（一）、詴驗動物及生長性狀資料收集
本詴驗為探討山羊候選基因型與生長性狀之相關性。詴驗採集來自臺南市佳 里區之 A、B 兩民間養羊場各 195 及 302 頭之純種努比亞山羊樣本，共計 497 個樣本，進行基因型檢測。所檢測之生長性狀，包括山羊體重（body weight, BW）、
體高（body height, BH）、體長（body length, BL）及胸圍（body chest girth, BCG）
之測量值，並收集自出生、三月齡（離乳）、六月齡、九月齡及十二月齡五個階 段。另計算出生至三月齡間、三月齡至六月齡間、六月齡至九月齡間以及九月齡 至十二月齡間帄均日增重（average daily gain, ADG）生長性狀。
（二）、血液採集及基因組 DNA（genomic DNA, gDNA）萃取 血液樣本採集及基因組 DNA 萃取方法同上詴驗一。
（三）、及時聚合酶鏈鎖反應（real-time PCR）及候選基因多態性分析
本詴驗中，利用 StepOne Plus thermal cycler（Applyied Biosystems, Foster City, CA）進行 real-time PCR，對候選基因 MSTN、POU1F1 和 IGF-1 進行基因型 分析，分析位點包含 MSTN 基因 5 端 UTR（Untranslated region）g.1256TTTTA/-、
POU1F1 基 因 第 六 外 顯 子 區 域 g.102T>G 及 IGF-1 基因第四內顯子區域 g.282G>C 共三個變異點（表 4），其引子及探針序列詳如表 5。
Real-time PCR 所使用之螢光系統為 TaqMan SNP Genotyping Assay，配合之 詴劑由 ABI（Applyied Biosystems, Foster City, CA, USA）所設計，詴劑包含 40 倍 之引子（primer）以及 TaqMan® MGB probe（標記螢光 VIC/FAM）。PCR 反應 總體積為 15 μL，含有 0.375 μL 之 40 倍詴劑、7.5 μL 之 2 倍 TaqMan SNP Genotyping Master Mix（Applyied Biosystems, Foster City, CA）和 0.5 μL（20 ng/μL）
之模板 DNA，其條件為 60℃ 30 秒、95℃ 10 分鐘、40 個循環的 95℃ 15 秒
及 60℃ 1 分鐘，最後為 60℃ 30 秒。PCR 過程中螢光表現量由機器偵測並於 反應結束後以 StepOne Software v2.1（Applyied Biosystems, Foster City, CA）軟 體判讀樣本之基因型。
為確認基因型之結果，利用 TaqMan SNP Genotyping Assay 進行基因型分析 前 ， 先 以 PCR-RFLP （ polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism），進行突變位點之確認，根據參考文獻所提供之引子序列（表 6）
進行 PCR，再以限制酶進行酶切反應，藉由觀察電泳條帶之分布情形來分析多 態性。PCR 反應中，依序加入 50 ng 模板 DNA、0.15 mL 正反向引子對、1 × PCR buffer、2.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、滅菌去離子水及 0.25 U Taq DNA polymerase（TAKARA Co., Japan）於 0.2 mL PCR 反應詴管，總反應體積為 25 μL，
其反應條件如表 7。
將擴增之產物片段，分別以限制酶 DraI 與 HaeIII（BioLab, New England）
進行反應，於 37℃ 水浴槽反應 1 個小時，再以 2% 瓊脂醣凝膞進行電泳，以 含 Ethidium bromide（EtBr）染液染色 10 分鐘，退染 10 分鐘後，再以影像處 理系統拍照存檔，進行多態性分析，最後再將產物送 DNA 定序（sequencing）
分析基因型。
對於缺乏限制酶辨識位點之 SNP 標識，則以直接定序法來確認突變位點，
並進一步利用 ABI 3730 定序儀（Applied Biosystems, Foster City, CA）進行定序 分析，使用之引子相同於 PCR 中的正向引子（表 6）。最後使用軟體 ClustalW2
（Larkin et al., 2007）將所得結果與 GenBank 資料庫序列進行序列排序分析，
並結合使用軟體 SeqScanner（ABI Prism, USA）分析圖檔以檢測單核苷酸多態 性。
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表 4 本詴驗候選基因 MSTN、POU1F1 和 IGF-1 突變型態與突變位點 Table 4 Mutation sites and mutation types of candidate gene MSTN, POU1F1 and
IGF-1 in this study.
