為梯度作調整，溶液的pH值範圍從 2.0 到 10.0，每次均以ㄧ個 單位為梯度作調整，尿素(Urea)從 0M到 4M，梯度變化為 0.5M，看每個條 件當中，蛋白質在溶液裡是否會有顏色或者沉澱物產生，如果有顏色或沉 澱物產生的話，就表示蛋白質已經產生變化，必須繼續調整範圍，下面的 圖表為測試的出來的結果。

圖 3-2 蠶絲蛋白質保存溶液穩定區域 由圖 3-2 的結果顯示，黑色區域為鹽類和酸鹼值的穩定範圍，鹽類濃度 在 100mM 到 300mM 不會產生沉澱，溶液的 pH 值從 5 到 8 可讓蛋白質 穩定存在，接著延續此結果，再加入 Urea 的濃度調整，濃度變化從 0.1M 至 4.0M，實驗結果發現，Urea 濃度在 0.5M 到 4.0M 可以讓蠶絲蛋白質 穩定存在，所以綜合上述 3 種結果，最後設定保存溶液條件為鹽類濃度 =200mM、pH=7 且 Urea 濃度=2M，並且稱此保存溶液為 buffer I；最後 一項保存條件是溫度的保存，有 3 種保存溫度分別為 4℃、-30℃和-80℃， 測試結果，以 4℃的保存條件效果最佳，因為-30℃和-80℃的溫度太低，

會造成蠶絲蛋白質產生固化而且加熱之後無法回覆到原來的狀態，其結 果亦可以從圖片中觀察得知，如下圖所示， 4℃保存取出後 _{-80℃保存取出後} 圖 3-3 蠶絲絲囊在 4℃與-80℃保存的結果比較 在均含有 buffer I 溶液的保存下，在 4℃左右的保存溫度還是可以讓蠶絲 蛋白質繼續保有其原來的樣子，但是在-80℃的時候，卻會造成蠶絲蛋白 質的硬化而形成白色的固體，所以保存溫度以 4℃為最佳保存溫度。 一. 3. 3 SDS-PAGE蛋白質電泳分離技術──分子量分析

離效果的電泳膠配法，將蠶絲蛋白質做更細微的蛋白質分離，欲得到最 佳分離效果，必須控制 separating gel 的濃度以及跑膠時的電壓伏特數， 最後測試的結果，發現最好的條件是將 separating gel 的濃度調成 8%，然 後在加入蛋白質跑膠前，先將加 50 伏特的電壓預跑一次，預跑的目的是 先去除膠體內的雜質，避免讓蛋白質在跑膠時受到雜質的干擾而產生拖 曳的現象，之後正式跑膠時，使用的電壓為 100 伏特，所得的跑膠結果 如圖 圖 3-4 蠶絲蛋白質之電泳分析結果

從結果發現，對照著 protein marker 來看，在將近 60KDa 的附近以及 35KDa 和 40KD 均有明顯的蛋白質帶，顯示著蠶絲蛋白質有著更小的蛋 白質結構，但是在膠體的上方也同時發現，有比較大分子量的蛋白質尚

未被分離，根據參考資料推測，在較大分子量的蛋白質裡，可能在蠶絲 蛋白質裡有強鍵結無法藉由電泳原理來打斷，這些鍵結也是造成蠶絲蛋 白質會很黏稠的主因。 一. 3.4 高效能液相層析儀分析 ( HPLC ) 在做蛋白質分析的實驗中，如果能夠將蛋白質做純化成為相當重要的關 鍵，可藉由不同管柱(column)的使用，來達到良好的純化效果，實驗中使用 的管柱(column)型號為 BioSep-SEC-S4000，實驗參數為流動相(mobile phase) 為保存液(buffer I)，且將流速(flow rate)設定為 1mL/min，觀測波長為

280nm，時間設為 20 分鐘。

從結果可以對照已知的分子量大小的物質來分析，分子量越大者， elusion time 越小，即越早出現吸收峰值；實驗中最後發現蠶絲蛋白質造成 管柱(column)塞住，所以實驗結果僅剩 4 分鐘以前的數據，而且從峰值的 結果也發現，所被分析的蛋白質不能完全有效的被純化析出，造成峰值不 是單一的波峰，由此也發現蠶絲蛋白質的鍵結相當強，可以與跑膠結果做 呼應，所以造成無法有效的純化分析。 一. 3.5 蠶絲蛋白質自組裝結構成型 根據參考資料所顯示，蠶絲蛋白質被預測出具有β-sheet 摺板狀的結 構，並且與鏈狀的蛋白質共同聚合，形成奈米等級的共聚物，藉由設定實 驗條件來讓這種奈米結構做自組裝的動作，實驗結果顯示，最佳的實驗參 數為下列所示： (1) 蛋白質濃度(UV-OD280nm)：0.25mg/mL。 (2) 乾燥時間：1 days。 (3) 乾燥溫度： 25 ℃ (4) 溶液 PH 值：7.0。 (5) 自組裝的環境：培養箱。 配合上述條件，讓蠶絲蛋白質在矽晶片上形成自組裝結構，結構形成 之後，在不破壞自組裝結構的條件下，在進行 SEM 的觀察前，先做好固

