在本論文密度實驗中結果顯示,三個密度處理組別之間沒有顯著差異,在沒 有對水體及卵做任何的消毒情形下,實驗操作時,密度越高卵越容易受到真菌感 染,而變成整團的卵黏結,使卵的缺氧而死亡,或容易受到水黴菌的感染。因此,
需要不斷的注意觀察並且隨時挑掉死卵,否則死卵容易阻塞住進水口,造成整批 卵大量受到水黴菌感染或是缺氧死亡,而低密度的組別則風險較低,密度低可以 減少卵的彼此接觸的機會,降低藉由水黴菌絲的直接接觸傳染,結果與Celada 等 及Henryon and Purvis 研究結果相似,在不同淡水螯蝦卵的人工孵化上,於沒有消 毒的情形下,降低密度可有效提升整體孵化率(Celada et al., 2004; Henryon and Purvis, 2003)。相關研究報告指出,如果在後續的實驗中加入以臭氧的處理方式,
達到抑制水體中水黴菌或其他細菌的增長繁殖情形下,可望將孵化密度有效提 高,並增加後期之孵化率及活存率(Celada et al., 2004)。有報告探討人工孵化密度 條件及消毒方式,比較二組不同密度(2.2、6.6 eggs/cm2)及有無使用甲醛處理
(1500、4500 ppm)對孵化的影響。實驗結果顯示,相較於 Control 組沒有做消毒 處理的情形下,密度高的處理組,其孵化率僅22.6%,而在使用甲醛(4500 ppm)處 理的二個密度組別(2.2、6.6 eggs/cm2)孵化率則無顯著差異(61→64.3%)(Celada et al., 2004)。Saez-Royuela 等的實驗結果中顯示,通訊螯蝦(Pacifastacus leniusculus) 的人工孵化過程中,使用甲醛對卵進行消毒處理,並且探討降低水流及提高密度 對整體孵化率的影響,成功的將密度提高達5.5 倍( 7.6→42 eggs/cm2 ),最後第二 期幼苗孵化率達到86.1% (Saez-Royuela et al., 2009)。
不同孵化密度並不會影響胚胎的孵化時間以及蝦苗的重量,只有第二期幼苗 活存率有差異,低密度組別(0.35、0.70 eggs/ml)於第二期幼苗的平均活存率略高 於高密度(2.80 eggs/ml)組別 5.7→5.8%(Henryon and Purvis, 2003)。由本實驗結 果顯示,第二、三期幼苗殘食造成的死亡率增加在本實驗中亦有觀察到。(Stage II 的活存率D 40:65%、D 80:59%、D 120:55%;Stage III 的活存率 D 40:51%、
D 80:46%、D 120:49%)低密度的組別 D 40 的第二、三期幼苗活存率普遍高於 另外中密度及高密度二組5-10%,不過在統計上並沒有顯著差異(圖五)。
以往淡水螯蝦的報告中,人工孵化都只是持續紀錄觀察到第二期幼苗,但是 在本論文所有的實驗都是持續記錄到第三期幼苗,雖然從第二期發育到第三期幼 苗會因為殘食造成數量上的折損,但是在整體操作過程上,第二期幼苗因為尾扇 尚未完全發育完成,個體移動能力不佳,所以不管是人工孵化或是自然孵化的情 況,都會造成群體互抱成球狀,此狀態下,要詳細計算數量及存活率非常不易,
需使用鑷子將幼苗一隻ㄧ隻剝離,極易造成幼苗受到機械性傷害,而且耗費時間 與人力,而本實驗中觀察發現,幼苗在孵化單元內發育到第三期幼苗時,個體會 互相分開隨著水流漂動。因此,較易計算數量且不會造成幼苗的機械性傷害。
根據以上文獻的結果,卵的孵化密度,並非人工孵化過程中最為主要的影響 因子,實際上在自然孵化的情形下,母蝦泳足上的卵量非常高(不同物種差異大,
可以達到20→2000 顆),其密度遠大於人工孵化所使用之密度。雖然會因為物種 或是成熟度不同而有差異,孵化率的好壞與母蝦所提供的卵黃囊營養,亦即卵的 內生性營養物質及母蝦護卵行為有關。而人工孵化所要探討的重點,是如何營造 最適當的孵化環境條件。因此,真正與人工孵化的密度因子有影響的相關條件,
