解凍細胞

將冷凍小管從-80℃冰箱取出後迅速以 37℃回溫，移至 15ml 離心管中，

加入 2ml 新鮮培養液混合均勻，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。去除上清液，加 入適量培養液使細胞懸浮，平均分配細胞懸浮液至新的培養皿中，置於5%

CO₂和溫度37℃的細胞培養箱中培養。

MTT (3 - (4,5 - Dimethylthiazol - 2 - yl ) - 2,5 - diphenyltetrazolium bromide) 為一種黃色水溶性化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於 活 細 胞 粒 線 體 中 的 呼 吸 鏈 ， 在 琥 珀 酸 脫 氫 酶 (SDH) 和 細 胞 色 素 C (Cytochrome C) 的作用下 tetrazolium 環裂開，生成藍紫色的 formazan 結晶，

formazan 結晶的生成量與活細胞數目成正比，因為死細胞中琥珀酸脫氫酶 會消失，不能將 MTT 還原。之後再用 DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 將細胞 內的結晶溶出。利用 ELISA reader 波長 570 nm 去測其紫色溶液的吸光值，

2.4 細胞內 ROS 含量的分析 (Flow cytometry，流式細胞儀)

將 1×10⁶顆的Hep-G2 細胞培養在 6 cm 培養皿，待 12-14 小時細胞貼壁 後，加入濃度 50 (μg/ml) 的 6-shogaol 至培養皿內。處理 1 小時與 3 小時後，

加入濃度為 10μM 2’, 7’- dichlorodihydrofluorescein – diacetate (DCFH-DA)，

放回 37℃的培養箱反應 20 分鐘。DCFH-DA 本身會穿過細胞膜進入細胞 內，在細胞內和 ROS 發生反應。當 DCFH-DA 被 ROS 給氧化以及裂解成 DCF 的產物，在波長 488-530 nm 的光激發下，會產生綠色螢光。收集所有 的培養液至 15ml 無菌離心管中，以 1×PBS buffer 沖洗兩次，並將其沖洗液 收集至同管離心管中，加入 1ml 0.05% trypsin / EDTA，放置於 37℃的細胞 培養箱中反應30 秒。取出後拍擊培養皿邊緣，將細胞從培養皿盤底震落，

吸取一些 15ml 離心管中的培養液中和 trypsin 活性，將所有細胞液收集回離 心管中。以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 1×PBS buffer 來回吸 打，在離心一次去除上清液。以 1ml PBS buffer 來回吸打，使細胞均勻分散，

放置在冰上避光。以flow cytometry 分析，觀察 ROS 的含量。

2.5 細胞週期的分析 (Flow cytometry，流式細胞儀)

將 3×10⁶顆的Hep-G2 細胞培養在 10 cm 培養皿，待細胞貼壁後，去除 舊的培養液，以 1×PBS buffer 沖洗兩次，加入內含 1% P/S，以及 0.5% FBS

的 6-shogaol 至培養皿內，培養 12 小時並收集細胞。收集細胞時，將所有 的 propidium iodide (PI)，放置室溫下避光反應 40 分鐘。PI 為一種螢光染劑，

細胞膜經過酒精固定後會產生孔洞，PI 便會透過膜上的洞進入細胞，結合 在 DNA 與 RNA 的鹼基對中間，在藉由 flow cytometry 以 493 nm ~ 630 nm 波長的光去激發，會產生紅色的螢光，透過分析螢光強弱便可以知道細胞 週期的變化。

2.6 Caspase-3 分析 (Flow cytometry，流式細胞儀)

將 1×10⁶顆的Hep-G2 細胞培養在 6 cm 培養皿，待 12-14 小時細胞貼壁 沖洗兩次，離心並去除上清液。加入 0.5ml 的 BD cytofix/cytoperm slution 使細胞懸浮，放置冰上 20 分鐘。以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除 BD cytofix/cytoperm slution，在室溫下加入 0.5ml 1×BD Perm/wash buffer 清洗細 胞兩次，以1500 rpm 離心 5 分鐘去除清洗液。加入 100μl 1×BD Perm/wash buffer 懸浮細胞，並加入 20μl antibody，置室溫下 30 分鐘。以 1500 rpm 離

心 5 分鐘去除上清液，加入 1ml 1×BD Perm/wash buffer 清洗細胞，以 1500 rpm 離心 5 分鐘去除清洗液。加入 0.5ml 1×BD Perm/wash buffer 懸浮細胞，

並以 flow cytometry 分析，觀察 Caspase-3 的變化。

2.7 Apoptosis 分析 (Flow cytometry，流式細胞儀)

將 1×10⁶顆的Hep-G2 細胞培養在 6 cm 培養皿，待 12-14 小時細胞貼壁 後，加入濃度為0、10、25、50 (μg/ml) 的 6-shogaol 至培養皿內。培養 24

小時後，將所有的培養液收集至15ml 無菌離心管中，1×PBS buffer 沖洗兩 次，並將其沖洗液收集至同管離心管中，加入 2ml 0.05% trypsin / EDTA，

