第四章、 材料與方法
三、 調查項目與分析方法
(一) 植物組織鮮重
不同時間點採收之試驗植物將之分為根與地上部，地上部直接以天平 (XS204, Mettler Toledo) 秤量各組織鮮重，根部則需先以紙巾吸乾多餘水分後再秤重。
(二) 葉綠素螢光計
待測植物葉片利用鋁箔紙包覆，黑暗馴化 30 分鐘後利用葉綠素螢光計 (Pocket PEA, Hansatch) 測量成熟展開葉之葉綠素螢光讀值。
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(五) GUS 定性分析
GUS 定性實驗步驟參考 Jefferson 等人的方法 (Jefferson RA, 1987) 再略作修 正 。 GUS 定 性 分 析 緩 衝 劑 配 方 略 作 修 正 如 下 ： 0.15 % X‐gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-Glucuronic Acid) 以 1.25 % DMSO (Dimethyl sulfoxide)溶解 X‐gluc 粉劑，加入目標體積一半的水後依序加入 100 mM Phosphate buffer、10 mM Na2EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dehydrate)、
0.5 mM K3Fe(CN)6 (Potassium Hexacyanoferrate III)、0.5 mM K4Fe(CN)6 (Potassium Hexacyanoferrate II)、0.1 % Triton X-1000 (Octyl Phenol Ethoxylate)、10 % Methanol，
最後利用去離子水 (Deionized water) 定量至目標體積。將植物葉片組織以刀片切
GUS 定量實驗步驟參考前人方法 (Jefferson RA, 1987; Spolaore et al., 2001)。
GUS 定量分析分為組織螢光值測定與蛋白質含量測定。利用天平秤取約 200 mg 上 述研磨後粉末，加入預冷過之 GUS extraction buffer 包含 0.1 M Potassium phosphate buffer、1 mM Na2EDTA、10 % Glycerol、7 mM ß-mercaptoethanol、0.1 % Triton X-100、
2 % Polyvinylpyrrolidone (cross linked)。樣本粉末與 GUS extraction buffer 混合均勻 後於 4 ℃下離心 (10,000 rpm) 15 分鐘，取上清液再次於 4 ℃下離心 (10,000 rpm) 15 分 鐘 ， 將 上 清 液 置 於 96 孔 黑 盤 (NUNC) ， 加 入 受 質 10mM MUG (4-methlyumbelliferyl-ß-D-glucuronide trihydrate)於 37 ℃下作用 0、10 及 20 分鐘後
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加入 0.2 M Na2CO3終止反應。以 4-MU (7-hydroxy-4-methylcoumarin) 作為標準品 繪製標準曲線。待測樣品以微量分光光度計 (i-control, Tecan) 於 excitation=355 nm、
emission=460 nm 條件下測定螢光值。
蛋白質含量測定方法則是將上述離心後樣本取4μl 之上清液置於 96 孔盤，再 加入 156 μL 之去離子水與 40 μL Protein assay dye reagent (Bio-Rad) 後，於 37 ℃ 下作用 30 分鐘，以微量光度計 (i-control, Tecan) 測定波長 595 nm 下之吸光值。
以 BSA (Bovine serum albumin) 當標準品繪製標準曲線。GUS 的濃度以(反應時間 內組織螢光差值/反應時間)/蛋白質含量公式計算。
(七) Luciferase 定量表現分析
螢 火 蟲 冷 光 蛋 白 (Luciferase) 定 量 分 析 以 Luciferase Assay System kit (Promega) 進行分析。實驗步驟參考 Promega 公司所附流程略做修改，方法為取 5 μL 上述溶於 GUS extraction buffer 且經離心後之樣本置入 96 孔白盤 (Microlon)，
加入 90 μL GUS extraction buffer，再加入 25 μL Luciferase Reagent，利用微量光度 計 (i-control, Tecan) 測定冷光下之吸光值。 PerkinElmer) 測定 535 nm、650 nm 波長下的吸光值。兩種吸光值之數值帶入下列 公式
[
A535-(2 A650)]
/鮮重，即可計算出花青素相對含量。27
(九) 可溶性固形物測定
‘Micro-Tom’番茄依照不同處理的時間點採收，每株採 6 顆果實，根據重量加 入一倍體積的去離子水，利用研缽研磨成泥，使用糖度計 (Pocket Refractometer PAL-1, Atago) 測得果實糖度，單位為 ∘Brix。
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表 1. 本試驗所用之水耕養液配方
Table 1. Hydroponic nutrient recipes in this research.
