調控 R-loop 的生理機制

在轉錄過程中，R-loop 的形成會對於基因組的正確度產生破壞， R-loop 的 形成在演化上來說是具有保守性的機制，因此不同物種間也產生了相對應保護基 因組的方法 (Li and Manley, 2006; Aguilera and Garcia-Muse, 2012)。常見的方法 有:(1)利用 RNase H 降解 DNA/RNA 雜合體上的 RNA (Cerritelli and Crouch, 2009)。(2)利用 RNA/DNA helicase，例如酵母菌中的 Sen1 或是人類同源蛋白 Senataxin，可以解開 DNA/RNA 雜合體結構(Mischo et al., 2011; Skourti-Stathaki et

al., 2011)，或是人類蛋白 DHX9 helicase 可以破壞 G4 結構 (Chakraborty and Grosse, 2011)。(3)利用 topoisomerase 鬆開 negative supercoiling 使得 R-loop 不易形成 (Drolet et al. 1994, 1995; Tuduri et al., 2009)。(4)防止 R-loop 形成的蛋白質。(5)抑 制幫助 R-loop 形成的蛋白質。前兩組可視為去除形成後的 R-loop，後三組則為 防止 R-loop 形成。

1.3.1 細胞中移除 R-loop 結構的方法

第一，RNase H 可以去除 DNA/RNA 雜合的中的 RNA，在大多數的物種裡，

有兩種 RNase H 存在，分別是 RNase H1 及 RNase H2 (Cerritelli and Crouch, 2009)。

RNase H1 出現在細胞核及粒線體中，對粒線體的複製很重要。過量表現細胞核 中的 RNase H1 可以有效去除 R-loop (Cerritelli et al., 2003)，是目前在實驗上被廣 泛應用方法。RNase H2 的功能則為去除 DNA 複製過程中的 RNA 引子 (Cerritelli

Steinmetz et al., 2006; Kawauchi et al., 2008)，Sen1, Nrd1 及 Nab3 組成 NRD 複合 體，負責 sno/snRNA 的終止反應 (termination) (Ursic et al. 1997; Steinmetz et al., 2001; Chinchilla et al., 2012)。

人類的 Senataxin 是 Sen1 在的同源蛋白質，與轉錄作用中的終止反應有關 (Skourti-Stathaki et al., 2011; Padmanabhan et al., 2012; Becherel et al., 2013)。越來 越多的證據指向 Senataxin 是一種 DNA 修復酵素 (Becherel et al., 2013)，以及用

來解開存在於 G-rich termination pause sites 的 R-loop。2013 年 Senataxin 被報導 hyperrecombination 性狀 (Piruat and Aguilera, 1998)。酵母菌中的扮演傳遞與處理 mRNA 的蛋白質 Npl3 也被發現可以預防 R-loop 所引起的基因不穩定，這也連結 了 RNA 的代謝與 R-loop 所引起的基因不穩定 (Santos-Pereira et al., 2013)。

DNA topoisomerase1 (TOP1) 具有抑制 R-loop 形成的功能，是演化上具有保 守性的因子 (El Hage et al., 2010)。抑制 R-loop 形成的可能原因為 TOP1 具有鬆 開 DNA 負超螺旋的能力，若缺乏 TOP1，則轉錄的過程中，負超螺旋的累積使 得 DNA 雙股螺旋打開，促進 RNA 與模板 DNA 重新配對而產生 R-loop (Drolet et al. 1995)。 2014 年發現，與 TPOI 同一家族的蛋白質, 拓樸異構酶 3B (TOP3B), 可以降低負超螺旋及 R-loop 的形成 (Yang et al., 2014)。TOP3B,與 methyl-arginine effector tudor domain-containing protein 3 (TDRD3) 產 生 交 互 作 用 可 辨 識 出 arginine methylation histone marks。目前提出的假說為 TDRD3-TOP3B 複合體會 被招喚至轉錄活躍的區域，TDRD3 辨識甲基化精胺酸組蛋白標誌區 (methyl-arginine histone marks) 使 Pol II 的 C-termanal domain (CTD)甲基化，而 TOP3B 解 開由 Pol II 所產生的負超螺旋，這與先前提到的 chromatin marks, H3S10P 擁有相

反的作用。

除了預防及解開 R-loop 的機制外，也存在著促進 R-loop 生成的機制。其中 一個是存在於 S. cerevisiae 中的 Rad51。真核生物的 Rad51 與細菌的 RecA 是同 源基因，在同源性重組扮演重要角色。2013 年研究發現缺乏 Rad51 的 S. cerevisiae 會降低 R-loop 的生成，以及後續由 R-loop 所帶來的基因不穩定 (Wahba at al.

造成遠離轉錄起始點的 trans R-loop 的生成，而 Rad51 可以幫助這些 trans r-loop 生成 (Wahba at al. 2013)。Trans 形式的 R-loop 相較於 cis R-loop 對於基因不穩定 性有更高的威脅，若轉錄作用發生在高度重複的的序列 (element)，cis R-loop 只 會出現在特定的區域，然而 trans R-loop 可能會出現在許多位置，而製造出許多 基因不穩定度高的熱點 (hot spot)。

Trans R-loop 近年來也應用在基因修補上，稱為 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9 系統，CRISPR-Cas9 原先是微生物用來 對抗嗜菌體，以及其他外來基因片段的免疫系統。外來的 DNA 小片段插進宿主 DNA 的 CRISPR 基因位點 (loci)，CRISPR 基因位點進行轉錄後， CRISPR RNA 進行 RNA 剪切產生成熟 (mature) 的 CRISPR RNA，其中有帶有 CRISPR 重複 序列的外來 RNA 序列會與 Cas9 酵素結合，而外來 RNA 序列辨認同外來基因位 置，產生了 trans R-loop，使外來基因靜默 (Terns and Terns, 2011)。