第三章 結 果
第一節 4- Fluoro-N-butylphenylacetamides (H6)對人類鱗狀上皮 肺癌細胞 CH27 的生物活性
一 、 4- Fluoro-N-butylphenylacetamide (H6)可誘導人類鱗狀上皮肺癌細胞 CH27 凋 亡
為了確定 H6 誘導細胞死亡的表現特徵，我們利用能與 DNA 結合的螢 光染劑－DAPI 與 TUNEL，將細胞染色以觀察細胞核的形態，CH27 肺癌細 胞以 H6 處理後，出現典型的凋亡細胞核形態結構的變化，即細胞核的濃 縮與細胞核形成碎片，在控制組與苯乙酸鹽處理組其細胞核染色體均勻分 布並無碎片形成(圖七 A) ，更進一步確定 H6 是誘導細胞的凋亡，故以 TUNEL 及 DNA 斷裂檢測法分析之，DNA 碎片能被 TUNEL 螢光染劑標定 出來，結果如圖七 A。此外我們抽取處理組與控制組細胞的 DNA 經膠體電 泳分析，結果發現 H6 處理後的 DNA 呈現階梯狀(DNA ladder)斷裂片段，
而控制組及苯乙酸處理組 DNA 完整沒有段片出現 (圖七 B)。因此我們認為 CH27 肺癌細胞經 H6 處理後能明顯誘導細胞進行凋亡。
二 、 H6 誘 導 細 胞 凋 亡 與 Bcl-Xs 蛋 白 相 關
之前有文獻提出 Bcl-2 家族蛋白中 Bcl-2 與 Bcl-XL蛋白能抑制細胞進 行凋亡，相反的 Bax，Bad 與 Bcl-XS蛋白卻會促進細胞進行凋亡 146。為了 探討 H6 誘導 CH27 肺癌細胞凋亡是否與 Bcl-2 家族蛋白的表現程度相關，
我們偵測肺癌細胞中 Bcl-2，Bcl-XL，Bax，Bad 與 Bcl-XS蛋白的表現是否 被 H6 調節。由圖八的結果顯示 CH27 肺癌細胞暴露在 2 mM H6 下，造成 Bcl-XS蛋白表現量明顯增加，然而 Bcl-2，Bcl-XL，Bax 與 Bad 卻不受影響。
三、於 H6 誘導細胞凋亡中會造成細胞質 cytochrome c 的累積，caspase-3 的 活 化 與 PARP 的 斷 裂
最近與細胞凋亡的相關文獻指出，細胞在進行凋亡的時候會造成 cytochrome c 由粒腺體釋放到細胞質，細胞質內的 cytochrome c 便與 Apaf-1 結合緊接著活化 caspase-9，造成 caspase-3 的活化，具活性的 caspase-3 會 將下游的受質－PARP 分解成兩個片段 147 - 149。探討 H6 處理細胞後是否會 活 化 此 路 徑 ， 我 們 採 用 西 方 轉 漬 分 析 法 (Western blot analysis) 以 anti-cytochrome c, anti-PARP 與 anti-caspase-3 三種抗體偵測細胞質內的 cytochrome c，PARP 與 caspase-3 是否會活化。從圖九的結果顯示 CH27 肺 癌細胞經 H6 處理後，cytochrome c 會由粒腺體釋放到細胞質且隨著處理時 間的增加細胞質內的 cytochrome c 累積得愈多。cytochrome c 隨著時間增加 的同時伴隨著 caspase-3 蛋白水解而活化與 PARP 的斷裂，這些結果明顯指 出 H6 能誘導粒腺體內的 cytochrome c 釋放到細胞質，同時伴隨著 caspase-3 的活化與下游受質的分解斷裂。
四 、 H6 誘 導 細 胞 凋 亡 與 caspase 活 化 的 相 關 性
先前文獻提出 caspase 的活化在細胞凋亡的過程中扮演一個非常重要 的角色 150，因此要判定 H6 引起的細胞凋亡能否誘導 caspase 活化，使活 化的 caspase當成下游的激活劑(effectors)，我們利用四種具螢光性的 caspase 受質去偵測特定的 caspase 活性。結果顯示於圖十，CH27 肺癌細胞經 H6 處理 8 小時後 caspase-9 的活性開始上升，而 caspase-3 在處理 24 與 48 小 時後，其活性亦有明顯增加之趨勢， caspase-8 則在處理第 48 小時，活性 有輕微的增加，但是 caspase-1 的活性卻無明顯變化。此外將 CH27 肺癌細
胞先與一廣效性 caspase 抑制劑－z-VAD-fmk 共同培養後，再以 H6 處理之，
結果無法防止 H6 引起的細胞質 cytochrome c 的累積 (圖十一 A)；但卻能 明顯的抑制由 H6 引起的 caspase-3 活化與細胞凋亡(圖十一 B)。
第二節 2-Fluoro-N-butylphenylacetamides (SCK6)對人類鱗狀上