定和脫水的步驟，利用 JEOL 6700 SEM (10KV，10mA，Field Emission Gun) 的觀察來找出最佳的自組裝結構條件，下列圖片的實驗結果與預期結果最 為接近，蠶絲蛋白質的自組裝可形成線狀的奈米結構；從 SDS-PAGE 的跑 膠結果與 HPLC 的純化結果得知，蠶絲蛋白質在較大的分子量基團裡有強 大的化學力鍵結，所以無法做有效的純化，因此會看到奈米自組裝結構與 其他較大蛋白質一起出現，若想得到只有奈米自組裝結構的結果，就必須 將蠶絲蛋白質體作更進一步的有效分離純化。 圖中奈米自組裝結構的線寬大小為 30 到 60nm 左右

二. 3.1 酵素免疫分析法（Enzyme-linked immunoassay, 簡稱 ELISA） 酵素免疫分析法的實驗步驟第三章所描述，藉此來檢測抗體的免疫反 應，並且將抗體濃度作梯度測試，實驗結果如下圖： 圖 3-7 不同奈米粒子的 ELISA 結果 從圖中的結果可知，每種抗原都有相對性的抗體接合反應，而且以TiO2-S 的反應量為最多，但是結果卻沒有濃度梯度變化，推論由於抗原與塑膠孔 盤的接合不均勻是造成無濃度梯度變化的主要因素。 二. 3.2 接合含有量子點(Quantum-dots)的二級抗體作顯色觀察

的實驗步驟就與抗體免疫分析法相同，反應完之後，先用 Leica DM2500M 的螢光顯微鏡作觀察，並且以綠色螢光(波長約為 550nm)來激發含有量子 點的二級抗體，實驗結果如下： antibody Antigen:ZnO-L Antigen:ZnO-S antibody

Antigen:TiO2-L

antibody

Antigen: TiO2-S

antibody

上列的結果來看，發現二級抗體對一級抗體的辨認，似乎專一性的接合 不高，導致所有的反應皆無明顯的差異。

第四章 結 論

實驗一. 作蠶絲蛋白質體學的研究，第一步首要工作就是測試出能讓蛋白質穩 定存在的溶液來保存，才能進行之後的相關實驗，接著以相對巨觀的模示 對蠶絲蛋白質體作物性及化性分析，進一步的找出可以讓蠶絲蛋白質形成 自組裝奈米結構的最佳條件。 取得五齡蠶的飽滿蠶絲絲囊後，首先將保存蛋白質的條件列出，分別 有鹽類濃度、酸鹼度以及保存的溫度，找出最適合蛋白質存在的環境範圍 所以最後採用保存溶液的條件為鹽類濃度=200mM、pH=7 且 Urea 濃度 =2M，並且以 4℃的狀態保存之。 蠶絲蛋白質分析，實驗設計流程是先以 SDS-PAGE 蛋白質電泳分離技 術，再來將蠶絲蛋白質作 HPLC 的純化分析，先利用 SDS-PAGE 電泳膠體 將蠶絲蛋白質體作初步的定量分析，從膠體的結果發現，對照著 protein marker，蠶絲蛋白質有大有小,小的部分是在將近 60KDa 的附近以及 35KDa 和 40KDa 均有明顯的蛋白質帶，大的部分，預估大於 200KDa，參 照文獻與實際的實驗結果，推測較大分子量的蠶絲蛋白質有強力的化學鍵 結，導致無法利用電泳膠體將大分子的分離；接著用 HPLC 高效能液相層 析儀將蠶絲蛋白質作純化，由吸光值 OD280nm 的實驗數據發現，蠶絲蛋