放置於 37℃的細胞培養箱中反應 30 秒。取出後拍擊培養皿邊緣，將細胞從 培養皿盤底震落，吸取一些 15ml 離心管中的培養液中和 trypsin 活性，將所 有細胞液收集回離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘。再用冷的 1×PBS buffer 沖洗兩次，離心並去除上清液。以 1ml 1X binding buffer 使細胞懸浮，加入 體積各為 5μl 的 FITC annexin V 和 PI 至懸浮液中，輕輕震盪混合均勻，放 置反應 15 分鐘。反應完畢後在 1 小時內，以 flow cytometry 分析，觀察 apoptosis 的變化。

Annexin V 是一種會與磷脂絲胺酸 (Phosphatidyl) 做結合的螢光染 濃度為 50(μg/ml)的 6-shogaol 至培養皿內，在不同的培養時間點 0、3、6、

12、24 小時收集細胞。用刮棒將貼壁的細胞刮起，連同培養液收集至 15ml 離心管中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，加入 1×PBS buffer 來回 吸打，並將溶液移至eppendrof 中，以 1500 rpm 離心 5 分鐘，去除上清液。

每個樣品加入 200μl SDS lysis buffer，並充分的來回吸打，待溶液從黏稠狀 吸打至液體狀，以12000 rpm 離心 10 分鐘去除泡沫即可，其溶液便為細胞 總蛋白液。

2.8.2 蛋白質定量

將標準品 BSA 配至成濃度為 0、0.4、0.8、1.6、2 (mg/ml)，備置在 eppendrof 中，體積為 150μl。預測的蛋白質取 5μl，與 145μl 的 ddH2O 混和，備置在 eppendrof 中。配製 protein assay reagent，並加進標準品與待測樣品的 eppendrof 中混合，每管加入 150μl，放進 60℃烘箱反應 1 小時。將每個標

準品與待測樣品各取 100μl 放置於 96-well 培養皿中，每孔 100μl，用連續 波長分析儀 (ELISA reader) 以波長 595 nm 測定其吸光值。以標準品的曲線 求出其斜率公式，將樣品吸光值代入公式中，計算出各樣品的蛋白質濃度。

2.8.3 蛋白質電泳

將蛋白萃取液取同濃度最大體積的量，用 6×loading dye 將體積補滿至 200μl，放進煮沸的水中加熱 5 分鐘，再放在冰上降溫待測。配置好 10% SDS

泳 100 分鐘。

2.8.4 蛋白質轉漬

準備 6 張 3M paper 和 1 張 transfer membrane，將 3M paper 浸泡在 transfer buffer 備用，transfer membrane 浸泡在甲醇 (methanol) 備用。電泳結束後，

由上至下以 3 張 3M paper、gel、transfer membrane、3 張 3M paper 的順序，

疊好放置在半乾式碳板上，用小圓棒將空氣滾動排除，再以條件為 100 毫 安培 (mA) 進行轉漬 100 分鐘。

2.8.5 免疫墨點法

轉漬完成後，將 transfer membrane 依照想觀察的蛋白質分子量的不同，

切割剪裁不同位置並放到blocking buffer 中，並放置在 shaker 上搖晃 1 個半 小時。用 TBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘，再依照蛋白質分子量位置加入 1 級抗體，放置在 4℃ shaker 上緩慢搖晃 overnight。用 TBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘，再依照 1 級抗體萃取來源加入 2 級抗體，放置在室溫 shaker 上緩 慢搖晃 1 個半小時。用 TBST 清洗 3 次，每次 10 分鐘，最後以冷光試劑 (Western Chemiluminescent HRP substrate) 作用，再以冷光螢光影像分析系 統 (LAS-3000) 進行分析。

第三章 結果

並具有 does-dependent 的效果。而且從結果圖上明顯看的出來，Hep-G2 細 胞對於 6-shogaol 抑制細胞生長的效果，來的比 Huh-7 靈敏許多。另外可以

利用顯微鏡觀察經過 6-shogaol 處理後的 Hep-G2 細胞生長的情況，發

現經過 6-shogaol 50 μg/ml 處理後的細胞，細胞型態有逐漸產生皺縮的現 象，隨著6-shogaol 處理的時間逐漸增加，細胞皺縮、死亡的情形更加的明 顯，並同樣具有time-dependent 的效果 (圖 2)。

3.3 6-shogaol 對 Hep-G2 細胞內活性氧化物 (ROS) 的影響

由先前的 MTT assay 的實驗已知，6-shogaol 可以有效的抑制肝癌細胞 的存活率，而先前的研究指出在其他癌細胞中，6-shogaol 在進入細胞後會 大量誘導 ROS 的產生造成細胞死亡，因此我們進一步同樣也分析 6-shogaol 是不是在 Hep-G2 中，同樣也會誘導 ROS 的含量上升。

我們利用 DCFH-DA 會被 ROS 給氧化以及裂解成 DCF，在波長 488-530 nm 光激發下會產生綠色螢光的特性，利用流式細胞儀分析 ROS 含 量的情況。Hep-G2 細胞經過 50μg/ml 6-shogaol 處理 1 小時與 3 小時後，加

