第二章、 材料與方法
2. Pichia pastoris 勝任細胞製備
較於另一常用酵母菌 Saccharomyces cerevisiae，P. pastoris 有較適當的醣基化[35]， 使 P. pastoris 蛋白質表現平台廣為人所用。
添加與否調控基因表現，GAP 啟動子會持續啟動下游基因表現，在不同碳源 的環境表現量差異不大[38]，為持續型啟動子。
AOX1 啟動子及 GAP 啟動子為使用 P. pastoris 生產異源蛋白質時最常使 用的兩個啟動子，依據不同情形會有不同選擇，表現量則是眾說紛紜。P. pastoris 更有許多不同的啟動子選擇，讓研究人員可以依需求做調整[28]。
P. pastoris 作為表現平台有許多優點，然而起步較晚，相關研究仍在持續進行 中，許多機制仍不甚明朗，另外，P. pastoris 本身缺乏 RNA 干擾機制來方便地降 低目標基因表現[39]，是相對之下較不便之處。
四、RNA 聚合酶與啟動子
並不會進一步轉譯成蛋白質。不像 RNA 聚合酶 II 在轉錄的最後仍有一小段終止 具應用潛力[45]。近來最廣為人知的應用在於 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR- associated protein 9 (Cas9) 中普遍皆使用 U6 啟動子來表現 single guide RNA (sgRNA)[45]。然而，目前只有少數物種之 U6 啟動 子序列發表，又 RNA 聚合酶 III 辨識之啟動子較 RNA 聚合酶 II 辨識之啟動子 更難以以相似序列預測[48, 49]，使得 U6 啟動子於不同物種間的廣泛運用仍有阻礙。
四、研究動機與目的
hammerhead (HH) 及 hepatitis delta virus (HDV) ribozyme 序列，此二序列在形成 二級結構後會自行截切。文章透過此方法有效建立 CRISPR 系統，然而五、本篇論文具體目標
1. 取得有功能之 P. pastoris U6 啟動子
2. 將 P. pastoris 之 U6 啟動子用以表現 CRISPR 系統的 sgRNA 3. 以偵測目標基因的突變證實 CRISPR 系統之建立
六、本篇論文架構
圖一、本篇論文架構
Figure 1. Framework of the thesis
第二章、材料與方法
一、菌株及培養條件
1. Escherichia coli
Escherichia coli EPI300 (E. coli, Epicentre)，用於質體建構、保存。以 Luria-Bertani (LB) 培養基於 37oC 培養。
2. Pichia pastoris
Pichia pastoris KM71 (P. pastoris, Invitrogen)，為主要實驗菌株，用於釣取 U6 啟動子、表現異源基因 (EGFP, sgRNA and Cas9) 及測試 CRISPR 系統可行性。以 YPD 培養基於 30 oC 培養。
二、培養基及製備方法
本研究所使用之培養基及其成分與用途整理於表一，另製備方法於表二。
表一、培養基組成
Table 1. Composition of medium
名稱 成分 用途
Escherichia coli
LB 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl
培養 E. coli
LB w/ Ampicillin 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 100 μg/mL Ampicillin
培養具 Ampicillin 抗性之 E. coli LB w/ Kanamycin 1% tryptone, 0.5% yeast extract,
1% NaCl, 50 μg/mL Kanamycin
培養具 Kanamycin 2% dextrose, 100 μg/mL Zeocin
培養具 Zeocin 抗 性之 P. pastoris YPDSZ 2% peptone, 1% yeast extract,
2% dextrose, 1 M sorbitol, 1.5%
agar, 100 μg/mL Zeocin
篩選電轉轉形株
YPDG 2% peptone, 1% yeast extract, 2% dextrose, 250 μg/mL G418
培 養 具 G418 抗 性之 P. pastoris YPDZG 2% peptone, 1% yeast extract,
2% dextrose, 100 μg/mL Zeocin, 250 μg/mL G418
dextrose, 4*10-4% histidine, 1.5% agar
mBMGY 1% yeast extract, 1% (NH4)2SO4, 1% glycerol, 100mM potassium phosphate pH6.0, 4*10-5% biotin
培養轉形株
mBMMY 1% yeast extract, 1% (NH4)2SO4, 100mM potassium phosphate pH6.0, 4*10-5% biotin, 1% mg/L uracil, 1.5% agar