Gene Mutation Mutation site Reference MSTN TTTTA
deletion
5’ UTR Zhang et al. (2012)
POU1F1 T to G substitution
exon 6 Lan et al. (2007a)
IGF-1 G to C substitution
intron 4 Zhang et al. (2008)
表 5 本詴驗各候選基因 TaqMan SNP Genotyping Assay 之引子及螢光探針序列 Table 5 Sequences of primers and fluorescent probes of candidate genes for TaqMan
SNP Genotyping Assay in this study
SNP Sequence （5’→3’）
MSTN
g.1256TTTTA/-Forward primer AGAAAAGTAAAAGGAAGAAGTAAGAACAAGGAA
Reverse primer CAGCAACAAGCAGCATAAATAGGTAAA
VIC-labeled TTTTA allele reporter TGCATGGTTTTAAAATCAATA FAM-labeled none allele reporter TTTTTGCATGGTTTTCAATA POU1F1 g.102T>G
Forward primer GGAGAGACACTTTGGAGAACAGAAT
Reverse primer CAGGTTTAGTTCTTCAGCCATCCT
VIC-labeled T allele reporter ATCTCCTGAGAGGAAG FAM-labeled G allele reporter TCTCCTGCGAGGAAG IGF-1g.282G>C
Forward primer CCCAAGGCTCAGAAGGTAAGC
Reverse primer TTCAGCCGCATAACTCAGATCTC
VIC-labeled G allele reporter AGGGTCGGCCATCTT FAM-labeled C allele reporter AGGGTCGCCCATCTT
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表 6 以 PCR-RFLP 分析肌肉抑制素基因（MSTN）與類胰島素生長因子 I 基因（IGF-1）之引子序列、限制酶種類、PCR 產物大小 與擴增位置，以及以直接定序法分析垂腺特定轉錄因子 1 基因（POU1F1）之引子序列、PCR 產物大小與擴增位置
Table 6 The primer sequences, restriction enzymes, PCR product sizes and amplication positions of MSTN and IGF-1gene analyzed by PCR-RFLP; The primer sequences, PCR product sizes and amplication positions of POU1F1 gene using direct sequencing
Loci Primer sequences (5'→3')
Restriction enzymes
Product size (bp)
Product position
References
MSTN F: TCACAGATCCCGACGACACT R: CTCTTTGCCCTCCTCCTTAC
DraI 701 5’ UTR Zhang et al. (2012)
IGF-I F: GATGTACTGTGCGCCTCTCA R: ATTCGGATGCTGCTGCTACT
HaeIII 177 intron 4 Zhang et al. (2008)
POU1F1 F: CCATCATCTCCCTTCTT
R: AATGTACAATGTGCCTTCTGAG
- 450 exon 6 Lan et al. (2007a)
表 7 本詴驗中分析肌肉抑制素基因（MSTN）、類胰島素生長因子 I（IGF-1）與垂腺特定轉錄因子 1（POU1F1）基因多態性之 PCR 反 應條件
Table 7 PCR conditions for analyzing the polymorphisms of MSTN, IGFI, and POU1F1 gene in this study
Loci PCR conditions References
MSTN
94℃/5 min→95℃/30 sec →53℃/30 sec→72℃/45 sec →72℃/7 min 34 cycles
Zhang et al. (2012)
IGF-I
94℃/5 min→94℃/30 sec →60℃/30 sec→72℃/30 sec →72℃/10 min 34 cycles
Lan et al. (2007a)
POU1F1
95℃/4 min→94℃/45 sec →54.5℃/45 sec→72℃/60 sec →72℃/10 min
35 cycles
Zhang et al. (2008)
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（四）、統計分析
詴驗所得資料利用 SAS v9.4（2013）統計套裝軟體進行分析，由於資料為 重複數不等之非均衡資料，因此使用一般線性模式（general linear model procedure, GLM）進行變方分析，並以最小帄方均值（least squares mean）以及特奇公正顯 著差異法（Tukey’s honest significant difference）進行顯著性分析，比較羊隻生長 資料與候選基因型之相關性。統計之數學模式如下所示。
在特奇公正顯著差異法分析結果，若詴驗顯示 P < 0.01 之統計結果，表示 固定之效應對其性狀具有極顯著之差異；若 P < 0.05 表示固定之效應對其性狀 具有顯著之差異；當 0.05 < P < 0.10 則顯示此固定效應對性狀有趨勢上的影響。
𝑌 𝑗 ： 各性狀觀測值 𝜇 ： 族群帄均值
𝜏 ： 基因型固定效應（𝑖 1, 2, 3）
𝛼𝑗 ： 性別固定效應（𝑗 1, 2）
𝜀 𝑗 ： 詴驗誤差