一、 抗發炎活性與作用機制
(一)中鏈脂肪酸對 P.acnes 誘導 THP-1 促發炎細胞激素生成 的影響
本實驗測定中鏈脂肪酸（capric acid, caprylic acid, caproic acid）對於 P.acnes.
誘導 THP-1 細胞產生的促發炎介質的影響，結果顯示三種中鏈脂肪酸皆能顯著 降低 IL-8, TNF-and IL-1的產生，但不管是在蛋白質或是 mRNA 的表現，capric acid 具有較好抑制促發炎細胞激素產生的能力，IC50為 22.9 M 低於其他兩種脂 肪酸，所以選擇 capric acid 為樣品，繼續探討 capric acid 抗發炎作用機制。
從過去文獻中發現 linoleic acid (LA)與 α-linolenic acid(ALA)能夠抑制 LPS 經 由 TLR4 誘導 THP-1 細胞產生的促發炎細胞激素 IL-6, IL-1β and TNF-α，且能夠 抑制這三種 cytokine 的 mRNA 表現(Yasui et al., 2005)。另外，研究指出 LPS 會 誘使 RAW264.7 產生 ROS 並活化 MAPKs, p38 and NF-B，進而促使 TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 的生成，顯示經由刺激而產生的促發炎細胞激素與發炎可能在痤瘡病 灶中具有重要影響。
綜合上述文獻與實驗結果，推測中鏈脂肪酸抑制 P.acnes 誘導 THP-1 細胞之 促發炎細胞激素的產生可能藉由減少 ROS 所活化的 MAPKs 和 NF-B 的活化，
而達到抗發炎的功效。
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圖 5-1 LPS-induced RAW264.7 細胞的發炎現象
Figure. 5-1. Schematic diagram illustrating the signaling pathways involved in LPS-induced inflammation associated proteins in RAW264.7 cells.
TLR4
LPS LBP
MAPKs (ERK, JNK, p38)
ROS
PI3K
Akt IKK
- NF-
NF- TNF-IL
IL
-
degradation
71 炎細胞激素，進而引起發炎反應(Grange, et al., 2009)。Ligand 活化對應的 TLRs 後，會吸引 Myeloid differentiation factor-88（MyD88），MyD88 會吸引其他傳訊 蛋白包括 IL-1Rassociated kinase-1（IRAK-1）/ IRAK-4 與 adaptor protein 的 tumor necrosis factor（TNF）, receptor associated factor 6（TRAF6），接著一連串磷酸化 (phosphorylation)與泛素化(ubiquitylation)的步驟，會使 IKK complex (inhibitor of NF---kinase complex )受磷酸化，緊接著-上特定的serine 區域受磷酸 化後會降解proteasome-mediated degradation)而與 NF-分離，使得 NF-能夠 移入細胞核內誘使免疫反應相關基因的轉錄作用，合成細胞激素（cytokin）、
一些研究指出NF-pathway 與表皮恆定（epidermal homeostasis）狀態相關 (Fuchs & Raghavan, 2002)。關於抑制表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）中 NF-活化實驗，像是藉由控制mutant non-degradable IB的過度表現或是以基 因剔除（knockout）的方式剃除 NF-的 p65 subunit，都會造成表皮細胞增生，
顯示表皮細胞中的NF-與調控生長有關(Nenci et al., 2006)。NF-signaling是
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減少，而達到抗發炎的功效。
圖 5-2模式識別受體和先天性免疫訊息調控
Figure. 5-2. Pattern recognition receptors and innate immune signaling.(Li et al., 2012)
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mitogen-activated protein kinases(p38 MAPK)及 c-Jun N-terminal kinase(JNK)，這 些 kinase 當細胞外界刺激由細胞膜傳入時，會經由上游一連串 MAPK kinase 紫外光所活化。自由基的生成，超氧陰離子會活化 MAPK pathway，促使 MAPK 路徑中的 JNK, ERK 表現增加，活化下游 c-jun and c-fos，誘發 c-fos 主要是透過 ERK 傳導路徑，而 c-jun 的誘發主要則是透過 JNK 傳導路徑。AP-1 為一轉錄因 子，主要由 c-fos 蛋白與 c-jun 蛋白結合成異二聚體(heterodimer)或 c-jun 蛋白本身 形成同型二聚體(homodimer)所構成，能夠與 DNA 上的 AP-1 接合區結合，調節 細胞的基因表現。研究指出，P.acnes 會刺激活化 IL-8 promoter，增加表現 AP-1 和 NF-responsive elements，而 nicotinamide 則會抑制此轉錄階層來向下調節 IL-8 的產生(Grange, et al., 2009)。另外，在同一研究也證實 P.acnes 藉由活化 HaCaT cells 的 TLR-2 使得-degradation 和刺激 MAPK pathway；若在P.acnes 刺激前先將HaCaT cells 以 nicotinamide 處理，則可預防-degradation 和