Stock no. Macronutrients Molecular weight Stock concentration (M) Final concentration (mM)
Ⅰ Ca(NO3)2．4H2O 236.15 1.00 2.50
KNO3 101.11 1.00 2.50
Ⅱ MgSO4．7H2O 246.48 1.00 1.00
Ⅲ NaFe EDTA 367.10 0.10 0.05
Ⅳ KH2PO4 136.09 1.00 0.50
Stock no. Micronutrients Molecular weight Stock concentration (mM) Final concentration (μM)
Ⅴ
H3BO3 61.83 10.00 10.00
Na2MoO4．2H2O 241.95 0.20 0.20
ZnSO4．7H2O 287.50 1.00 1.00
MnCl2．4H2O 197.90 2.00 2.00
CuSO4．5H2O 249.70 0.50 0.50
CoCl2．6H2O 237.90 0.20 0.20
HCl 36.46 25.00 25.00
Ⅵ MES 213.24 500.00 500.00
Modified from Millner and Kitt, 1992 and Hoagland and Arnon, 1950.
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表 2. 不同營養元素缺乏處理之水耕養液配方
Table 2. Hydroponic nutrient recipes for treatments of different nutrient deficiency.
Element Concentrations of individual elements in various treatments (mg/L)
Macronutrients Full -N -P -K -Ca -Mg -S -Fe
N 105.00
0.00
105.00 105.00 105.00 105.00 105.00 105.00P 15.50 15.50
0.00
15.50 15.50 15.50 15.50 15.50K 117.00 117.00 117.00
0.00
117.00 117.00 117.00 117.00 Ca 100.00 100.00 100.00150.00 0.00 150.40
100.00 100.00 Mg 24.00 24.00 24.00 24.00 24.000.00
24.00 24.00S 32.05 32.05 32.05 32.05 32.05
72.37 0.00
32.05Micronutrients Full -N -P -K -Ca -Mg -S -Fe
Fe 2.80 2.80 2.80 2.80 2.80 2.80 0.10
0.00
Cl 1.04
267.29 18.79
1.04 1.04 1.0472.04
1.04Mn 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.17 0.00 0.17
B 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.03 0.11
Zn 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.07 0.00 0.07
Cu 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.00 0.03
Mo 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.00 0.03
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圖 1. 水耕番茄栽培期間之溫室氣象資料
Figure 1. The meteorological data in greenhouse during hydroponic culture of tomato.
圖 2. 番茄、青椒、辣椒與茄子栽培期間之溫室氣象資料
Figure 2. The meteorological data in greenhouse during soil culture of tomato, bell pepper, hot pepper and eggplant.
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圖 3. (a) TPSI1 promoter: GUS (b) 35S promoter: GUS (c) 35S promoter: Luc 之載體構 築
Figure 3. Maps of (a) TPSI1 promoter: GUS, (b) 35S promoter: GUS and (c) 35S promoter: Luc constructs.
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圖 4. 菸草缺磷處理與農桿菌滲入法時間
Figure 4. Time frames of Pi starvation treatments and agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.
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圖 5. 菸草不同營養元素缺乏處理與農桿菌滲入法時間
Figure 5. Time frames of different nutrient deficiency and agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.
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圖 6. 番茄缺磷處理與農桿菌注射法時間
Figure 6. Time frames of Pi starvation treatments and agroinjection in tomato.
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