螢光顯微鏡再次確認其不會發光後分別以 PCR 擴增放大其 EGFP 序列進行定序，
三、U6 啟動子之序列長度
本篇論文順利從 P. pastoris 中獲得有功能的 U6 啟動子序列，並將之應用於 sgRNA 的表現，使 CRISPR 系統產生作用。此 P. pastoris U6 啟動子序列是參照 前人獲得之另一種常用酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 之已發表文章[44]，以及其 他常用 U6 啟動子序列長度及特性如轉錄從 G 開始，來設計引子進而 PCR 放大
四、CRISPR 系統之植入
本篇論文所使用植入 CRISPR 系統的方法，為在 P. pastoris 已行之有年，且 實驗室普遍應用的方法：藉由同源重組將目標基因插入 genomic DNA 中，使異源 基因表現。然而要表現 CRISPR 系統有多種方法，在此簡述各種不同方法的優缺 點：
1. 植入 DNA
優：本篇研究所使用之方法。此方法將基因確實植入宿主中，異源基因的表達穩定，
若使用本篇論文獲得之 U6 啟動子，由於其連續性表現的特性，更進一步解決在 應用 CRISPR 系統時 sgRNA 容易被分解導致量不足的問題，是各種方法中最能 確切使 CRISPR 產生功能的方法。
缺：此方法需要較長的建構、測試及確效過程，雖然仍較其他基因編輯工具如 ZFN、
TALEN 快速[52]，但二到三個星期對於標榜快速的 CRISPR 系統仍嫌略久。其次，
外源基因的插入常常是在進行基因工程時的一個疑慮，究竟影響到宿主本身生理 的程度如何？又之後若真正要應用到產品上，異源基因的存在往往是市場最顧忌 的一點[27]。最後，隨著 CRISPR 系統於生物體中表達的穩定性，伴隨而來的便是 它存在生物體中更久，更有機會造成 CRISPR 系統中人人聞之變色的 off-target 效果。
2. 植入 RNA
形成 ribonucleoprotein (RNP)，再植入細胞中的技術[54]，此技術具有快速產生作用 的優點，同時具有無外源基因植入又較 RNA 穩定的優點，是應用 CRISPR 系統
1. 此兩條針對 Ura3 設計之 sgRNA 無效，需要再另外設計有效之 sgRNA。
導 3 天之 Cas9 蛋白質表現較明顯，然而是否過量仍須進一步實驗調整。綜合上 述，確認 sgRNA、Cas9 蛋白質之表現量是此系統最適化的重要工作，有待後續進 行。
七、Pichia pastoris CRISPR 系統之未來發展
本篇論文成功獲得 P. pastoris U6 啟動子，並成功以此來啟動 CIRSPR 系統
3. P. pastoris 之基因轉形已實行多年，操作上方便且容易達成，因此要植入基因、
置換基因乃至敲除基因皆可用此傳統的轉形系統。然而由於此物種缺少 RNA 干 擾 (RNAi) 機制[39]，使得 gene knockdown 較難以達成，透過 U6 啟動子及 dCas9 的結合，將使得新建立的 CRISPR 系統讓 P. pastoris 除了多了一個更快速的基因 編輯工具，更多了 gene knockdown 的可能性。
4. P. pastoris 之基因轉形已實行多年，由於其同源重組系統傳統上受到限制酶截切 序列的限制，使得應用上多為使用特定幾個常用啟動子表現不同目標蛋白質，較少 有其他應用。本研究初步建立一設計簡單之 CRISPR/Cas9 系統，可望在基因編輯 上更方便，達到 P. pastoris 全基因皆可編輯的效果，產出如改造內部糖基化、甲 基化的機制、快速營養缺陷珠建立、抗生素基因刪除等等應用。