ERK,
JNK 的磷酸化，並且也發現抑制 IL-8 mRNA 產生。
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Figure. 5-3. Proposed mechanisms of velutin in inhibiting TNF-α and IL-6 production in macrophages.(Xie et al., 2011)
另外，P.acnes 所刺激產生的 TNF-、IL會增加 MMP-的表現，當 MMPs 表現會造成毛囊基質分解增加，而 TNF-不僅會抑制嗜中性白血球凋亡，並促使 嗜中性白血球聚集、沉積而促進毛囊發炎的情況Dessinioti & Katsambas；
在一個有關呼吸疾病的研究中發現，carbon monoxide (CO)具有抗發炎的效果，
藉由調控 MKK3/p38 MAPK pathway 可以抑制 LPS-induced RAW 264.7 cells 產生 TNF-, IL-6Wang et al 。
因為在 Nakatsuji 等人 in vitro and in vivo 的實驗結果發現 lauric acid 具有抑 制 P. acnes 生長的能力，並且具有抑制 P.acnes 所誘發的發炎反應之效果
(Nakatsuji, et al., 2009)。另外，lauric acid 與 capric acid (10:0)在文獻中發現亦能 夠抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2，顯示也具有抗發炎的能 力(Wu, et al., 2009)。所以本實驗使用 lauric acid 當作對照組，結果顯示 capric acid 降低 p38, ERK, JNK, p65 蛋白質磷酸化的表現效果優於 lauric acid，推測 capric
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acid 可能有比 lauric acid 更佳的抗發炎能力。
綜合上述文獻，推論中鏈脂肪酸應該是藉由減少 MAPKs, NF-B 的活化，
進而抑制 P.acnes 誘導 THP-1 細胞之促發炎細胞激素的產生，而達到抗發炎的功 效。
76 PPAR能減少 cytokines(如:IL-6, IL-1, TNF- )的釋出，能抑制單核球細胞發炎細 胞激素的產生。PPAR活化使得 5-LOX 表現，而使 LXA4合成，更增強了 PPAR
的活化，PPAR抑制基因的表現可能藉由拮抗 NF-和 AP-1 的活化，增加表現 抑制細胞激素的訊號（suppressor of cytokine signaling, SOCS-2）(Machado et al., 2006)，抑制 ERK and JNK(Svensson et al., 2007)和引發 TRAF6 的
degradation(Machado et al., 2008)。
在 AA 代謝路徑中，經由 5-LOX 而生成 LTB4 除了會增加白血球、巨噬細 胞趨化聚積外，也會使增加促發炎細胞激素 IL-6, IL-8 產生。APKs 家族中，p38 MAPK 調節 mitogen-activated protein kinases-activated protein kinases（MKs）和 ERK 會分別使 5-LOX 上的 ser271, ser663 磷酸化，間接使得細胞內 5-LOX 活化 (Werz et al., 2002)。於 in vitro 研究顯示 p38 MAPK 可以調節 MKs 並磷酸化 5-LOX，且 MK motif 會出現在 5-LOX 序列中(Werz et al., 2000)。
4-hydroxynonenal（HNE）會經由 p38 MAPK pathway 誘使巨噬細胞內 5-LOX 活化，而 ERK 的影響較小，另外若給予 p38 抑制劑 SB203580 則會抑制
HNE-induced 的 5-LOX 合成(Yun et al., 2009)。
本實驗機制的結果部分，顯示 capric acid在 25, 50, 100 M 三個濃度下，皆
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可以顯著降低 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現，藉由上述文獻結果，可以推 測capric acid 可能藉由調控細胞中p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現，來達到 抑制5-LOX 活化的效果，降低 AA signal pathway 活化產生的 IL-8。
圖 5-4 細胞內 5-LOX 活化與 AA 代謝
Figure 5-4. Schematic illustration of cellular 5-LOX activation and AA metabolism.
