過去的研究文獻報導，苯乙酸不僅是一分化誘導劑而且能減低一些惡 性腫瘤包括神經膠母細胞瘤(glioblastoma)，攝護腺癌及前骨髓細胞白血病 (promyelocytic leukemia)等的惡化表現 10,13。另外苯乙酸具有選擇性停止腫 瘤生長以及促進大白鼠惡性腦腫瘤分化的能力 13。Hudgins 等人在 1995 年 提出關於苯乙酸衍生物的一份研究報告中指出，苯乙酸是一芳香族脂肪 酸，長鏈芳香族脂肪酸於代謝時脂肪酸的部份會進行β -氧化作用 (β -oxidation)，但是芳香環本身卻不易再進行β-氧化作用 154，使得苯乙酸不 易由體內代謝。而化合物本身是否具脂溶性也是影響療效因素之一，因為 脂溶性高的藥物較易通過細胞膜脂雙層進入細胞中。所以建議在藥物設計 上可保留苯乙酸結構上的芳香環，改變其羧基(carboxyl group)部分以提高化 合物的脂溶性，雖然藥效與脂溶性之間有一定的相關性，但苯乙酸結構相 關系列上的結構差異能提供一些作用的重要機制線索，譬如芳香環結構在 烷羧基團(alkylcarboxyl group)的對位(para)或鄰位(ortho)上以其他基團取代
(例如：苯環、甲基或鹵素族)，其效力皆優於苯乙酸 21。因此本實驗擬以
苯乙酸為基本架構對其羧基(carboxyl group)部分與苯環的取代做修飾改 變，合成系列的醯胺類(amides)的苯乙酸衍生物，雖然 Hudgins 等人認為接
上氨基會破壞羧基，而降低其誘導腫瘤細胞分化與靜止 21，但於本實驗卻
呈現不同的結果。
我們改變結構上醯胺的部分，以不同長度的烷基鏈(alkyl chain)取代，
合成兩系列的苯乙酸衍生物，即 H1 - H6 與 SCK1 - SCK6 (Scheme 1) ，分 別處理肺鱗狀上皮癌細胞 CH27，結果發現無論是 H1 - H6 或是 SCK1 - SCK6 對 CH27 細胞皆具生長抑制作用，此生長抑制作用與處理濃度或時間
好。而苯乙酸在相同的處理條件下，抑制癌細胞的活性不如 H1 - H6 或 SCK1 - SCK6 好。我們從 H1 - H6 或 SCK1 - SCK6 這兩系列的苯乙酸衍生物中，
篩 選 出 兩 個 最 有 效 的 化 合 物 － 4-fluoro-N-butylphenylacetamide (H6) 與 2-fluoro-N-butylphenylacet- amide (SCK6)。我們利用螢光染色法與 DNA 膠 體電泳法，分析 H6 與 SCK6 誘導 CH27 肺癌細胞生長抑制是否出現細胞凋 表面的接受器例如 Fas activated death domain (FADD)，或粒線體或刺激內質 網，誘發一系列的 caspase 活化使細胞走上凋亡之路 123,124,149
。在 H6 處理 CH27 肺癌細胞部分的數據顯示，處理的第 8 小時 caspase-9 的活性有顯著 的增加且持續上升到第 48 小時，另外，也觀察到細胞質內 cytochrome c 的 漸增式累積，細胞質內 cytochrome c 的累積與 caspase-9 的活化同時產生，
接著又觀察到 procaspase-3 解離成活化態的 caspase-3， caspase-3 活化後即 造成 PARP 斷片的產生。若以廣效性 caspase 抑制劑 z-VAD-fmk 處理後，並 不會影響到 H6 誘導產生細胞質內 cytochrome c 累積，但卻能顯著的抑制 caspase-3-like 活性以及減弱細胞的凋亡現象。所以 H6 誘導細胞凋亡過程的 機制是與粒腺體及其下游 caspase 相關。這些現象附合之前的文獻報告，
caspase 抑制劑 z-VAD-fmk 在 Xenopus egg extracts 中能阻斷細胞的凋亡，不 會影響到 cytochrome c 轉位到細胞質 140。另外，我們亦檢測經 H6 處理後 肺癌細胞 Fas/FasL 並無任何變化(結果未顯示)，顯示 H6 誘導細胞的凋亡並
非經由 Fas 路徑之活化，而是透過粒線體路徑造成 caspases 的活化，進而引 發細胞的凋亡。綜合以上研究的結果可得知由 H6 引起之細胞凋亡的執行，
粒腺體 cytochrome c 釋出至細胞質造成 caspase-9 的活化是發生在 caspase-3 活化之前的。因此，cytochrome c 及 caspase-9 的活化是上游調控分子。
經 H6處理的細胞到底是如何造成細胞質內 cytochrome c累積與 caspase 活化，是一大問題。在關於粒腺體完整性與粒腺體膜電位文獻報告中指出 Bcl-2 家族蛋白質在粒腺體完整性的控制中扮演一重要的角色， Bcl-2 家族 蛋白質的變化會造成粒腺體失去膜電位，而使粒腺體膜內的蛋白質如 cytochrome c 和 apoptosis-inducing factor 釋放至細胞質而誘導細胞的凋亡