取決於孵化單元的空間限制、設備是否穩定供給水流量以及孵化設備的水質因子 的掌控(氨氮、亞硝酸鹽類、溶氧、疾病等)有關。
在適當的消毒處理下,可降低或避免水黴菌的感染(Henryon and Purvis, 2003;
Celada et al., 2004; Saez-Royuela et al., 2009),而在本文後續人工孵化與自然孵化的 實驗中,人工孵化的處理組將密度提高為100 顆/管,每日使用甲醛或是臭氧消毒,
此實驗對照密度實驗的結果,在第三期幼苗活存率有明顯提高的效果(圖五、十 一)。因此,在適當消毒下,即使提高孵化密度,並不會影響最後的孵化活存率。
在未來後續的研究上,於進行消毒處理的情形下可嘗試將卵的密度提昇,以減少 器材及空間上的成本。
溫度是決定水生變溫動物胚胎發展與活存率的關鍵因子,胚胎發育是個複雜 且精密的過程,細胞的分化與增殖是同時而不同速率的進行著,溫度亦會影響幼 苗的尺寸、成長與存活、卵黃囊的吸收、能量保存與轉換效率等(Gracia-Lopez et al., 2004)。因此,要達到成功的孵化操作與生產蝦苗,瞭解受精卵孵化對於溫度的容 忍性與最適合的範圍是必要的。調控水體溫度的高低為人工孵化技術的優點之 ㄧ,人工孵化時可藉由調控環境溫度來達到控制胚胎發育時間的長短(Celada et al., 2001a; Celada et al., 2001b; Perez et al., 2003)。實驗處理的水溫設定基準為,在平常 蓄養繁殖的觀察中,溫度於20-30℃時皆有母蝦抱卵之情形,但適當的孵化溫度則 沒有文獻記載,因此希望藉由本實驗得到此蝦種最適當孵化溫度。於本論文中不 同孵化溫度實驗結果發現,溫度升高可以縮短孵化時間並提升生產的速率,不過 卻常常造成孵化率偏低,實驗結果顯示20℃的處理組其幼苗的三個時期(Stage I
→III),幼苗之平均活存率皆顯著高於 24℃及 28℃的組別;24℃及 28℃二組之間 則沒有顯著差異(圖六)。另外,發現同樣的處理不同重複組的數據上,24℃及 28℃的平均活存率的標準差明顯大於 20℃的處理組別,顯示 20℃的溫度處理下,
胚胎可以穩定的發育孵化,環境的其它變因影響較小,不像24℃及 28℃處理組不 同重複組之間的活存率高低起伏大,造成標準差數值偏高。
在魚類孵化與淡水螯蝦的報告中提到,在不同物種容忍的適當需求溫度範圍 內,提高溫度可有效的縮短孵化時間,一般來說孵化溫度與胚胎發育的時間呈現 反比的關係式(Blaxter, 1992; Henryon and Purvis, 2003)。而在本實驗結果觀察到相 同的趨勢,平均孵化時間上,20℃的組別需要 23 天才能達到 Stage III 幼苗,24℃
與28℃則分別為 18 天與 12.5 天即可達到 Stage III(圖七),胚胎發育達到 Stage III 幼苗的孵化時間,20℃組別(23 天)與 28℃組別(12.5 天)差異幾乎達二倍。在淡水螯 蝦 Astacus leptodactylus 的人工孵化報告中亦有類似的結果,將實驗溫度分為 11.8℃、16±1℃及 20±1℃三組,最後的活存率與孵化時間分別為 Group I(11.8℃):
22.4% & 120 天;Group II(16±1℃):46.9% & 92 天;Group III(20±1℃):