所以無法得到有效的蛋白質純化，此結果卻可以和 SDS-PAGE 的跑膠結果 作驗證，亦即蠶絲蛋白質有強力的化學鍵結。 從上述的實驗結果，了解到蠶絲蛋白質目前無法被純化出來，所以未 來可以找出相關參考文獻，跟蛋白質純化有關的方法，或者是利用加入界 面活性劑的方式，來打斷液體蠶絲蛋白質中的強力化學鍵，接著再做蛋白 質分離與純化的工作；另一種方法是可以使用比較前段時期的蠶，如一齡 蠶、二齡蠶、三齡蠶或/和四齡蠶，使用比較前期的蠶絲絲囊蛋白質，先比 較不同時期的蠶絲蛋白質的成分與性質，再決定要採用何種時期的蠶絲蛋 白質來做自組裝奈米結構，如此才可以得到更好且性質更佳的自組裝結 構。 自組裝結構成型技術，是以不外加能量的方式，讓分子或物質以最低 能量方式作最穩定的自然排列結果，實驗中，同樣用控制環境因子的方式 找出能讓蠶絲蛋白質作自組裝的環境，截至目前為止，從 SEM 的實驗結 果發現，在所設計的實驗控制因子中，當蛋白質濃度(OD280nm)=0.25、溶 液 pH 值=7.0、乾燥溫度=25℃且乾燥時間為一天的狀態下，蠶絲蛋白質可 以形成自組裝的結構為奈米尺度的絲線狀，尺度大小為 40~60nm 左右。 現在大家對奈米科技的認知，已經有相當程度的了解，也就是當物質 或分子結構的尺寸大小達 100nm 以下時，其所擁有的物理性質和化學特 性，甚至光學特性、導電度和熱傳性質都將改變，而展現新的機能與特性；

所以之後蠶絲蛋白質奈米自組裝結構可以做性質分析，並且利用其奈米尺 度所擁有的獨特性質作嶄新的應用，亦可結合不同奈米物質，形成新式的 奈米複合材料，做特殊功能材料以供產業應用，例如：利用其高生物相容 性的特質，發展新式的醫用材料等等，其對未來的產業的應用，將可跨足 多項領域。

參 考 文 獻

實驗一:

[1] X. Nirmala,K. Mita,V. Vanisree, M. Zurovec and F. Sehnal, Insect Molecular Biology (2001) 10 (5)：437–445

[2] Pingbo Zhang, Yoichi Aso, Kohji Yamamoto, Yutaka Banno, Yongqiang Wang,Kozo Tsuchida, Yutaka Kawaguchi and Hiroshi Fujii, Proteomics

(2006), 6：2586–2599

[3] Pingbo ZHANG, Kohji YAMAMOTO, Yoichi ASO, Yutaka BANNO, Daisuke SAKANO, Yongqiang WANG, and Hiroshi FUJII, Biosci. Biotechnol. Biochem (2005)., 69(11)：2086-2093

[4] J. F. Graveland-Bikker, I. A. T. Schaap,C. F. Schmidt, and C. G. de Kruif, NANO LETTERS (2006) Vol. 6,No. 4:616-621

[5] Meital Reches and Ehud Gazit, SCIENCE VOL 300, 25 APRIL (2003) [6] Sonja Hess,a, Jacco van Beek, and Lewis K. Pannella, Analytical Biochemistry 311 (2002)：19–26

[7] Sachiko Matsumura, Shinobu Uemura and Hisakazu Mihara, Mol. BioSyst., (2005), 1：146–148

[8] Shuguang Zhang, Davide M Marini, Wonmuk Hwang and Steve Santoso, Current Opinion in Chemical Biology (2002), 6:865–871 [9] Hidenori Yokoi, Takatoshi Kinoshita, and Shuguang Zhang, PNAS (2005) vol.102 ,no. 24：8414–8419

[10] E. Oroudjev, J. Soares, S. Arcidiacono, J. B. Thompson, S. A. Fossey, and H. G. Hansma, PNAS, (2002) vol. 99, 6460–6465

[11] J. D. van Beek, S. Hess, F. Vollrath, and B. H. Meier, PNAS (2002) vol. 99, no. 16：10266–10271

[12] Ohad Carny, Deborah E. Shalev, and Ehud Gazit , NANO LETTERS (2006), Vol. 6,No.8：1594-1597

[13] Mudalige Thilak Kumara, Narayanan Srividya, Subra Muralidharan, and Brian C. Tripp , NANO LETTERS (2006), Vol. 6,No.9：2121-2129

[14] Davide M. Marini, Wonmuk Hwang, Douglas A. Lauffenburger,Shuguang Zhang, and Roger D. Kamm, NANO LETTERS (2002), Vol. 2,No.4： 295-299