培養 ura3 基因突 變之轉形株
表二、培養基製備方法 Table 2. Preparation of medium
名稱 製備方法
yeast nitrogen base, (NH4)2SO4, biotin, histidine 混和使 用
mBMGY 分別配置 yeast extract, (NH4)2SO4, glycerol, potassium phosphate pH6.0 於一次水中，滅菌後與經 0.22 μm 過 濾膜過濾之 4*10-5% biotin 混和使用
mBMMY 分別配置 yeast extract, (NH4)2SO4, potassium phosphate pH6.0 於一次水中，滅菌後與經 0.22 μm 過濾膜過濾 之 4*10-5% biotin 混 和 使 用 ， 並 依 實 驗 需 求 添 加 methanol
5-FOA 加 入 1.5% agar 於 一 次 水 中 ， 另 配 置 10 倍 濃 度 dextrose 溶液，滅菌後與經 0.22 μm 過濾膜過濾之 yeast nitrogen base, (NH4)2SO4, biotin, 5-FOA ( 融 於 DMSO), uracil 混和使用
三、質體建構
(http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/searchDatabase) 之 C6-8-67 質 體 放 大 Cas9 片段，在 N 端及 C 端參考前人研究[51] 接上 nucleus locating signal (NLS, 表 四) 並加上 BamHI 及 EcoRI 切位，以 BamHI 及 EcoRI (NEB) 限制酶截切 PCR 片 段 及 pPICZ3.5K (Invitrogen) 表 現 載 體 後 ， 將 兩 者 以 T4 ligase (Yeastern Biotech) 接合。(2) 參 考 RNA central 公 布 之
P. pastoris
(http://rnacentral.org/rna/URS000069005A/4922) U6 基因序列，及酵母菌 U6 啟動子特性[44]。以引子對 U-F 及 U-R (表三) 進行 PCR，從 P. pastoris KM71及上述步驟 (1) 建構完成之表現質體後，將兩者以 T4 ligase (Yeastern Biotech) 接合。完成建構之 pPIC3.5K-Cas9-U6 啟動子-sgRNA 如圖三。
表三、PCR 所用之引子對 Table 3. Primer pairs used in PCR
名稱 序列 (5’ to 3’) U-R *sgRNA TTGAGCTTTTCGAGAAAGTTG
S-F *sgRNA GTTTAAGAGCTAT
S-R AAGAAAAATAAACTGCAAAAAAAGCACCGACTCG 5’ AOX GACTGGTTCCAATTGACAAGC HIS CATCTAGATGCTCACCGCAATGCTG
CasF TACAATGGATCCATGAAGATTCCAATTAAGGACAAGAAGTAC AGCATCGGCCTGGACATC
ScaR AAGAAAAATAAACTGCAAAAAAAGCACCGACTCG
*sgRNA 設計將於後續介紹
表四、本研究使用之 nucleus locating signal 序列
Table 4. Sequence of nucleus locating signal used in this study 名稱 C-SV40 large T antigen N-Matα2 胺基酸序列 (N 端至 C 端) PKKKRKV KIPIK DNA 序列 (5’ 至 3’) CCAAAGAAGAAAA
GAAAAGTT
AAGATTCCAATTAAG
圖二、pGAPZA-EGFP 表現質體
BleoR：Zeocin 抗性基因、Ori：複製起始點。
Figure 2. pGAPZA-EGFP expression plasmid
BleoR: anti-Zeocin gene, Ori: origin of replication.
圖三、pPIC3.5K-Cas9-U6 啟動子-sgRNA 表現質體
AmpR：Ampicillin 抗性基因、KanR：Kanamycin 抗性基因、Ori：複製起始點、
N-NLS：Cas9 蛋白質 N 端之 NLS、C-NLS：Cas9 蛋白質 C 端之 NLS、5’
AOX、HIS、CasF、ScaR：PCR 確認基因插入之引子位置。
AmpR: anti-Ampicillin gene, KanR: anti-kanamycin gene, Ori: origin of replication, N-NLS: NLS at the N’ of Cas9, C-N-NLS: NLS at the C’ of Cas9, 5’ AOX, HIS, CasF, ScaR:
primers for PCR comfirmation of gene insertion.