(Werz, et al., 2002)
5-LOX
5-LOX
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(五) capric acid 對於 AA 刺激 SZ95 sebocyte 脂質生成之影 響
SZ95 皮脂腺具有脂質生成能力，細胞體積變大，脂肪油滴聚集在細胞質以
及細胞核的衰退皆為皮脂腺細胞終端分化的現象，接著細胞會進行全泌作用
（holocrine secretion），然後死亡(Zouboulis et al., 1994)。本實驗使用 WY14643
（PPARligands）為正對照組，與皮脂細胞共培養 48 小時顯著促進細胞脂質生 成，確立 SZ95 皮脂細胞的脂質生成能力。結果顯示，三種中鏈脂肪酸不會影響 SZ95 脂質堆積作用；與 AA 共培養則會增加皮脂腺細胞脂質堆積現象。
過去的研究中提到， AA 及其代謝物不僅在上皮細胞分化的生理機制扮演 重要角色(Keeney et al., 1998)，在人類皮脂腺細胞內也相當重要(Zouboulis, 2000)。將 AA 與 SZ95 共培養會增加皮脂腺細胞質內脂質堆積，並且會觀察到細 胞凋亡的現象(Wrobel et al., 2003)。AA 可能會使痤瘡病灶的發炎情況更嚴重。
AA 代謝會影響 PPAR活化，這樣可能會使皮脂腺細胞脂質堆積增加，另外也會 增加促發炎細胞激素 IL-8, IL-6 的產生，皮脂的過度堆積和促發炎細胞激素所導 致的發炎反應都可能會造成痤瘡惡化。但 AA 與痤瘡的形成是否有關係仍須進一 步研究釐清。PPAR 可以調控皮脂的生成，以 PPARagonist-GW7647,
PPARagonist-GW0742, PPARagonist-GW2433, PPARagonist rosiglitazone 處理 不同於本實驗的另一株細胞株 SEB-1，發現皆會促進脂質合成，且服用 fibrates
（PPARligands）之高血脂病患以及服用 thiazolidinediones（PPARligands）之 糖尿病患皮脂生成較一般人增加了 77%(Trivedi et al., 2006)。
PPAR可能也受到pathway 上游分子所調控，當 cPLA2α作用在細胞膜 上，使得 AA 釋出，由 5-LOX 作用後經 PPARresponse elements 而活化 PPAR
與調控 COX-2, IL-6 的產生(Hazra et al., 2007)。另外在 Werz 等人的實驗中顯示 5-LOX 的活化與 p38 和 ERK 的活化相關(Werz et al., 2000)。
由上述文獻與實驗結果可以推測，capric acid 對於 AA 刺激 SZ95 脂質堆積 的影響，可能是藉由降低 p38 和 ERK 的磷酸化作用，而影響 5-LOX 的活化，使 得 AA pathway 活化受阻，最後影響脂質堆積與促發炎細胞激素的產生。
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二、 In vivo 抗發炎活性評估
在本實驗室之前研究 capric acid 對於 P.acnes.引起的小鼠耳朵腫脹與發炎的 影響結果顯示，capric acid 具有 in vivo 的抗發炎效果(李, 2012)。因此我們也評估 並比較 capric acid, caprylic acid 和 caproic acid 對於 P.acnes.引起的小鼠耳朵腫脹 與發炎的影響，結果顯示三種中鏈脂肪酸皆能夠減少 P.acnes.引起的發炎反應。