[15] Sylvain Vauthey, Steve Santoso, Haiyan Gong, Nicki Watson, and Shuguang Zhang, PNAS, (2002) vol. 99 ,no. 8：5355–5360

[16] Shun-ichi Inoue, Hidetoshi Tsuda, Toshihisa Tanaka, Masatoshi Kobayashi, Yoshiko Magoshi, and Jun Magoshi, NANO LETTERS (2003),Vol.3,No.10：1329-1332

[17] Kun Huang, Yuanjian Zhang, Yunze Long, Junhua Yuan, Dongxue Han, Zhijuan Wang, Li Niu, and Zhaojia Chen, Chem. Eur. J.(2006) 12: 5314-5319

[18] Yann Astier1, Hagan Bayley1 and Stefan Howorka2, Current Opinion in Chemical Biology (2005), 9:576–584

[19] Nitzan Kol, Lihi Adler-Abramovich, David Barlam, Roni Z. Shneck, Ehud Gazit, and Itay Rousso, NANO LETTERS (2005) Vol. 5,No.7:1343-1346 [20] Karthikan Rajagopal and Joel P Schneider_Current Opinion in Structural Biology (2004), 14:480–486

[21] Carol C. Barford, Steven C. Wofsy, Michael L. Goulden, J. William Munger, Elizabeth Hammond Pyle,Shawn P. Urbanski, Lucy Hutyra, Scott R.Saleska, David Fitzjarrald, Kathleen Moore, SCIENCE (2001) VOL 294:1684-1688

HAYASHI, DMITRII E. MAKAROV AND HELEN G. HANSMA, NATURE (2003) VOL 2,278-283

[23] Timothy H. Bayburt and Stephen G. Sligar, Protein Science (2003), 12:2476–2481.

[24] Steve Santoso, Wonmuk Hwang, Hyman Hartman, and Shuguang Zhang, NANO LETTERS (2002), Vol. 2,No.7：687-691

[25] Lihi Adler-Abramovich, Meital Reches, Victoria L. Sedman, Stephanie Allen, Saul J. B. Tendler, and Ehud Gazit, Langmuir (2006), 22,

1313-1320

[26] Rupesh Dash1, Soumen Mukherjee , S.C. Kundu, International Journal of Biological Macromolecules 38 (2006) 255–258

[27] Ann E. Terry, David P. Knight, David Porter, and Fritz Vollrath, Biomacromolecules (2004), 5, 768-772

[28] Juming Yao, Kosuke Ohgo, Rena Sugino, Raghuvansh Kishore, and Tetsuo Asakura, Biomacromolecules (2004), 5, 1763-1769

[29] Yasushi Tamada, Biomaterials 25 (2004) 377–383

[30] Tetsuo Asakura, Rena Sugino, Tatsushi Okumura and Yasumoto Nakazawa, Protein Science. (2002) 11: 1873-1877

[31] Michal Z˘ urovec and Frantisˇek Sehnal, THE JOURNAL OF

BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 277, No. 25, Issue of June 21, pp. 22639–22647, (2002)

[32] Robert Fedicˇ , Michal Z ˇ urovec, and Frantisˇek Sehnal, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, No. 37, Issue of September 12, pp. 35255–35264, (2003)

[33] Masafumi Yamao, Nagakazu Katayama, Hiroshi Nakazawa, Minoru Yamakawa, Yoshiyuki Hayashi, SaburoHara, Kaeko Kamei and Hajime Mori, GENES & DEVELOPMENT (1999) 13:511–516

[34] John M. Kenney1, David Knight2, Michael J. Wise3 and Fritz Vollrath2,4 EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY (2002), 269, 4159–4163 [35] J. M. GOSLINE, P. A. GUERETTE, C. S. ORTLEPP , K. N. SAVAGE, The Journal of Experimental Biology (1999) 202, 3295–3303

實驗二:

[1] G. Steven Huang, Yu-Shiun Chen, and Hsiao-Wei Yeh, NANO LETTERS (2006), Vol. 6,No.11：2467-2471

[2] Bernard F. Erlanger, Bi-Xing Chen, Min Zhu, and Louis Brus, NANO LETTERS (2001), Vol. 1,No.9：465-467

[3] Hrushikesh M. Joshi, Devika R. Bhumkar, Kalpana Joshi, Varsha Pokharkar, and Murali Sastry, Langmuir 2006, 22, 300-305

[4] Ivan H. El-Sayed, Xiaohua Huang, and Mostafa A. El-Sayed, NANO LETTERS (2001), Vol. 5,No.5：829-834