32.5 & 71 天)(Aydın and Dilek, 2004); Henryon and Purvis 亦指出淡水螯蝦 Cherax tenuimanus,以四組不同溫度 16℃、20℃、24℃及 28℃進行人工孵化實驗並比較 時間、活存率及各組幼苗體重上的差異,結果得到 16℃處理組的孵化時間幾乎是 28℃處理組的三倍,而 20℃與 24℃的處理組活存率最高,16℃的處理組所生產出 來的蝦苗平均體重最大,實驗結果也得到平均體重隨著溫度增高而降低的情形 (Henryon and Purvis, 2003)。在日本螯蝦 Cambaroides japonicus 的研究報告中,將 孵化溫度分為 5℃、10℃、15℃、20℃,結果得到 15℃有最佳的孵化率,另外三 組溫度組別胚胎則幾乎死亡(Nakata et al., 2004)。綜合這三篇報告與本實驗結果可 以驗證,不同蝦種的受精卵對溫度的容忍性不同,上述報告的蝦種適合的溫度與 本實驗生物適合的生物略有出入,不過溫度與胚胎發育的趨影響則有相似的趨 勢,當溫度升高時,胚胎發育的時間會縮短,但受精卵適合的溫度可能相當狹隘,
在不同物種的孵化上需要分別找出其適當的溫度。雖然在人工孵化時提升溫度可 以有效地縮短孵化時間,但高溫所造成的胚胎發育的速率提高只有在溫度的容忍 範圍限制內才會發生,過高的溫度會造成胚體的死亡(Ojanguren and Brana, 2003)。
如果只考慮活存率,根據本文溫度實驗結果顯示,實驗生物佛羅里達藍螯蝦卵的 孵化上,將胚胎發育時間拉長到 23 天而得到最佳的孵化率(Stage III:68%),
以活存率為主要考量上來說,20℃是最好孵化條件(圖七)。
受精卵在胚胎發育初期對於環境的變動極為敏感,尤其是水溫的改變(Henryon and Purvis, 2000)。除了水溫的震盪外,28℃處理組別孵化率偏低的原因,可能是 因為高溫導致胚胎發育時的重要的代謝機制被破壞而造成死亡(如:細胞分化、
卵膜蛋白質變性、蛋白質代謝、生化反應的平衡等相關因子)(Schmidt-Neilson, 1997)。有報告中指出,淡水長臂大蝦(Macrobrachium rosenbergii)的胚胎發育時 間及幼苗大小與溫度有線性的關係,25℃的條件下,孵化時間為 313 小時;29℃
的條件下,孵化時間為 289 小時;33℃的條件下,孵化時間為 240 小時,而在此 實驗中亦發現過高的溫度(36℃)造成胚胎發育早期的死亡。該作者推測可能是
溫度造成熱休克蛋白質(Heat Shock Proteins)的變性,熱休克蛋白質在溫度的影 響下對早期的胚胎發育產生各種生理刺激如細胞分化、荷爾蒙刺激等,作者也說 明此熱休克蛋白的機制在淡水長臂大蝦上並未完全的建立(Gething and Sambrook, 1992; Manush et al., 2006)。在本論文溫度實驗中,24℃與 28℃處理組孵化率偏低,
第三期幼苗的活存率僅 44.5→48%,推測可能原因為高溫或是溫度震盪所造成,
但是本實驗只有計算各期幼苗的活存率與各自的胚胎發育時間,沒有去檢測上述 相關的因子(如:細胞分化、卵膜蛋白質變性、蛋白質代謝、生化反應的平衡等 相關因子),無法得知這二個溫度對胚胎造成的真正影響,僅能得到孵化率跟時 間的結果。而上述這些相關報告的結果指出,卵的內生性質可能因為溫度而造成 改變,導致卵的死亡影響孵化活存率。在溫度實驗剛開始人工孵化初期,於 1-2 天內將水溫改變到設定的實驗溫度是否過於激烈而造成胚胎的死亡亦不得而知。
但是本實驗只有計算各期幼苗的活存率與各自的胚胎發育時間,沒有去檢測上述 相關的因子(如:細胞分化、卵膜蛋白質變性、蛋白質代謝、生化反應的平衡等 相關因子),無法得知這二個溫度對胚胎造成的真正影響,僅能得到孵化率跟時 間的結果。而上述這些相關報告的結果指出,卵的內生性質可能因為溫度而造成 改變,導致卵的死亡影響孵化活存率。在溫度實驗剛開始人工孵化初期,於 1-2 天內將水溫改變到設定的實驗溫度是否過於激烈而造成胚胎的死亡亦不得而知。