Nakatsuji 等人（2009）研究也證實 lauric acid in vivo（2g per 10 L in 5% DMSO in PBS）的抗發炎效果。Nakatsuji 等人（2008），為了說明 P.acnes 引起發炎的反 應，將 P.acnes(1x107CFU/mL)注射至 ICR 小鼠腹部皮膚安裝的 tissue chamber，
結果發現注射後 neutrophils 和 macrophages 會滲入 chamber，證實 P.acnes 會引起 發炎反應。
在臨床上長期使用抗生素治療痤瘡的病人，也面臨 P.acnes 具多種藥物抗性 的危機，而在全身性非特異性治療中會殺死大多數皮膚上的固有菌叢，影響皮膚 常駐菌叢的恆定；另外，若中斷痤瘡治療，會增加再次痤瘡發炎的情況。儘管治 療嚴重痤瘡所使用的 isotretinoin, 13-cis-retinoic acids 具有效抑制痤瘡病灶的發 展，但對於使用者會有一些像會增加出生缺陷率和憂鬱的風險，需謹慎使用。因 此新型痤瘡治療藥物的開發有其必要性，而為了評估目前痤瘡藥物或疫苗，痤瘡 動物模式的發展是必須的。部分阻塞的毛囊會形成一個理想的厭氧環境，使 P.acnes 增生而造成痤瘡損傷(lesions)。然而增加的 P.acnes 和其所產生的細胞外 酵素，毒力因素(virulence factors)，模式辦別受體(pattern recognition ligands)皆會 刺激皮膚造成發炎和痤瘡損傷。(Bojar & Holland, 2004)。
為評估樣品 In vivo 的抗發炎能力，本實驗室參考並改進 Nakatsuji 等人(2009) 建立的實驗動物模式(李，2011)進行動物實驗，使用相同品系小鼠，並使用重新 解凍培養活化之 P.acnes，將 P.acnes 濃度提高至 Nakatsuji 等人(2008, 2009)所使 用菌數的 6 倍劑量，則由病理組織切片的結果可以確定 P.acnes 已誘發小鼠耳朵 發炎。
雖然注射大量的 P.acnes 到老鼠耳朵可能造成組織壞死，但還是值得觀察 TLR2 耐受性是否受到重複注射 P.acnes 改變宿主對於注射菌液的敏感性的影響 (Medvedev et al., 2006)。在 Webster 等人測試治療痤瘡的動物實驗中，已經使用
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P.acnes 來引起耳朵發炎腫脹的模式，在實驗中利用兔、小鼠、天竺鼠等動物的 皮膚組織研究 P.acnes 與 triglycerides 的相關性，發現小鼠、兔子僅能測到低濃度，
所以較不恰當作為研究痤瘡損傷脂質合成方面的動物模式(Webster et al.,
1981)。而兔子耳朵模式缺乏細菌的增殖和發炎現象，且因面積的關係要進行廣 泛藥物篩選與疫苗接種也不方便(Mirshahpanah & Maibach, 2007)。Rhino mice 因 具有較大毛囊(follicle)所以經常被用來篩選抗痤瘡的藥物；然而，因為 Rhino mice 的免疫系統有缺陷，所以無法產生針對胸腺依賴型抗原(thymus-dependent antigens)的抗體(Takaoki & Kawaji, 1980)。因此使用了 ICR 小鼠建立動物的發炎
1981)。而兔子耳朵模式缺乏細菌的增殖和發炎現象，且因面積的關係要進行廣 泛藥物篩選與疫苗接種也不方便(Mirshahpanah & Maibach, 2007)。Rhino mice 因 具有較大毛囊(follicle)所以經常被用來篩選抗痤瘡的藥物；然而，因為 Rhino mice 的免疫系統有缺陷，所以無法產生針對胸腺依賴型抗原(thymus-dependent antigens)的抗體(Takaoki & Kawaji, 1980)。因此使用了 ICR 小鼠建立動物的發炎