入 DCFH-DA 染色，在利用流式細胞儀分析，結果顯示當 Hep-G2 細胞處理 過 6-shogaol 和沒處理的對照組相比，ROS 的含量有明顯的增加，約增加了 三倍之多 (圖 3a、3b)。

3.4 6-shogaol 對 Hep-G2 細胞週期的影響

ROS 是一種活性極高的分子，因為它帶有未成對的電子，所以容易

damage，進而可能會改變 DNA 正常的複製週期。所以接著就來看看 Hep-G2 的細胞週期，受否受到6-shogaol 所誘導的 ROS 產生改變。

正常的細胞大多數會是停留在染色體未複製的單倍體時期 (G1)，部 分細胞會在染色體複製期 (S)，與染色體複製成二倍體時期 (G2)。當 DNA 發生 damage 時，DNA 無法正常的複製時，細胞週期便會停留在 Sub-G1 時 期。Hep-G2 細胞經過 0、10、25、50 (μg/ml) 6-shogaol 處理 12 小時後，收

集固定細胞，以PI 染色，經流式細胞儀分析發現，隨著 6-shogaol 濃度的上 升，其 Sub-G1 的細胞比例也跟著增加。根據數據量化圖得知，Sub-G1 時 期的細胞在濃度 25μg/ml 顯著的增加 13%左右；當濃度提高到 50μg/ml 時，

有近 90%的細胞都停留在 Sub-G1 時期 (圖 4a、4b、4c)。

3.5 6-shogaol 對 Caspase-3 的影響

從細胞週期得知，6-shogaol 會改變 Hep-G2 的細胞週期，隨著濃度增 激發螢光的 antibody 染色，由流式細胞儀分析發現，隨著 6-shogaol 的濃度

增加Caspase-3 的含量也跟著增加，顯示細胞開始走向細胞凋亡 (圖 5a、5b)。

3.6 6-shogaol 誘導 Hep-G2 細胞凋亡

由先前 Caspase-3 的實驗已知，6-shogaol 會誘導細胞凋亡的訊號啟動，

導致細胞走向細胞凋亡。當細胞開始進行細胞凋亡時，原本只存在內膜細 胞膜上的磷脂絲胺酸會外翻到細胞膜外，而外翻的磷脂絲胺酸會被 Annexin V 辨識並結合。細胞凋亡到最後細胞會壞死，壞死的細胞細胞膜會出現孔 洞，此時染劑 PI 便會透過細胞膜上的孔洞進入細胞內與 DNA 做結合。利 用 Annexin V 與 PI 的螢光強度的搭配，可以用來區分細胞凋亡的程度。

我們以 0、10、25、50 (μg/ml) 6-shogaol 處理 Hep-G2 細胞 24 小時後，

以 Annexin V 與 PI 雙染法染色，經流式細胞儀偵測，可以明顯觀察到 6-shogaol 濃度增加時，細胞膜外翻的情形更加明顯，且有少部分的細胞壞 死的現象。經量化後結果顯示，在濃度 50μg/ml 時，有 50%的細胞開始走 向細胞凋亡 (圖 6a、6b)。

3.7 抑制 ROS 對 6-shogaol 誘導細胞死亡的影響

由前面的實驗得知了，6-shogaol 會使 Hep-G2 細胞產生大量 ROS，進 而改變了細胞週期，誘發凋亡信號啟動，導致細胞凋亡。接著我們想了解，

當ROS 被抑制後，是否能夠保護細胞受到 6-shogaol 造成的細胞損傷。利用

經流式細胞儀進行 ROS 量的分析後，從結果圖上可以看到，加入 6-shogaol 的 Hep-G2 細胞，ROS 的含量與沒添加的對照組相比，ROS 含量 確實有增加；當加入了 NAC 後，ROS 的含量明顯的下降了許多。經量化後 結果顯示，加入 NAC 在 3 小時的時後，ROS 的比例下降了一半以上，證實 NAC 確實能抑制 6-shogaol 誘導產生的 ROS (圖 7a、7b)。

透過細胞週期分析結果圖觀察到，抑制 ROS 確實能保護細胞，使細胞 週期不受影響。透過統計分析發現，添加 6-shogaol 的 Hep-G2 細胞 Sub-G1 期的細胞明顯的增加約四成；有加入NAC 抑制 ROS 的 Hep-G2 細胞，細胞

24 小時的細胞中萃取出來的蛋白質後發現，一些產生內質網壓力時，會誘 導增加的蛋白質如：IRE1α、IRE1β、ATF6α、GRP78、p-eIF2-α等等，隨 著處理的時間增加，都有明顯的增加的現象 (圖 10)。表示 6-shogaol 會造成

24 小時的細胞中萃取出來的蛋白質後發現，一些產生內質網壓力時，會誘 導增加的蛋白質如：IRE1α、IRE1β、ATF6α、GRP78、p-eIF2-α等等，隨 著處理的時間增加，都有明顯的增加的現象 (圖 10)。表示 6-shogaol 會造成