155。在 Bcl-2 家族基因中 Bcl-X 是調控細胞凋亡的重要分子之一 156,157。 bcl-X 基因在轉錄剪輯(splicing)時形成兩個異構形：較長類型 Bcl-XL，作用 與 Bcl-2 類似具抑制細胞死亡的功能；另一為短的類型 Bcl-Xs，其作用能抑 制 Bcl-2 的功能促使細胞凋亡 158。之前研究報告提出即使在高濃度的 Bcl-2 與 Bcl-XL下 Bcl-Xs 仍具有明顯條控細胞死亡的功能 156,157。其他研究指出 Bcl-Xs 具阻斷 Bcl-2 與 Bcl-XL保護細胞的能力 158，而且 Bcl-Xs 過量表現會 誘導乳癌細胞的凋亡 159。而最近的報告指出 Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-Xs 與 Bax 皆位於粒腺體外膜 129,158,160-162
調控著粒腺體內 cytochrome c 的釋放。這些 已發表的文獻論述可以解釋 H6 處理 CH27 細胞後的反應。當 H6 處理 CH27 細胞後造成 Bcl-Xs 蛋白質表現量增加而使得粒腺體膜的通透性改變，促進 了 cytochrome c 的釋出，接著引發粒腺體下游分子 caspase 斷裂活化而啟動 了細胞的凋亡。
在 SCK6 處理 CH27 肺癌細胞部分的數據顯示，SCK6 會造成 CH27 肺 癌細胞生長抑制，細胞週期停止與誘導細胞的凋亡。先前的文獻指出苯乙
制可不經由 p53 的路徑造成 p21CIP1/WAF1蛋白表現增加 24，在本試驗中，以 SCK6 處理 CH27 肺癌細胞中明顯的觀察到 p53 蛋白質表現的增加，且伴隨 著 p21CIP1/WAF1蛋白質表現也上升。在控制真核細胞週期中，cycline-dependent kinases (Cdks)是重要成員，Cdks 是屬於 serine/theronine 蛋白質的家族 163， 而 Cdks 的活性可受到 p21CIP1/WAF1蛋白質調控。在 SCK6 處理 CH27 肺癌細 胞中積聚的 p21CIP1/WAF1蛋白質可能結合到 Cdk2，Cdk4 與 Cdk6 抑制這些 Cdks 的激? 活性，阻止細胞由 G1 期進入 S 期，因此而造成細胞生長停止。
此外，在本研究中也顯示以 SCK6 處理後會明顯降低 Cdk2，Cdk4 與 cyclin A，cyclin D3 與 cyclin E 蛋白質的表現。Agami 與 Bernards 在 2002 年發表 的論文中提出在 G1 期的中期，Cdk4 與 Cdk6 和 D-type cyclin 結合而被活 化，在 G1 期的晚期 Cdk2 與 cyclin E 結合，而 Cdk2-cyclin E 的活性控制著 細胞週期由 G1 期進入 S 期 80,82。因此，在 SCK6 處理的細胞中，與 G1 期 有聯繫的 Cdks 和 cyclins 濃度的減低，也會導致細胞週期被阻斷在 G1 期的 中期和 G1/S 的檢查點(checkpoint)。以上我們觀察到之現象與 Bartkova 等學 者在 1997 年提出的論點是相符合的 164。
增加，進而調降 Bcl-2 蛋白質之表現，造成細胞的凋亡。之前有文獻指出 p53 蛋白質能調節 Bax 蛋白質使其表現量增加 166，但在 SCK6 處理後 Bax 蛋白質表現並沒有改變。
之前文獻報告提出 caspase 的活化有兩種典型的路徑：其一為死亡接受 器與轉接分子 Fas activated death domain 接合，接著與 caspase-8 的前驅物結 合並活化 caspase-8；其二為透過粒腺體內 cytochrome c 釋放的路徑 122,123。 本實驗結果顯示，以 SCK6 處理 CH27 肺癌細胞造成 caspase 活化歸因於粒 腺體釋放 cytochrome c 使細胞質內 cytochrome c 累積，接著與 Apaf-1 蛋白 結 合 而 活 化 了 caspase-9， caspase-9 的活化會啟動下游的 caspases 如 caspase-3 與 caspase-7 的活化，此結果顯示於圖十五 A 與 B。本研究發現，
SCK6 能降低 Bcl-2 與 Bcl-XL蛋白質表現量，使細胞質內 cytochrome c 積聚 增加隨後造成 caspase-9 與 caspase-3 的活化，同時伴隨著下游受質 PARP 的 分解斷裂。在細胞中 Bcl-2 蛋白質的過量表現或以 caspase 抑制劑的處理細 胞都能顯著的阻斷 SCK6 誘導 CH27 肺癌細胞的凋亡。